本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
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海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)又稱巧花兜蘭，分布于我國廣西西部和越南北部，觀賞價值高。由于其生境的破壞和人工的過度采挖，其野生植物數(shù)量已極為稀少，被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)列入附錄I而禁止交易，也被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄中列為極危物種(CR)亟待保護，在中國也已被中國國家林業(yè)局列為極小種群野生植物需要重點保護。進行海倫兜蘭的資源保護，繁殖足夠多的種苗是關(guān)鍵。海倫兜蘭的常規(guī)繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低。無菌播種和組織培養(yǎng)能進行其快速繁殖，但無菌播種材料受季節(jié)性限制。而兜蘭在組織培養(yǎng)時，由于外植體去污難、易褐化及增殖速度慢等原因，其組織培養(yǎng)難度極大。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，從而進行海倫兜蘭的規(guī)模化繁殖。
本發(fā)明的海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：
a、愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖：取海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)的分蘗芽，切除葉片后進行消毒處理，將其切成帶一個節(jié)的莖段，得到消毒后的外植體，然后將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，獲得愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，愈傷組織大量增殖；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；
所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；
b、類原球莖的誘導(dǎo)和增殖：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，獲得類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，類原球莖大量增殖；所述的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激動素1.0～5.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；
c、類原球莖的分化：將類原球莖接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，類原球莖分化出不定芽，所述的分化培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；
d、生根壯苗培養(yǎng)：將不定芽切成單芽后轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照時間12～16小時/天，獲得完整植株，所述的生根壯苗培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氫鈉150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉勻漿50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖15～30克、瓊脂6～7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8-6.0；
e、試管苗移栽：將完整植株在自然光下煉苗10～15天，然后取出植株洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到植金石、松樹皮和泥炭土按質(zhì)量比2～3:2～3:1混合的栽培基質(zhì)中培養(yǎng)獲得海倫兜蘭種苗。
所述的分蘗芽優(yōu)選為莖節(jié)拉長的分蘗芽。
所述的莖節(jié)拉長的分蘗芽是通過以下方法獲得的：選擇剛冒出分蘗芽的植株生長勢強的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)為母株，對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500～800倍稀釋水溶液并用其澆透基質(zhì)，稍干后放入光照人工氣候箱中進行暗/光交替培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃～30℃，濕度75％～90％，光照度2000～3000勒克斯(lux)；培養(yǎng)過程中每3天澆一次水，每15天對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500～700倍稀釋水溶液或72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000～4000倍稀釋水溶液一次，35％尅土菌可濕性粉劑的500～700倍稀釋水溶液和72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000～4000倍稀釋水溶液交替使用，獲得3～4厘米長，具有3～4個節(jié)的分蘗芽，得到莖節(jié)拉長的分蘗芽。
優(yōu)選，所述的暗/光交替培養(yǎng)具體為暗培養(yǎng)14～14.5天后光培養(yǎng)12～24小時，連續(xù)交替培養(yǎng)，每個周期15天。
步驟a所述的消毒處理具體為：在超凈工作臺上將切除葉片的分蘗芽用體積分數(shù)75％酒精浸泡10～30秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5～10分鐘，無菌水沖洗4～5次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1％升汞溶液消毒5～10分鐘，無菌水沖洗4～5次。
MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成分和配制方法參看文獻(譚文澄、戴策剛主編.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù).北京：中國林業(yè)出版社，1991.)；1/2MS培養(yǎng)基是指將MS培養(yǎng)基中大量元素用量為原來的1/2，其余成份不變。所述的1/2MS培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，不含有瓊脂。
本發(fā)明通過獲得莖節(jié)拉長的分蘗芽及消毒處理可以使消毒成功率為70％～80％，從而有效的解決了外植體去污難的難題。
本發(fā)明公開了一種海倫兜蘭愈傷組織再生體系快速繁殖方法。本發(fā)明在對剛冒出分蘗芽的海倫兜蘭進行一系列藥劑處理及培養(yǎng)獲得莖節(jié)拉長的分蘗芽，以分蘗芽的莖節(jié)為外植體，采用獨特的培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖、類原球莖的誘導(dǎo)和增殖、類原球莖的分化和生根壯苗培養(yǎng)獲得優(yōu)質(zhì)種苗的愈傷組織再生體系快速繁殖方法，能生產(chǎn)出大量的種苗供應(yīng)市場并應(yīng)用于遷地保護和自然回歸，有利于海倫兜蘭的資源保護和可持續(xù)利用。
具體實施方式：
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1：
(1)外植體的獲得和處理
選擇剛冒出分蘗芽的植株生長勢強的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)為母株，在進入人工氣候箱培養(yǎng)前對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500倍稀釋水溶液并用其澆透基質(zhì)，稍干后放入光照人工氣候箱，在花盆底部墊水盤防止水漏入光照人工氣候箱。在光照人工氣候箱中進行暗/光交替培養(yǎng)使分蘗芽的莖節(jié)拉長，具體時間模式為先暗培養(yǎng)14天后光培養(yǎng)24小時，持續(xù)交替培養(yǎng)90天，每個周期15天，共進行6個周期。培養(yǎng)過程中每3天澆一次水，每15天對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的500倍稀釋水溶液或72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000倍稀釋水溶液一次，35％尅土菌可濕性粉劑的500倍稀釋水溶液和72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3000倍稀釋水溶液交替使用。培養(yǎng)溫度25℃，濕度75％，光照度2000勒克斯(lux)。經(jīng)過90天的培養(yǎng)后，海倫兜蘭分蘗芽4厘米長，具有4個節(jié)。
(2)外植體消毒
將具有4個節(jié)的分蘗芽切除葉片，在超凈工作臺上用體積分數(shù)75％酒精浸泡10秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡10分鐘，無菌水沖洗5次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1％升汞溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5次。然后將其切成帶一個節(jié)的莖段，得到消毒后的外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)10.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)200毫克、蔗糖30克、瓊脂6克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8，其配制方法是將10.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、1.0毫克噻重氮苯基脲、200毫克磷酸二氫鈉、30克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。消毒成功率80％。
(3)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖
外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個月能形成愈傷組織。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，繼代周期2個月，增殖率3倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)10.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、蔗糖30克、瓊脂6克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8，其配制方法是將10.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、1.0毫克噻重氮苯基脲、200毫克磷酸二氫鈉、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、30克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(4)類原球莖的誘導(dǎo)和增殖
將愈傷組織轉(zhuǎn)移到類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，2個月能誘導(dǎo)出類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，繼代周期2個月，增殖率3倍。所述的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、激動素(KT)5.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、蔗糖30克、瓊脂6克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8，其配制方法是將0.5毫克噻重氮苯基脲、5.0毫克激動素、200毫克磷酸二氫鈉、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、30克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(5)類原球莖的分化
將類原球莖接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，1個月能分化出不定芽，所述的分化培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)2.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、活性炭(AC)2.0克、蔗糖30克、瓊脂6克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8，其配制方法是將2.0毫克萘乙酸、200毫克磷酸二氫鈉、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、2.0克活性炭、30克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(6)生根壯苗培養(yǎng)
將1厘米不定芽切成單芽后轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照時間12小時/天，3個月能形成3厘米高的完整植株，所述的生根壯苗培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉勻漿50克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖15克、瓊脂6克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.8，其配制方法是將1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氫鈉、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉勻漿、1.0克活性炭、15克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(7)試管苗移栽
將具3厘米高完整植株從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗15天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆種10株。栽培基質(zhì)為植金石(日本進口)、松樹皮和泥炭土(以色列進口)按質(zhì)量比3:2:1混合均勻。保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達90％以上。一年后要以3株種植為1盆。松樹皮需用沸水煮30分鐘后用自來水浸泡24小時后再用自來水沖洗5次再使用，植金石需用自來水沖洗后再使用。
實施例2：
(1)外植體的獲得和處理
選擇剛冒出分蘗芽的植株生長勢強的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)為母株，在進入人工氣候箱培養(yǎng)前對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的600倍稀釋水溶液并用其澆透基質(zhì)，稍干后放入光照人工氣候箱，在花盆底部墊水盤防止水漏入光照人工氣候箱。在光照人工氣候箱中進行暗/光交替培養(yǎng)使分蘗芽的莖節(jié)拉長，具體時間模式為先暗培養(yǎng)14天12小時后光培養(yǎng)12小時，持續(xù)交替培養(yǎng)90天，每個周期15天，共進行6個周期。培養(yǎng)過程中每3天澆一次水，每15天對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的600倍稀釋水溶液或72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3500倍稀釋水溶液一次，35％尅土菌可濕性粉劑的600倍稀釋水溶液和72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的3500倍稀釋水溶液交替使用。培養(yǎng)溫度28℃，濕度80％，光照度2500勒克斯(lux)。經(jīng)過90天的培養(yǎng)后，海倫兜蘭分蘗芽3.5厘米長，平均具有3.5個節(jié)。
(2)外植體消毒
將具有3～4個節(jié)的分蘗芽切除葉片，在超凈工作臺上用體積分數(shù)75％酒精浸泡20秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡8分鐘，無菌水沖洗5次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1％升汞溶液消毒8分鐘，無菌水沖洗5次。然后將其切成帶一個節(jié)的莖段，得到消毒后的外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)5.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)180毫克、蔗糖30克、瓊脂6.5克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.9，其配制方法是將5.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.5毫克噻重氮苯基脲、180毫克磷酸二氫鈉、30克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。消毒成功率75％。
(3)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖
外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)75天左右能形成愈傷組織。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，繼代周期75天，增殖率2.5倍。
所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)5.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)180毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、蔗糖30克、瓊脂6.5克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.9，其配制方法是將5.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.5毫克噻重氮苯基脲、180毫克磷酸二氫鈉、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、30克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(4)類原球莖的誘導(dǎo)和增殖
將愈傷組織轉(zhuǎn)移到類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，75天能誘導(dǎo)出類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，繼代周期75天，增殖率2.5倍。
所述的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.3毫克、激動素(KT)3.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)180毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、蔗糖30克、瓊脂6.5克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.9，其配制方法是將0.3毫克噻重氮苯基脲、3.0毫克激動素、180毫克磷酸二氫鈉、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、30克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(5)類原球莖的分化
將類原球莖接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，45天能分化出不定芽，所述的分化培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)1.5毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)180毫克、椰子汁180毫升、蛋白胨1.5克、活性炭(AC)1.5克、蔗糖30克、瓊脂6.5克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.9，其配制方法是將1.5毫克萘乙酸、180毫克磷酸二氫鈉、180毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、1.5克活性炭、30克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(6)生根壯苗培養(yǎng)
將1.5厘米不定芽切成單芽后轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照時間14小時/天，75天能形成4厘米高的完整植株，所述的生根壯苗培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)1.5毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)180毫克、椰子汁180毫升、蛋白胨1.5克、香蕉勻漿100克、活性炭1.5克、蔗糖20克、瓊脂6.5克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.9，其配制方法是將1.5毫克萘乙酸、180毫克磷酸二氫鈉、180毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、100克香蕉勻漿、1.5克活性炭、20克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(7)試管苗移栽
將具4厘米高完整植株從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗12天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆種9株。栽培基質(zhì)為植金石(日本進口)、松樹皮和泥炭土(以色列進口)按質(zhì)量比2:2:1混合均勻。保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達90％以上。一年后要以3株種植為1盆。松樹皮需用沸水煮45分鐘后用自來水浸泡36小時后再用自來水沖洗4次再使用，植金石需用自來水沖洗后再使用。
實施例3:
(1)外植體的獲得和處理
選擇剛冒出分蘗芽的植株生長勢強的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)為母株，在進入人工氣候箱培養(yǎng)前對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的800倍稀釋水溶液并用其澆透基質(zhì)，稍干后放入光照人工氣候箱，在花盆底部墊水盤防止水漏入光照人工氣候箱。在光照人工氣候箱中進行暗/光交替培養(yǎng)使分蘗芽的莖節(jié)拉長，具體時間模式為先暗培養(yǎng)14天6小時后光培養(yǎng)18小時，持續(xù)交替培養(yǎng)90天，每個周期15天，共進行6個周期。培養(yǎng)過程中每3天澆一次水，每15天對葉面噴施35％尅土菌可濕性粉劑的700倍稀釋水溶液或72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的4000倍稀釋水溶液一次，35％尅土菌可濕性粉劑的700倍稀釋水溶液和72％農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑的4000倍稀釋水溶液交替使用。培養(yǎng)溫度30℃，濕度90％，光照度3000勒克斯(lux)。經(jīng)過90天的培養(yǎng)后，海倫兜蘭分蘗芽3厘米長，具有3個節(jié)。
(2)外植體消毒
將具有3個節(jié)的分蘗芽切除葉片，在超凈工作臺上用體積分數(shù)75％酒精浸泡10秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5分鐘，無菌水沖洗4次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1％升汞溶液消毒5分鐘，無菌水沖洗4次。然后將其切成帶一個節(jié)的莖段，得到消毒后的外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 6.0，其配制方法是將1.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.1毫克噻重氮苯基脲、150毫克磷酸二氫鈉、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。消毒成功率70％。
(3)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖
外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月能形成愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，繼代周期3個月，增殖率2倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH6.0，其配制方法是將1.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.1毫克噻重氮苯基脲、150毫克磷酸二氫鈉、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(4)類原球莖的誘導(dǎo)和增殖
將愈傷組織轉(zhuǎn)移到類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，3個月能誘導(dǎo)出類原球莖，然后將類原球莖接種到新的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，繼代周期3個月，增殖率2倍。所述的類原球莖的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、激動素(KT)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH6.0，其配制方法是將0.1毫克噻重氮苯基脲、1.0毫克激動素、150毫克磷酸二氫鈉、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(5)類原球莖的分化
將類原球莖接種到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，2個月能分化出不定芽，所述的分化培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH6.0，其配制方法是將1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氫鈉、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、1.0克活性炭、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(6)生根壯苗培養(yǎng)
將2厘米不定芽切成單芽后轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照時間16小時/天，3個月能形成3厘米高的完整植株，所述的生根壯苗培養(yǎng)基為：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉勻漿50克、活性炭1.0克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 6.0，其配制方法是將1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氫鈉、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉勻漿、1.0克活性炭、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/2MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/2MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。
(7)試管苗移栽
將具3厘米高完整植株從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到具自然光的溫室中煉苗15天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆種8株。栽培基質(zhì)為植金石(日本進口)、松樹皮和泥炭土(以色列進口)按質(zhì)量比2:3:1混合均勻。保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，移栽的成活率均可達90％以上。一年后要以3株種植為1盆。松樹皮需用沸水煮60分鐘后用自來水浸泡24小時后再用自來水沖洗3次再使用，植金石需用自來水沖洗后再使用。