本發(fā)明涉及一種重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)是對催化降解透明質(zhì)酸酶的通稱。透明質(zhì)酸酶分布較廣，在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都檢測到了透明質(zhì)酸酶。在人體組織及體液中也發(fā)現(xiàn)廣泛存在著透明質(zhì)酸酶。此外，一些細菌、真菌以及非脊椎動物如水蛭、甲殼類動物等也產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶。1971年，Meyer根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用機制的不同，將其分為三類：第一類是內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC 3.2.1.35)，為水解酶，作用于β-1，4糖苷鍵，降解終產(chǎn)物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉(zhuǎn)糖苷活性。哺乳動物來源和動物毒液來源的透明質(zhì)酸酶屬于此類。研究最多的是睪丸、蜂毒以及溶酶體透明質(zhì)酸酶；第二類是水蛭、十二指腸來源的透明質(zhì)酸酶，為內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)，作用于β-1，3糖苷鍵，也為水解酶，主要降解終產(chǎn)物為四糖，可特異性降解透明質(zhì)酸；第三類是細菌來源的透明質(zhì)酸酶(EC 4.2.2.1)，此類為透明質(zhì)酸裂解酶(hyaluronate lyase)，作用于β-1，4糖苷鍵，通過β-消去機制得到4，5-不飽和雙糖。

近年開始用X-射線晶體衍射法研究透明質(zhì)酸酶的結(jié)構(gòu)和作用機制。目前見到報道的有Streptococcus pneumoniae和S.agalactiae(B族Streptococcus，GBS)透明質(zhì)酸酶。完整的細菌透明質(zhì)酸酶包含4個結(jié)構(gòu)域：N末端的糖結(jié)合域，間隔域，催化反應(yīng)域，和C末端調(diào)節(jié)域，兩個末端結(jié)構(gòu)域與相鄰結(jié)構(gòu)域間由一段連接多肽相連。

產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的微生物包括很多革蘭氏陰性與陽性菌，革蘭氏陰性菌所產(chǎn)酶大多存在于周質(zhì)空間，不大可能與發(fā)病機制相關(guān)。這些菌有Aeromonas，Bacteroides，F(xiàn)usobacterium等。而產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的革蘭氏陽性菌有Streptococcus，Staphylococcus，Clostridium，Propionibacterium，Peptostreptococcus以及Streptomyces。其中，對于鏈球菌透明質(zhì)酸酶的報道很多且深入。引人注目的是，這些菌大多都是致病菌，可引起人或動物的皮膚或粘膜感染，利用產(chǎn)生的酶降解透明質(zhì)酸，破壞其防御體系，降低粘度，便于入侵。溫和噬菌體如Streptococcus pyogenes和S.equi的透明質(zhì)酸酶，基因序列間有很大同源性，但與細菌透明質(zhì)酸酶的序列相似性很小。噬菌體透明質(zhì)酸酶以多聚體存在，且能專一性降解透明質(zhì)酸，并且為非進行性降解。S.pyogenes噬菌體攜帶透明質(zhì)酸酶穿透細菌莢膜，到達受體部位，進而感染細菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)透明質(zhì)素裂解酶的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入編碼透明質(zhì)酸裂解酶的基因，誘導(dǎo)表達透明質(zhì)酸裂解酶。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述重組枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)透明質(zhì)素裂解酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有一目的在于提供一種生產(chǎn)透明質(zhì)素裂解酶的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入編碼透明質(zhì)酸裂解酶的基因構(gòu)建得到的，所述編碼透明質(zhì)酸裂解酶的基因具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，該基因重組整合在枯草芽孢桿菌基因組上，并置于木糖誘導(dǎo)型啟動子P_xylA下誘導(dǎo)表達。

本發(fā)明中編碼所述透明質(zhì)酸裂解酶的基因是來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌體H4489A的HylP；HylP的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。編碼透明質(zhì)酸裂解酶的基因HylP重組整合在基因組上進行誘導(dǎo)表達，啟動子為木糖誘導(dǎo)型啟動子P_xylA。

所述透明質(zhì)酸裂解酶的N端帶有信號肽amyX和組氨酸標簽6×His-tag。所述信號肽amyX的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入編碼透明質(zhì)酸裂解酶的基因的過程是構(gòu)建含有透明質(zhì)酸裂解酶基因的重組質(zhì)粒，將含有透明質(zhì)酸裂解酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。優(yōu)選的，上述的含有透明質(zhì)酸裂解酶基因的重組質(zhì)粒采用以下步驟構(gòu)建：

(1)設(shè)計引物HylP-F、HylP-R，以基因合成的pUC19-HylP為模板，進行PCR擴增獲得HylP基因片段；設(shè)計引物AmyX-F、AmyX-R，以質(zhì)粒pMA0911-amyX為模板，進行PCR擴增獲得amyX片段；

HylP-F:CACCACCACCACCACCACCGTCGGAGGTGCAGGAATTG

HylP-R:TCCCCGCGGTTACACTTTATGCTTCCGGC

AmyX-F:CGCGGATCC ATGGTCAGCATCCGCCGCAG

AmyX-R:GTGGTGGTGGTGGTGGTGCATGATTTCCTTTTGTTCAG；

(2)將HylP基因片段與amyX片段通過組氨酸標簽進行兩步融合PCR，PCR擴增獲取的amyX-His6-HylP片段，將amyX-His6-HylP片段與質(zhì)粒pAX01分別采用BamHI和SacII進行雙酶切，回收產(chǎn)物進行連接，得到重組質(zhì)粒pAX01-H6HylPA1。

所述兩步融合PCR的過程為：第一步體系50μl：2μl HylP片段，2μl amyX片段，25μl PrimerStar(mix)，21μl ddH₂O。按照如下程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，5個循環(huán)；72℃，5min；12℃，保持。第二步體系50μl：1μl第一步PCR產(chǎn)物，1μl AmyX-F，1μl HylP-R，25μl PrimerStar mix，22μl ddH₂O。

所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168。

上述的重組枯草芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶中的應(yīng)用。

一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶的方法，發(fā)酵培養(yǎng)上述的重組枯草芽孢桿菌并采用木糖誘導(dǎo)透明質(zhì)酸裂解酶基因表達獲得透明質(zhì)酸裂解酶。

所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為以蔗糖或葡萄糖作為碳源的無機鹽培養(yǎng)基：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖或葡萄糖；硫酸鉀3.9g/L；50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。

所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：在37℃下，發(fā)酵40～60h；接種后1～4h向培養(yǎng)基中添加2g/L的木糖誘導(dǎo)透明質(zhì)酸裂解酶基因表達。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶，與其他產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶菌相比，具有非常大的應(yīng)用優(yōu)勢。首先，本發(fā)明過程中使用的宿主為食品級，完全滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要求，無內(nèi)毒素和病原感染的風險，不會對產(chǎn)物的醫(yī)用食品安全帶來隱患；其次，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成本簡單，生產(chǎn)強度大?；趹?yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備透明質(zhì)酸裂解酶具有潛在而廣泛的價值。

附圖說明

圖1為PCR和凝膠核酸電泳鑒定透明質(zhì)酸裂解酶基因HylP在枯草芽孢桿菌中的整合構(gòu)建。

圖2為枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶的胞外與胞內(nèi)酶活曲線(含對照菌)：B.subtilis H6HylPA1胞外酶活；B.subtilis H6HylPA1胞內(nèi)酶活；B.subtilis 168胞外酶活。

具體實施方式

序列表所示為本發(fā)明所述核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息為來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌體H4489A的透明質(zhì)酸裂解酶基因HylP編碼序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動子P_xylA的基因序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息為信號肽amyX的基因序列。

實施例1整合重組質(zhì)粒pAX01-H6HylPA1構(gòu)建

透明質(zhì)酸裂解酶基因HylP來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌體H4489A，基因合成HylP基因，根據(jù)已公布的基因信息序列，設(shè)計引物HylP-F、HylP-R，以基因合成的pUC19-HylP(將如SEQ ID NO.1所示的透明質(zhì)酸裂解酶基因HylP克隆至pUC19載體得到，由南京拓達生物科技有限公司合成)為模板，采用標準的PCR擴增體系和程序，擴增獲取目標基因。

引物序列信息：5’-3’方向

HylP-F:CACCACCACCACCACCACCGTCGGAGGTGCAGGAATTG

HylP-R:TCCCCGCGGTTACACTTTATGCTTCCGGC

AmyX-F:CGCGGATCCATGGTCAGCATCCGCCGCAG

AmyX-R:GTGGTGGTGGTGGTGGTGCATGATTTCCTTTTGTTCAG

在HylP基因上下游兩端分別引入組氨酸標簽6×His-tag和SacII限制性酶切位點，PCR擴增獲取的HylP片段，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進行切膠回收。在信號肽amyX基因上下游兩端分別引入BamHI限制性酶切位點和組氨酸標簽6×His-tag，以質(zhì)粒pMA0911-amyX為(購自南京拓達生物科技有限公司，該質(zhì)粒上含有amyX信號肽，可以此為模板進行PCR擴增，SEQ ID NO.3所示的基因序列即為該質(zhì)粒上amyX信號肽的序列)模板，PCR擴增獲取的amyX片段，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進行切膠回收。HylP片段與amyX片段通過組氨酸標簽進行兩步融合PCR，第一步體系50μl：2μl HylP片段，2μl amyX片段，25μl PrimerStar(mix)，21μl ddH₂O。按照如下程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，5個循環(huán)；72℃，5min；12℃，保持。第二步體系50μl：1μl第一步PCR產(chǎn)物，1μl AmyX-F，1μl HylP-R，25μl PrimerStar mix(Takara)，22μl ddH₂O。PCR擴增獲取的amyX-His6-HylP片段，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進行切膠回收，與質(zhì)粒pAX01分別采用BamHI和SacII進行雙酶切，回收產(chǎn)物進行連接，體系10μl：1μl雙切的載體，4μl雙切的目的片段，5μl Solution I連接酶，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進行測序，比對正確，重組質(zhì)粒pAX01-H6HylPA1構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pAX01-H6HylPA1轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168，以20μg/ml的紅霉素平板進行篩選整合重組子，并對重組菌株進行PCR驗證和測序驗證，對成功整合pAX01-H6HylPA1的枯草芽孢桿菌菌株命名為Bacillus subtilis H6HylPA1。

實施例2重組枯草芽孢桿菌菌株的搖瓶發(fā)酵

挑取上述構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis H6HylPA1，單克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基，置于200rpm 37℃過夜培養(yǎng)。16h后接種于250ml三角搖瓶(裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖；硫酸鉀3.9g/L；50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。按10％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于搖瓶，置于200rpm 37℃培養(yǎng)，在接種后第2h添加2g/L的木糖進行誘導(dǎo)HylP基因表達，發(fā)酵培養(yǎng)54h，并定期取樣，分別為第6h，12h，24h，36h，48h，54h。

發(fā)酵液在8000×g下4℃離心5min。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另一離心管中，測定胞外上清中的粗酶活。另外，取2OD各取樣時間的菌體樣品，通過20mg/ml濃度的溶菌酶處理，37℃，20min，除去菌體細胞壁。8000×g下4℃離心5min除去溶菌酶，加入0.5ml 100mM醋酸鈉緩沖液和5mM CaCl₂溶液(pH 6.0)重懸細胞，使用fastprep震蕩破碎裂解細胞，測定胞內(nèi)酶活，與同時期胞外酶活比較。透明質(zhì)酸底物濃度為0.1mg/ml，以100mM醋酸鈉緩沖液和5mM CaCl₂溶液(pH 6.0)溶解底物。酶活測定的反應(yīng)體系為0.5ml，包括0.2％(w/v，g/ml)底物和一定量的粗酶液。在30℃反應(yīng)20min后，加入2ml的5M HCl終止反應(yīng)。通過分光光度計測定在235nm處的吸光值。酶活單位定義為：產(chǎn)生不飽和透明質(zhì)酸寡糖的蛋白量等同于使用在235nm處消光系數(shù)為5500M^-1cm^-1的1μmol不飽和透明質(zhì)酸雙糖。

從附圖1看出，利用菌落PCR，通過HylP基因上下游引物HylP-F/R擴增基因全長。圖中泳道11為5000DL Marker，依據(jù)泳道2-10和12-19目的條帶位置，可判斷所獲得的條帶大小為3222bp，同時泳道1對照菌B.subtilis 168中未見相同目的條帶，因此證明pAX01-H6HylPA1重組質(zhì)粒已成功整合至B.subtilis 168基因組，表達框P_xylA-amyX-His6-HylP構(gòu)建成功。

從附圖2看出，重組枯草芽孢桿菌B.subtilis H6HylPA1的胞外酶活隨時間延長而逐漸增加，第48h時達到最高，為262U/ml，此后酶活降低。相應(yīng)地，將枯草芽孢桿菌菌體破碎，測定胞內(nèi)酶活，發(fā)現(xiàn)菌體內(nèi)仍存在少量酶活，證明信號肽amyX與透明質(zhì)酸裂解酶HylP相匹配，可將大部分酶轉(zhuǎn)運至胞外。對照菌B.subtilis 168的胞外幾乎沒有酶活，證明只有當HylP基因存在時，才能產(chǎn)生透明質(zhì)酸裂解酶。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。

序列表

<110> 顏萌

<120> 一種重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸裂解酶的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3222

<212> DNA

<213> 釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）噬菌體

<400> 1

cgtcggaggt gcaggaattg gcccttgaga tggcttataa agatgtggtt gacggtaata 60

atgccacgat agcagggcag tggtcagaca gcccgcaaat gattttagat ggaggtagtt 120

aatgactgaa aatataccat taagagtcca atttaagcgc atgagcgctg atgagtgggc 180

tcgtagtgat gtcatcttgc ttgagggtga gataggtttt gagactgaca ctggttttgc 240

taagtttggc gatggtcaaa acacttttag taagcttaag taccttactg gtcccaaagg 300

tcctaaagga gacactggtc tccaaggtaa aactggagga actggtcctc ggggccctgc 360

tggcaagcct ggaacgacag attatgatca actccaaaat aaaccagatc taggtgcgtt 420

tgcacaaaaa gaagaaacta atagtaaaat caccaaatta gaatcaagca aagcagataa 480

aagcgctgtt tactcaaaag cagagtcaaa aatagagcta gacaaaaaat tgagcttaac 540

aggcggcata gtgacaggac aactacagtt taaacctaat aaaagtggta ttaaaccctc 600

atcttccgta ggaggagcga ttaacattga tatgtctaaa tcggaaggtg ctgctatggt 660

gatgtataca aataaagata ctactgatgg accattgatg attttacgtt ctgacaaaga 720

tacgtttgat cagtcagctc aatttgtgga ttacagcggt aagactaatg ctgtaaatat 780

tgtaatgcgc cagccaagcg cacctaattt ttcctcggca cttaatataa ccagtgccaa 840

cgaaggcggt agtgcgatgc aaattagagg cgtcgaaaaa gcgctaggaa cgctcaaaat 900

cacacacgaa aacccaaacg ttgaggcaaa atacgatgaa aacgctgcag cgttatctat 960

tgatatcgtt aaaaaacaga aaggcggaaa aggtactgct gctcaaggaa tctacattaa 1020

ctcaacatca ggcacagctg gtaaaatgct cagaatcaga aataaaaatg aagacaaatt 1080

ttatgtaggt ccagatggcg gctttcactc aggtgcaaat tcaactgtag ctggtaatct 1140

aacagttaaa gatccaacat ctggaaaaca tgctgcgact aaagattacg tagatgaaaa 1200

aattgctgag ttaaaaaaac tcatactaaa aaaatagatt aaggaggata aatgagcaga 1260

gacccaacat atacaataaa cgagcacgac ttatcttttg cagatggtcg tttttatgtg 1320

acctttaagg cagataagtc aagtgagact gtgagactta acagtagttg ccttggcaat 1380

accataatca aaaagctaca ggtcgaggat gacaatacaa tgcacgactt tgtaaagcct 1440

aaagttacca ctcaacaagc ttttggacta gctcagcagg tcaaagagct tgatttacag 1500

ctaaaagacc ctaagtcaga tttgtggggc aaaatcaagt tcaataataa ggcaatgcta 1560

gtcgagtacg ccaacaaaga gatgtcaagt gccattgcgc aatcagctga gcagatattg 1620

ttacaagtca agtctattga tgatgaacga tattccaaat ttgagcaaac tctgaatggt 1680

atcaaacaaa ctgtcaaaag tgagtcagtt gaatccgcac gtactcagct agcatcaatg 1740

tttgatagtc gtattagtgg acttgatggc aaatacagtc gtttaagcca aacaattgat 1800

agtcttagca gtcgtcttga tgatggtgtt ggtaactact caacgctatc tcaaaaggta 1860

agtggcattg atttacgagt tagtaatgca gctaatgatg tttctcgatt gtctcagaca 1920

gcacaaggat tacagtcaca aatcacaaat gcaaaccaaa attacagcag tttgtctcag 1980

actgtacagg gactacaaac aactgtacgt gataatcaat caaatgctac aagtcggatt 2040

aatcagttaa gtgatttaat cagtactaaa gtgactaagg gcgacgtcga aacaactatt 2100

gctcaaagtt acgacaagat agccttcgca atcagggata aactcccagc aagcaagatg 2160

actggcagtg agattatctc ggcaatcaat cttgataggt ctggggttaa aatcactggc 2220

aaaaacatca cattagacgg taacagctac atcagcaacg ctgttatcaa agatgctcac 2280

attgctaaca tggatgctgg taagattaac actggttatc ttaatgctag tagaattgcg 2340

gcagaagcta tcactggcga caaaatcaag atggactatg ctttttttaa taagctcact 2400

gctaatgagg gatattttag gaccttattt gctaaaaata tctttaccac atctgtacag 2460

gctgtcacta cgtctgcgag taagattaca ggtggtgtgc tttctgccac gaatggtgcg 2520

agtaggtggg atttgaatag tgcaaatatt gattttaatc gagatgccac aattaatttt 2580

aacagcaaaa acaatgcgct tgttcgaaaa tcaggtacca acactgcttt tgttcacttt 2640

agcaatgcga caccaaaagg ctatagaggc tcagcgttgt atgcgtcaat cgggataacc 2700

tcatcaggag atggcatcga cagcgcttcg tctggacgtt tctgtggagt taggtttttc 2760

cggtacgctg aagggttaca gcatacagca aaggtcgatc aagccgaaat ttatggtgat 2820

gatattgtct ttagcgacga ttttaacatc gatcgtggct ttaagatgcg gcctagccta 2880

atgccaaaaa tggtcgactt aaacaagatg taccaggcaa ttttggctct cggccgctgc 2940

tggctgcatg ctaataacac ggcttggtcg tggaattttg atacacgcag cgcaatcatc 3000

gcagaatata acgcacacat taataactta taggagaaac aatggattta acgcttaaaa 3060

acaaagattt aaacacacta tatagtgtac tagacaaaat caaaatcacg aacatgcgag 3120

caaaccgggg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 3180

cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aa 3222

<210> 2

<211> 206

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

catatctaat attataacta aattttctaa aaaaaacatt gaaataaaca tttattttgt 60

atatgatgag ataaagttag tttattggat aaacaaacta actcaattaa gatagttgat 120

ggataaactt gttcacttaa atcaaagggg gaaatgacaa atggtccaaa ctagtgatat 180

ctaaaaatca aagggggaaa tgtaca 206

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

atggtcagca tccgccgcag cttcgaagcg tatgtcgatg acatgaatat cattactgtt 60

ctgattcctg ctgaacaaaa ggaaatcatg 90

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccaccacc accaccaccg tcggaggtgc aggaattg 38

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccccgcggt tacactttat gcttccggc 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcggatcca tggtcagcat ccgccgcag 29

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtggtggtgg tggtggtgc atgatttcct tttgttcag 39