本發(fā)明涉及一種通過(guò)原生質(zhì)體快速驗(yàn)證啟動(dòng)子強(qiáng)弱的方法。

背景技術(shù)：

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展，有大量的基因被測(cè)序和克隆，在功能基因研究中，基因啟動(dòng)子研究分析是主要的組成部分，所以對(duì)啟動(dòng)子的活性研究至關(guān)重要。常規(guī)分析植物啟動(dòng)子活性的方法是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系用gus作為報(bào)告基因，通過(guò)用gus染色，根據(jù)染色深淺判斷啟動(dòng)子的強(qiáng)度，此類技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)(4-6個(gè)月)無(wú)法做到精細(xì)定量，工作量大，成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種通過(guò)原生質(zhì)體快速驗(yàn)證啟動(dòng)子強(qiáng)弱的方法，只需構(gòu)建一次插入了待驗(yàn)證啟動(dòng)子序列的載體，然后用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照通過(guò)比較對(duì)照啟動(dòng)子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度和需驗(yàn)證的啟動(dòng)子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的方式快速評(píng)價(jià)啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱。

本發(fā)明具體是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種通過(guò)原生質(zhì)體快速驗(yàn)證啟動(dòng)子強(qiáng)弱的方法，通過(guò)在同一個(gè)載體上用目標(biāo)啟動(dòng)子和參考啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)同一種熒光蛋白，在同一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)，但是分別定位在不同的亞細(xì)胞位置，然后再利用同一個(gè)激光束激發(fā)熒光蛋白，此種情況下所有的其他參數(shù)都是一致的情況下，不同的亞細(xì)胞位置上的熒光亮度就可以代表啟動(dòng)子的強(qiáng)度，通過(guò)與參考啟動(dòng)子比較可以定量分析出目標(biāo)啟動(dòng)子與參考啟動(dòng)子的倍比關(guān)系。

優(yōu)選地，所述參考啟動(dòng)子可以是任意啟動(dòng)子，熒光蛋白也可以是任意熒光蛋白，激光波長(zhǎng)根據(jù)熒光蛋白設(shè)定。

優(yōu)選地，亞細(xì)胞位置為植物中央大液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜。

優(yōu)選地，目標(biāo)啟動(dòng)子和參考啟動(dòng)子必須在同一個(gè)DNA分子上，保證其拷貝數(shù)1:1。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果為：本發(fā)明基于在原生質(zhì)體中質(zhì)粒表達(dá)攜帶不同定位信號(hào)的熒光蛋白可在特定細(xì)胞組織聚集，熒光強(qiáng)弱和熒光蛋白表達(dá)量正相關(guān)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄能力強(qiáng)的啟動(dòng)子比啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄能力弱的啟動(dòng)子產(chǎn)生熒光蛋白要多能產(chǎn)生的熒光要強(qiáng)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可記錄熒光強(qiáng)度信號(hào)，比較熒光信號(hào)強(qiáng)弱評(píng)價(jià)啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為載體pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖。

圖2為在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的原生體質(zhì)粒表達(dá)熒光圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

如圖1為構(gòu)建好的pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1載體，載體特征在于有兩個(gè)基因表達(dá)單元，一個(gè)為參考啟動(dòng)子+cmmkmarker(細(xì)胞膜定位信號(hào)+綠色熒光蛋白)；另一個(gè)為ccdb+attpkosgfp(液泡膜定位信號(hào)+綠色熒光蛋白)。其中CCDB為目標(biāo)啟動(dòng)子待置換區(qū)。此載體通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)手段很容易構(gòu)建，構(gòu)建方法不在贅述。

參考啟動(dòng)子可是任何類型的用于啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。

用于對(duì)比的熒光蛋白是任何顏色熒光蛋白中的一種，但是同一個(gè)載體上的熒光蛋白必須只能有一種。

用于對(duì)照的和檢測(cè)用的熒光蛋白分別定位于細(xì)胞膜和液泡膜或者液泡膜和細(xì)胞膜。

2，將目標(biāo)啟動(dòng)子克隆進(jìn)入驗(yàn)證載體。

首先將分析載體用雙酶切將CCDB片段切下，然后目標(biāo)啟動(dòng)子通過(guò)常規(guī)的酶切鏈接方法連入載體，即可以完成載體構(gòu)建。

3，轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，并用激光共聚焦觀察。

驗(yàn)證UBI啟動(dòng)子效率

將UBI啟動(dòng)子構(gòu)建到載體pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1中。

合成如下引物一對(duì)用于擴(kuò)增UBI啟動(dòng)子序列。

UBI(+):cagtGGTCTCatagatcgtgcccctctctagagataatga

UBI(-):cagtGGTCTCagttgcagaagtaacaccaaacaacagggt

做1個(gè)50ul體系的PCR反應(yīng):

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The PCR system&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

Total:50ul

Sum:1

H2O:34 34ul

buffer:5 5ul

Mg2+:4 4ul

dNTP:2 2ul

P+:2 2ul

P-:2 2ul

taq:2 2U

Template:1ul

-----------pcr cycle-------------

94℃for 5min

+++++++++++30cycles

94℃for 30sec

50℃for 45sec

72℃for 118sec

+++++++++++++

72℃for 10min

16℃for 30min

將pcr產(chǎn)物與載體pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1進(jìn)行連接。＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The Digesting-linkProtocal＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

total:20ul

Sum:1

H2O:8 8ul

Buffer:2 2ul

BsaI/Eco31I:1 1ul

T4_ligase:1 1ul

pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1:4 4ul

rDNAU1:4 4ul

--------The Digest-Link(DL)procedure--------

37℃for 20min

++++++++5cycles

37℃for 10min

20℃for 10min

++++++++

37℃for 20min

80℃for 5min

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)

＝＝＝＝＝＝＝＝＝轉(zhuǎn)化＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

將5-10ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(見(jiàn)大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)方法)

轉(zhuǎn)化涂(卡納霉素)抗性平皿，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，進(jìn)行菌斑pcr鑒定。

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝菌斑PCR鑒定＝＝＝＝＝＝＝＝

挑取10個(gè)菌斑同時(shí)進(jìn)行1.5mlEP管接菌和PCR鑒定,引物：

pBWA(V)HS-35scm-UBIattpk1鑒定引物UBI(+)，UBI(-).

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PCR system＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

做10個(gè)25ul體系的PCR反應(yīng):

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The PCR system&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

Total:25ul

Sum:10

H2O:16.5 165ul

buffer:2.5 25ul

Mg2+:2 20ul

dNTP:1 10ul

UBI(+):1 10ul

UBI(-):1 10ul

taq:1 10U

Template:1ul

-----------pcr cycle-------------

94℃for 5min

+++++++++++30cycles

94℃for 30sec

50℃for 45sec

72℃for 118sec

+++++++++++++

72℃for 10min

16℃for 30min

獲取正確克隆，進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證獲得構(gòu)建好的

pBWA(V)HS-35scm-UBIattpk1。

轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體

25℃暗培養(yǎng)水稻種子1-2周，將新鮮的水稻苗切段，加入適量酶解液(1.5％Cellulase R10,0.75％Macerozyme R10,0.6M mannitol,10mM MES pH 5.7,10mM CaCl2and 0.1％BSA)。15-20℃輕輕搖晃(20-30rpm)酶解3h。用40μm尼龍網(wǎng)將原生質(zhì)體過(guò)濾分離到圓底離心管，80g離心3min收集原生質(zhì)體。用W5溶液(154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl and 2mM MES pH 5.7)洗滌，冰上靜置30min，用MMG溶液(0.4M mannitol,15mM MgCl2and 4mM MES pH 5.7)懸浮。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化在PEG溶液(40％(W/V)PEG 4000,2M mannitol and 0.1M CaCl2)中進(jìn)行，溫和混勻轉(zhuǎn)化混合物(10μg目標(biāo)質(zhì)?；?0ugMaker質(zhì)粒、250μl PEG溶液中、200μl原生質(zhì)體懸浮液，共轉(zhuǎn)化)。室溫下暗中放置30min后，用800μl W5溶液洗滌，收集原生質(zhì)體。用2ml W5溶液懸浮，室溫暗中培養(yǎng)16-24h。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察質(zhì)粒表達(dá)如圖2所示，外環(huán)(細(xì)胞膜)為35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gfp，內(nèi)環(huán)(液泡膜)為ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gfp。

通過(guò)比較定位在液泡膜和細(xì)胞膜熒光蛋白信號(hào)強(qiáng)弱判斷啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱，定位蛋白的熒光強(qiáng)度越大啟動(dòng)子活性越強(qiáng)，通過(guò)專業(yè)的分析軟件可以定量分析啟動(dòng)子相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。