本發(fā)明屬于制糖工業(yè)用酶安全生產(chǎn)菌株的構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

普魯蘭酶是食品行業(yè)制糖生產(chǎn)技術(shù)中不可或缺的一類酶，主要由原核微生物分泌表達的糖鏈解枝酶。生產(chǎn)應(yīng)用中多使用這類酶中的i型普魯蘭酶，其能夠?qū)Ｒ恍郧虚_淀粉原料中由α-1,6糖苷鍵構(gòu)成的支鏈分支，因此普魯蘭酶與其它淀粉水解酶共同作用，可以讓淀粉得以完全酶解，得到單分子葡萄糖分子，其在淀粉加工等食品行業(yè)中有著廣闊的市場前景。近年來，國內(nèi)外對普魯蘭酶生產(chǎn)菌株的研發(fā)投入大量人力物力，許多工業(yè)酶生產(chǎn)企業(yè)先后開發(fā)出多種不同類型的重組生產(chǎn)菌株或誘變菌。在適合工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的多種普魯蘭酶蛋白中，來自長野芽胞桿菌(bacillusnaganoensis)的普魯蘭酶（bnpulb），其酶學(xué)特征，包括最適反應(yīng)溫度及ph等均非常適合淀粉工業(yè)加工的需求，但該酶的原產(chǎn)菌的表達水平不高，因此其基因常被用于構(gòu)建于重組表達生產(chǎn)，在適合食品工業(yè)用酶的宿主細胞中?？莶菅挎邨U菌(bacillussubtilis)因為其不表達致熱源和毒素因子，且其分泌途徑強大，因此被列為安全生產(chǎn)菌株（gras）之一，常被用于許多胞外酶發(fā)酵生產(chǎn)的首選宿主細胞?？莶菅挎邨U菌有許多種，其各自的轉(zhuǎn)化性能、分泌能力等相關(guān)很大，其中a164以其營養(yǎng)需求不高，發(fā)酵密度高，蛋白分泌水平高等原因被視為蛋白生產(chǎn)的理想宿主細胞。

為了提高生產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性，外源表達通常被整合到宿主細胞的基因組中，而抗生素基因常用作篩選標(biāo)記來使用，但是在食品工業(yè)中，攜帶抗生素基因的重組菌株會帶來生物安全性的問題，因此，有必要在完成外源基因的整合后再通過二次重組或者特異性重組的方式，將抗生素基因去除，得到無抗的生產(chǎn)菌株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌cnp2的構(gòu)建方法—通過兩次基因操作，將兩份拷貝普魯蘭酶基因整合到枯草芽孢桿菌的基因組中，并通過特異性重組系統(tǒng)，將抗生素基因去除，從而獲得了一株安全的普魯蘭酶高產(chǎn)菌株。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案具體如下：

將人工合成的普魯蘭酶基因表達框tpu1及tpu2分別原位替代枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因apre以及淀粉酶基因amye，并將抗性基因ermc和kan敲除后得到所述重組枯草芽孢桿菌，具體步驟如下：

a.設(shè)計并基因合成線性dna片段tpu1及tpu2；

b.以枯草芽孢桿菌a164為出發(fā)菌株進行分子構(gòu)建，將tpu1與枯草芽孢桿菌a164感受態(tài)細胞混合，進行轉(zhuǎn)化，獲得具有紅霉素抗性的重組菌株cnp1；

所述枯草芽孢桿菌a164，最開始分離自德國馬爾堡，該菌種可以通過美國國家菌種保藏中心購買得到，菌種保藏號為atcc6051a；

c.將tpu2與枯草芽孢桿菌cnp1感受態(tài)細胞混合，進行轉(zhuǎn)化，獲得具有紅霉素/卡那霉素雙抗性的重組菌株cnp2ek；

d.轉(zhuǎn)入cre表達質(zhì)粒，進行紅霉素/卡那霉素雙抗性的消除，得到重組枯草芽孢桿菌cnp2，即重組枯草芽孢桿菌。

所述基因表達框tpu1及tpu2分別經(jīng)密碼子優(yōu)化、基因合成后獲得，tpu1的核苷酸序列為：

caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60

atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120

gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180

ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240

ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300

ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360

ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420

atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480

gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540

aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600

attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagatcgattgtttgagaaaagaagaagacca660

taaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctg720

tgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgacattattttactgatatgtataatataattt780

gtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttgtt840

gcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaacgc900

ccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaaccttc960

ttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaatg1020

acatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgtga1080

attatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttacaag1140

tagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatgaa1200

tatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttctatt1260

ggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggatgc1320

ctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaatc1380

attttatcagtttgaaaattatgtattatgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggc1440

tggatgttccttcttgctttccttcttacagcttctcttttctgccctacaggccaacat1500

gctaaagctgctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagtt1560

cttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcat1620

gatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttaca1680

gctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataac1740

cataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcct1800

gaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccct1860

tctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatc1920

ccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgat1980

tcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttct2040

catacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagtt2100

cttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaac2160

gctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaac2220

tctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgg2280

gaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaa2340

ggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgt2400

ggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatc2460

acacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatc2520

gattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcaca2580

aaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacat2640

gttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatac2700

aactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgct2760

aacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcat2820

atcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttc2880

gataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggc2940

tctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgat3000

tctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggct3060

cttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggc3120

atcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaactt3180

cttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaac3240

ggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggc3300

cttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcct3360

ggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgct3420

caatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagct3480

atcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtaca3540

aaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtct3600

cgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtctt3660

gatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcctt3720

aactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatgg3780

ggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttct3840

ggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagct3900

gaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcct3960

tctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaaggatccaagct4020

tgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctcta4080

cgaccaaaactataaaacctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagat4140

aaatctctcatatcttttattcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatca4200

ctcatcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatactaattttataaggagga4260

aaaaatatgggcatttttagtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaa4320

aaataagtggttataatgaatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggaggg4380

aaataatgaacgagaaaaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataata4440

tagataaaataatgacaaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggct4500

caggaaaaggccattttacccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattg4560

aaatagaccataaattatgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttcc4620

aagttttaaacaaggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatat4680

atggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagta4740

tagctaatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaa4800

aacgctcattggcattacttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttc4860

caagagaatattttcatcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaa4920

aaaaatcaagaatatcacacaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatggg4980

ttaacaaagaatacaagaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatg5040

caggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagct5100

ataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttc5160

gtgtgcctattttttgtgaattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatag5220

catacattatacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccatt5280

ttggctctttaccctctccttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattc5340

tgtgaatttattgtaatagatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgatt5400

ttatctctatttaggtatatcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattt5460

tcatacagaaaagaacgaaaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgc5520

ttttttaggttaaatgctcctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaat5580

gacctgcgtgtgcttccgtgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatga5640

tgataaaagtattctgaaaaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattg5700

agagggaggaagaaataagatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgcca5760

tgcgccgctgtttaaccaatatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggc5820

agaggcttttttgaaagctcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaaga5880

aaatg5885；

tpu2的核苷酸序列為：

atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60

tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120

gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180

aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240

tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300

tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360

tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420

atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480

tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcatagaatct540

aatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgat600

gaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaa660

cttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttg720

ttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaac780

gcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaacct840

tcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaa900

tgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgt960

gaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttaca1020

agtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatg1080

aatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttcta1140

ttggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggat1200

gcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaa1260

tcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcg1320

ttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcgaagttgcta1380

aagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgtta1440

aactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgata1500

cagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttc1560

ttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataaca1620

cacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggca1680

actaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgata1740

acatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttcta1800

cacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctg1860

gcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacac1920

tttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgatt1980

cttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaa2040

cattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgcta2100

caggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagcta2160

cagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctcta2220

cacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatga2280

tcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacaccta2340

aaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattcta2400

actctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggcc2460

ctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaac2520

ttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggg2580

gctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggca2640

caacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcg2700

ttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaa2760

tcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggca2820

caggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctctta2880

aattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttg2940

gcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctc3000

tttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaa3060

aaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttg3120

atggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacag3180

atgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaa3240

caatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatcta3300

accctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgtta3360

tgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcg3420

gcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaag3480

ctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatc3540

ctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctc3600

ctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaaca3660

tcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaat3720

gggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggct3780

ctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatg3840

gcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaagggatccaagcttgcggc3900

cgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgttgaagattag3960

atgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagct4020

gaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctga4080

aaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagat4140

tgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattgg4200

tgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtg4260

tgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggt4320

ggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcaga4380

ttggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggata4440

cttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgat4500

ttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgt4560

gcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccat4620

gttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagc4680

agttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg4740

tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattca4800

ggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaac4860

gatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtatt4920

agtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggt4980

acatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcgacatggatgag5040

cgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctct5100

tttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccggggaaaagccaaat5160

aggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatagatttca5220

caatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaacaaccagatatt5280

tatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcatcctctgtctc5340

tatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctggagcgggttc5400

atttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtagctgtgct5460

ttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattacaaaacaggtgt5520

aacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcgaatacaacaaa5580

agccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatggagatcaattc5640

acaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaacgaa5700

cagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatccagcgtcggc5760

caaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgcttatatctataa5820

acatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaaccaatgactaa5880

aaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaaccaacgcaaa5940

agtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctggctttgatta6000

cgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttccccattga6055。

所術(shù)基因表達框tpu1和tpu2分別包含一份拷貝的普魯蘭酶編碼基因pulb，所述pulb基因的核苷酸序列如下：

caacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttct60

caacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaac120

aaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggc180

acattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttctt240

aaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaa300

tacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaac360

cttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgct420

gtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaa480

acagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatc540

caaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaa600

tactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaa660

gtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgct720

gttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaac780

caagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtaca840

gctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgat900

cttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatc960

gaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggc1020

atgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataac1080

gttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacct1140

gttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgat1200

cctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgt1260

atcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatg1320

gatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcct1380

gaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaac1440

gaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgg1500

gttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagat1560

acaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggc1620

gaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgct1680

caaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctct1740

gttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatc1800

aaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaac1860

tacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaac1920

gattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatct1980

caaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgat2040

aactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaatac2100

cctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttc2160

cgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaac2220

acagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgtt2280

atctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatc2340

aacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaa2400

gttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataa2460。

所述基因表達框tpu1含有用于敲除apre基因的同源片斷，其核苷酸序列如下：

caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60

atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120

gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180

ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240

ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300

ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360

ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420

atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480

gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540

aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600

attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagggatccaagcttgcggccgctaccgttcg660

tatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctctacgaccaaaactataaaac720

ctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagataaatctctcatatctttt780

attcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatattt840

atcagagctcgtgctataattatactaattttataaggaggaaaaaatatgggcattttt900

agtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaaaaataagtggttataatg960

aatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggagggaaataatgaacgagaaaa1020

atataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgacaa1080

atataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaaggccatttta1140

cccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaattat1200

gcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaaggata1260

tattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatatggtaatataccttata1320

acataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctaatgagatttatt1380

taatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcattac1440

ttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttcatc1500

ctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaaaaaaatcaagaatatcac1560

acaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaaga1620

aaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgatttaa1680

acaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataagt1740

aagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtgcctattttttgtg1800

aattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatagcatacattatacgaacgg1860

tacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctctttaccctctc1920

cttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattctgtgaatttattgtaata1980

gatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgattttatctctatttaggtat2040

atcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattttcatacagaaaagaacga2100

aaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgcttttttaggttaaatgct2160

cctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaatgacctgcgtgtgcttccg2220

tgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatgatgataaaagtattctgaa2280

aaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattgagagggaggaagaaataa2340

gatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccattgcgccgctgtttaacca2400

atatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggcagaggcttttttgaaagc2460

tcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaagaaaatg2507；

所述基因表達框tpu2含有用于敲除amye基因的同源片斷，其核苷酸序列如下：

atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60

tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120

gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180

aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240

tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300

tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360

tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420

atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480

tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcagggatcca540

agcttgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgt600

tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagtt660

attaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa720

aattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaa780

gaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgtta840

aggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattg900

agatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtg960

agtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcagg1020

tggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgatt1080

caggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttcc1140

acgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgta1200

atattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatgg1260

caggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtct1320

taactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg1380

taatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctgga1440

atgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatac1500

cattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttc1560

tcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacatta1620

tacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcga1680

catggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggca1740

gtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccgggga1800

aaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtca1860

atagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaaca1920

accagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcat1980

cctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctg2040

gagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctg2100

tagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattaca2160

aaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcga2220

atacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatgg2280

agatcaattcacaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaa2340

aaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatc2400

cagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgctt2460

atatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaac2520

caatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaa2580

ccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctg2640

gctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttcccc2700

attga2705。

所述基因表達框tpu1及tpu2均含有普魯蘭酶分泌信號肽編碼序列以及用于重組的同源臂序列，tpu1中所述信號肽的核苷酸序列如下：

atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60

acagcttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct108；

tpu2中所述信號肽的核苷酸序列如下：

atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60

tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99。

所述基因表達框tpu1中含有啟動子pamy-cryiii及淀粉酶分泌的信號肽序列spamyl，核苷酸序列如下：

atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60

attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120

ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180

aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240

ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300

acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360

acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420

tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480

tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540

atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600

tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660

taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720

tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780

ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840

cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct884；

所述基因表達框tpu2中含有啟動子pxyla-cryiii及來自幾丁質(zhì)酶分泌的信號肽序列spchit，核苷酸序列如下：

tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60

tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120

tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180

tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240

attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300

ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360

ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420

gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480

ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540

attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600

tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660

ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720

atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780

attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840

agttgctaaagctgct856。

本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有的菌株誘變或者分子生物學(xué)構(gòu)建技術(shù)相比，本發(fā)明綜合利用枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的特點和優(yōu)勢，以基因設(shè)計結(jié)合基因合成的方式獲取線性的人工dna片斷；dna片斷中含有分子生物學(xué)操作后期所需的抗性基因及重組序列，利用不同抗性基因的篩選，獲得雙拷貝的表達基因，再利用特異性重組，一次性地將抗性基因敲除；設(shè)計的表達元件中充分利用了rna穩(wěn)定因子、高效分泌肽等元素，將重組枯草芽孢桿菌高分泌的優(yōu)勢盡量發(fā)揮出來；最終得到產(chǎn)普魯蘭酶的、無抗的重組枯草芽孢桿菌cnp2，該重組菌株經(jīng)生物反應(yīng)器發(fā)酵證實可以高產(chǎn)普魯蘭酶，發(fā)酵32h的酶活大于1000u/ml。

附圖說明

圖1為重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建示意圖；

圖2為重組枯草芽孢桿菌cnp2的發(fā)酵酶活隨發(fā)酵時間變化的示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。

實施例1：重組枯草芽孢桿菌cnp2的構(gòu)建

1.整合型dna的獲得

普魯蘭酶表達的操縱子有兩個，第一個pulb1包括人工串聯(lián)啟動子pamy-cryiii、密碼子優(yōu)化的淀粉酶分泌的信號肽序列spamyl以及密碼子優(yōu)化的普魯蘭酶編碼基因pulb，pulb序列見seqidno.3，pulb1序列見seqidno.10；第二個pulb2包括人工串聯(lián)啟動子pxyla-cryiii、密碼子優(yōu)化的幾丁質(zhì)酶分泌的信號肽序列spchit以及密碼子優(yōu)化的普魯蘭酶編碼基因pulb，pulb2序列見seqidno.11。

用于apre敲除的重組臂及紅霉素抗性片段的基因表達框apr-erm-apr如seqidno.8所示，用于amye敲除的重組臂及卡那霉素抗性片段的基因表達框amy-kan-amy如seqidno.9所示。

把pulb1插入apr-erm-apr的psti和bamhi位點，通過人工合成的方式獲得基因表達框tpu1，把pulb2插入amy-kan-amy的psti和bamhi位點，通過人工合成的方式獲得基因表達框tpu2。tpu1和tpu2的序列分別見seqidno.4和seqidno.5。

2.重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

首先挑取a164單菌落于含有3ml液體lb培養(yǎng)基的試管中，37℃、200r/min過夜培養(yǎng)；然后取3ml過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的40ml富集培養(yǎng)基中37℃、200r/min培養(yǎng)至od600=0.85-0.95，富集培養(yǎng)基的配方為lb+90g/l山梨醇；再將菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃離心后收集菌體；接著用30ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基，重新懸浮菌體，5000g離心5min，4℃離心去上清，如此操作3次，電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的配方為10g/l葡萄糖+92.5g/l甘露醇+90g/l山梨醇；洗三次后，利用未完全除去的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基將菌體重懸后，然后分裝到1.5ml無菌離心管中，每管分裝100μl，冰上操作；最后在100μl感受態(tài)細胞中加入2μg線性dna片段tpu1，冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(1mm)中，設(shè)置電壓2.5kv，電擊一次；電擊完畢取出杯子并立即加入500μl復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃、200r/min培養(yǎng)，復(fù)蘇培養(yǎng)基的組分為lb+90g/l山梨醇+70g/l甘露醇；復(fù)蘇3h后，分別涂紅霉素抗性板，37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，其中，紅霉素(erm)濃度為10μg/ml。

對篩選得到的轉(zhuǎn)化子，采用菌落pcr的方式進行驗證，所用的引物序列見下。

上游引物1p-f：cacccttgatagccttactatacctaac

下游引物1p-r：gatgttatcagaagggtaagaagg

反應(yīng)體系如下：

pcr程序如下：

1)98℃，2min

2)98℃，30sec

3)52℃，30sec

4)72℃，30sec

5)循環(huán)從2)到4)，30次

6)72℃，5min

7)4℃，保存。

經(jīng)驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子命名為cnp1，然后采取上述相同的轉(zhuǎn)化方法，用線性片段tpu2轉(zhuǎn)化cnp1，紅霉素和卡那霉素雙抗性板篩選，其中，卡那霉素(kan)的濃度為10μg/ml。

對篩選得到的轉(zhuǎn)化子，采用菌落pcr的方式進行驗證，所用的引物序列見下。

上游引物2p-f：cggacggactctacctcaaatgc

下游引物2p-r：gcgttagaaacagcaggttgagc

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序和cnp1的驗證方法一致。

經(jīng)驗證為陽性的轉(zhuǎn)化子命名為cnp2ek，然后采用上述相同的方法，用cre酶表達質(zhì)粒pmk4-cre轉(zhuǎn)化cnp2ek，氯霉素抗性板篩選，其中，氯霉素(cm)的濃度為5μg/ml。

對于篩選得到的轉(zhuǎn)化子，采用傳代的方式丟失質(zhì)粒pmk4-cre，取10μl菌液接種到新鮮的3ml液體lb培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)，每隔8h轉(zhuǎn)接1次，總共轉(zhuǎn)接5次，然后取培養(yǎng)液梯度稀釋至10⁶倍，涂lb平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃、200r/min培養(yǎng)；待長出新鮮菌落，分別印章至氯霉素、紅霉素和卡那霉素平板進行抗性反篩。在3種抗性平板上均不能生長的菌，其在無抗lb平板上對應(yīng)的菌落為消除質(zhì)粒的菌株，為目的菌株。再對其進行菌落pcr驗證，第一對引物為1p-f/1p-r，第二對引物為2p-f/2p-r。經(jīng)驗證均為陽性的菌株，命名為cnp2，為帶有兩份拷貝pulb的無抗的普魯蘭酶生產(chǎn)菌株。

實施例2：重組枯草芽孢桿菌cnp2的發(fā)酵產(chǎn)酶

以重組枯草芽孢桿菌cnp2為生產(chǎn)菌種，做搖瓶發(fā)酵：用接種環(huán)挑取重組枯草芽孢桿菌cnp2接種到裝有25ml液體培養(yǎng)基的200ml擋板瓶中，37℃、200r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，培養(yǎng)基的主要組分為玉米漿、麥芽糖漿、葡萄糖、酵母粉和無機鹽離子等。發(fā)酵20h取樣測定酶活，普魯蘭酶酶活測定方法為：取1.0ml的ph=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制酶樣或稀釋樣品（對照組為沸水浴滅活的樣品），將其加到1.0ml0.5%的普魯蘭多糖溶液中，于60℃水浴鍋中水浴30min，再加入3,5-二硝基水楊酸溶液（dns）3.0ml，沸水浴10min，取出后流水冷卻，于550nm測吸光值。一個酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘分解普魯蘭多糖釋放出1μmol葡萄糖所需的酶量。測得的搖瓶發(fā)酵20h的酶活力約為225u/ml。

采用上罐補料的方式進行發(fā)酵，在20l罐中，以流加麥芽糖漿和氨水控制發(fā)酵罐的ph在5.80左右，通風(fēng)攪拌，溶氧控制為30%左右，還原糖控制為10g/l左右。取樣并測定酶活，普魯蘭酶的活力隨發(fā)酵時間變化曲線的結(jié)果如圖例2所示。其中，在32h左右，酶活力超過1000u/ml。

上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實施例，本發(fā)明并不僅限于實施例的內(nèi)容。對于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說，在本發(fā)明技術(shù)方案的構(gòu)思范圍內(nèi)可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>白銀賽諾生物科技有限公司

<120>高產(chǎn)普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>108

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>spchit

<400>1

atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60

acagcttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct108

<210>2

<211>99

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>spamyl

<400>2

atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60

tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99

<210>3

<211>2460

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pulb

<400>3

caacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttct60

caacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaac120

aaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggc180

acattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttctt240

aaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaa300

tacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaac360

cttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgct420

gtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaa480

acagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatc540

caaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaa600

tactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaa660

gtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgct720

gttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaac780

caagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtaca840

gctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgat900

cttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatc960

gaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggc1020

atgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataac1080

gttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacct1140

gttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgat1200

cctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgt1260

atcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatg1320

gatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcct1380

gaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaac1440

gaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgg1500

gttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagat1560

acaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggc1620

gaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgct1680

caaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctct1740

gttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatc1800

aaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaac1860

tacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaac1920

gattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatct1980

caaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgat2040

aactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaatac2100

cctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttc2160

cgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaac2220

acagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgtt2280

atctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatc2340

aacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaa2400

gttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataa2460

<210>4

<211>5885

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>tpu1

<400>4

caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60

atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120

gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180

ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240

ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300

ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360

ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420

atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480

gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540

aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600

attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagatcgattgtttgagaaaagaagaagacca660

taaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctg720

tgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgacattattttactgatatgtataatataattt780

gtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttgtt840

gcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaacgc900

ccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaaccttc960

ttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaatg1020

acatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgtga1080

attatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttacaag1140

tagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatgaa1200

tatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttctatt1260

ggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggatgc1320

ctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaatc1380

attttatcagtttgaaaattatgtattatgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggc1440

tggatgttccttcttgctttccttcttacagcttctcttttctgccctacaggccaacat1500

gctaaagctgctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagtt1560

cttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcat1620

gatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttaca1680

gctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataac1740

cataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcct1800

gaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccct1860

tctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatc1920

ccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgat1980

tcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttct2040

catacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagtt2100

cttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaac2160

gctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaac2220

tctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgg2280

gaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaa2340

ggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgt2400

ggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatc2460

acacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatc2520

gattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcaca2580

aaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacat2640

gttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatac2700

aactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgct2760

aacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcat2820

atcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttc2880

gataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggc2940

tctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgat3000

tctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggct3060

cttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggc3120

atcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaactt3180

cttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaac3240

ggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggc3300

cttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcct3360

ggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgct3420

caatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagct3480

atcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtaca3540

aaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtct3600

cgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtctt3660

gatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcctt3720

aactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatgg3780

ggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttct3840

ggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagct3900

gaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcct3960

tctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaaggatccaagct4020

tgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctcta4080

cgaccaaaactataaaacctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagat4140

aaatctctcatatcttttattcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatca4200

ctcatcatgttcatatttatcagagctcgtgctataattatactaattttataaggagga4260

aaaaatatgggcatttttagtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaa4320

aaataagtggttataatgaatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggaggg4380

aaataatgaacgagaaaaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataata4440

tagataaaataatgacaaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggct4500

caggaaaaggccattttacccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattg4560

aaatagaccataaattatgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttcc4620

aagttttaaacaaggatatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatat4680

atggtaatataccttataacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagta4740

tagctaatgagatttatttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaa4800

aacgctcattggcattacttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttc4860

caagagaatattttcatcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaa4920

aaaaatcaagaatatcacacaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatggg4980

ttaacaaagaatacaagaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatg5040

caggaattgacgatttaaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagct5100

ataaattatttaataagtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttc5160

gtgtgcctattttttgtgaattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatag5220

catacattatacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccatt5280

ttggctctttaccctctccttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattc5340

tgtgaatttattgtaatagatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgatt5400

ttatctctatttaggtatatcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattt5460

tcatacagaaaagaacgaaaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgc5520

ttttttaggttaaatgctcctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaat5580

gacctgcgtgtgcttccgtgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatga5640

tgataaaagtattctgaaaaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattg5700

agagggaggaagaaataagatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccat5760

tgcgccgctgtttaaccaatatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggc5820

agaggcttttttgaaagctcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaaga5880

aaatg5885

<210>5

<211>6055

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>tpu2

<400>5

atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60

tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120

gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180

aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240

tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300

tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360

tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420

atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480

tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcatagaatct540

aatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgat600

gaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaa660

cttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgctttttttg720

ttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttgaattgtaac780

gcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgtttgaacct840

tcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaactatagaa900

tgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaacttgttcatgt960

gaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaatacattgttaca1020

agtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagtattaaatg1080

aatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacatatttttcta1140

ttggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaaggagggat1200

gcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggatttatgaaaaa1260

tcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcg1320

ttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcgaagttgcta1380

aagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgtta1440

aactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgata1500

cagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttc1560

ttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataaccataaca1620

cacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggca1680

actaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttacccttctgata1740

acatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacatcccttcta1800

cacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctg1860

gcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacac1920

tttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgatt1980

cttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaa2040

cattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaactctgcta2100

caggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagcta2160

cagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctcta2220

cacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatga2280

tcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatatcacaccta2340

aaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattcta2400

actctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggcc2460

ctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaac2520

ttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggg2580

gctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggca2640

caacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcg2700

ttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaa2760

tcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacggctctggca2820

caggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctctta2880

aattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttg2940

gcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctc3000

tttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaa3060

aaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttg3120

atggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacag3180

atgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaa3240

caatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatcta3300

accctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgtta3360

tgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcg3420

gcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaag3480

ctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatc3540

ctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctc3600

ctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaaca3660

tcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaat3720

gggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggct3780

ctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatg3840

gcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaagggatccaagcttgcggc3900

cgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgttgaagattag3960

atgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagct4020

gaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctga4080

aaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagat4140

tgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattgg4200

tgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtg4260

tgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggt4320

ggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcaga4380

ttggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggata4440

cttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgat4500

ttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgt4560

gcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccat4620

gttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagc4680

agttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg4740

tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattca4800

ggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaac4860

gatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtatt4920

agtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggt4980

acatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcgacatggatgag5040

cgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctct5100

tttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccggggaaaagccaaat5160

aggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatagatttca5220

caatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaacaaccagatatt5280

tatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcatcctctgtctc5340

tatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctggagcgggttc5400

atttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtagctgtgct5460

ttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattacaaaacaggtgt5520

aacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcgaatacaacaaa5580

agccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatggagatcaattc5640

acaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaacgaa5700

cagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatccagcgtcggc5760

caaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgcttatatctataa5820

acatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaaccaatgactaa5880

aaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaaccaacgcaaa5940

agtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctggctttgatta6000

cgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttccccattga6055

<210>6

<211>884

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pamy-cryiii-spamyl

<400>6

atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60

attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120

ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180

aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240

ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300

acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360

acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420

tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480

tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540

atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600

tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660

taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720

tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780

ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840

cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct884

<210>7

<211>856

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pxyla-cryiii-spchit

<400>7

tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60

tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120

tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180

tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240

attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300

ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360

ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420

gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480

ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540

attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600

tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660

ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720

atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780

attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840

agttgctaaagctgct856

<210>8

<211>2507

<212>dna

<213>敲除apre基因的同源片段

<400>8

caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60

atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120

gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180

ccggattttatgtcattgataagctttacaagcggacggttcgcctaacccgcagcatgt240

ttcatttagaagggcggcatgatcttgcggcacttccgctgttattgcttttgttttctg300

ttttgagctttgcggttacgcctttttctaatgctgtctcgcgttatcaggagaataagg360

ctgaccagtatgggatcgagttgacagagaacagagaagccgctgttaaaacgtttcagg420

atttggccgtgacggggctgagccaggttgatcctccggtgcttgtgaagattttcagag480

gcagccatccgtcgatcatggaacggattcaacatgcggagaaagaagagaatgcgccgg540

aacatcaggatgctgacaaataaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttact600

attattgtgcagctgcttgcctgcactgcagggatccaagcttgcggccgctaccgttcg660

tatagcatacattatacgaagttatttaaaccgtgtgctctacgaccaaaactataaaac720

ctttaagaactttctttttttacaagaaaaaagaaattagataaatctctcatatctttt780

attcaataatcgcatccgattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatattt840

atcagagctcgtgctataattatactaattttataaggaggaaaaaatatgggcattttt900

agtatttttgtaatcagcacagttcattatcaaccaaacaaaaaataagtggttataatg960

aatcgttaataagcaaaattcatataaccaaattaaggagggaaataatgaacgagaaaa1020

atataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgacaa1080

atataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaaggccatttta1140

cccttgaattagtaaagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaattat1200

gcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaaggata1260

tattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatatggtaatataccttata1320

acataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctaatgagatttatt1380

taatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcattac1440

ttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttcatc1500

ctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaagtagaaaaaaatcaagaatatcac1560

acaaagataaacaaaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaaga1620

aaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgatttaa1680

acaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataagt1740

aagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtgcctattttttgtg1800

aattgattatcgatcttttgcgccatggataacttcgtatagcatacattatacgaacgg1860

tacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctctttaccctctc1920

cttttaaaaaaattcagagtagacttacttaaaagactattctgtgaatttattgtaata1980

gatggaataatattttagtagacccatttttttgagatgattttatctctatttaggtat2040

atcatctctcgctatttccgtagagactcgaaataactattttcatacagaaaagaacga2100

aaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgcttttttaggttaaatgct2160

cctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaatgacctgcgtgtgcttccg2220

tgagaacaatggatattatcgtgatattttttcaaagcatgatgataaaagtattctgaa2280

aaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattgagagggaggaagaaataa2340

gatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccattgcgccgctgtttaacca2400

atatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggcagaggcttttttgaaagc2460

tcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaagaaaatg2507

<210>9

<211>2705

<212>dna

<213>敲除amye基因的同源片段

<400>9

atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60

tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120

gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180

aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240

tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300

tggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaa360

tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420

atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480

tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcagggatcca540

agcttgcggccgctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcgggccagtttgt600

tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagtt660

attaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa720

aattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaa780

gaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgtta840

aggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattg900

agatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtg960

agtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcagg1020

tggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgatt1080

caggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttcc1140

acgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgta1200

atattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatgg1260

caggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtct1320

taactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg1380

taatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctgga1440

atgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatac1500

cattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttc1560

tcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacatta1620

tacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcga1680

catggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggca1740

gtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccgggga1800

aaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtca1860

atagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaaca1920

accagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcat1980

cctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctg2040

gagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctg2100

tagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattaca2160

aaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcga2220

atacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatgg2280

agatcaattcacaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaa2340

aaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatc2400

cagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgctt2460

atatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaac2520

caatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaa2580

ccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctg2640

gctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttcccc2700

attga2705

<210>10

<211>3378

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pulb1

<400>10

atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60

attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120

ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180

aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240

ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300

acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360

acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420

tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480

tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540

atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600

tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660

taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720

tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780

ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840

cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgctcaacctgctgtttcta900

acgcttaccttgatgcttctaaccaagttcttgttaaactttctcaacctttcacacttg960

gcgaaggctcttctggcttcacagttcatgatgatacagctaacaaagatatccctgtta1020

catctgtttctgatgctaaccaagttacagctgttcttgctggcacattccaacatatct1080

tcggcggctctgattgggctcctgataaccataacacacttcttaaaaaagttaactcta1140

acctttaccaattctctggcaaccttcctgaaggcaactaccaatacaaagttgctctta1200

acgattcttggaacaacccttcttacccttctgataacatcaaccttacagttcctgctg1260

gcggcgctcatgttacattctcttacatcccttctacacatgctgtttacgatacaatca1320

acaaccctaacgctgatcttcaagttgattcttctggcgttaaaacagatcttgttgctg1380

ttacacttggcgaaaaccctgatgtttctcatacactttctatccaaacagaagattacc1440

aagctggccaagttatccctcgtaaagttcttgattcttctcaatactactactctggcg1500

atgatcttggcaacacatacacaaaaaacgctacaacattcaaagtttgggctcctacat1560

ctacacaagttaacgttcttctttacaactctgctacaggcgctgttacaaaaacagttc1620

ctatgacagcttctggccatggcgtttgggaagctacagttaaccaagatcttgaaaact1680

ggtactacatgtacgaagttacaggccaaggctctacacgtacagctgttgatccttacg1740

ctacagctatcgctcctaacggcacacgtggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatc1800

ctgctggctgggaatctgataaacatatcacacctaaaaacatcgaagatgaagttatct1860

acgaaatggatgttcgtgatttctctatcgattctaactctggcatgaaaaacaaaggca1920

aataccttgctcttacagaaaaaggcacaaaaggccctgataacgttaaaacaggcgttg1980

attctcttaaacaacttggcatcacacatgttcaacttcaacctgttttcgctttcaact2040

ctgttaacgaaaacgatcctacacaatacaactggggctacgatcctcgtaactacaacg2100

ttcctgaaggccaatacgctacaaacgctaacggcacaacacgtatcaaagaattcaaag2160

aaatggttctttctcttcatcaagatcatatcggcgttaacatggatgttgtttacaacc2220

atacattcgctacacaaatctctgatttcgataaaatcgttcctgaatactactaccgta2280

cagatgatgctggcaactacacaaacggctctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaac2340

gtcctatggttcaaaaattcatcatcgattctcttaaattctgggttaacgaataccatg2400

ttgatggcttccgtttcgatcttatggctcttcttggcaaagatacaatgtctaaagctg2460

ctacacaacttcatgctatcgatcctggcatcgctctttacggcgaaccttggacaggcg2520

gcacatctgctcttcctgctgatcaacttcttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcg2580

ttgctgttttcaacgataaccttcgtaacggccttgatggctctgttttcgattcttctg2640

ctcaaggcttcgctacaggcgctacaggccttacagatgctatcaaaaacggcgttgaag2700

gctctatcaacgatttcacagcttctcctggcgaaacaatcaactacgttacatctcatg2760

ataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaacgattctgaagctgatc2820

gtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatctcaaggcatccctttca2880

tgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgataactcttacaacgctg2940

gcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaataccctgatgttttcaact3000

actactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttccgtatgacaacagcta3060

acgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaacacagttgcttacgaac3120

tttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgttatctacaaccctaaca3180

aaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatcaacgctacatctggca3240

aagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaagttcctggcatctcta3300

tgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataaagaagcaggttcctcc3360

atacctgcttctttttaa3378

<210>11

<211>3350

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pulb2

<400>11

tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60

tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120

tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180

tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240

attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300

ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360

ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420

gttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaatatataatatgccaataca480

ttgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttactatacctaacatgatgtagt540

attaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgacttatttataatcattacata600

tttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgtataaattatttatcttgaaa660

ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720

atgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgcttatcaacaaatctaaaaa780

attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840

agttgctaaagctgctcaacctgctgtttctaacgcttaccttgatgcttctaaccaagt900

tcttgttaaactttctcaacctttcacacttggcgaaggctcttctggcttcacagttca960

tgatgatacagctaacaaagatatccctgttacatctgtttctgatgctaaccaagttac1020

agctgttcttgctggcacattccaacatatcttcggcggctctgattgggctcctgataa1080

ccataacacacttcttaaaaaagttaactctaacctttaccaattctctggcaaccttcc1140

tgaaggcaactaccaatacaaagttgctcttaacgattcttggaacaacccttcttaccc1200

ttctgataacatcaaccttacagttcctgctggcggcgctcatgttacattctcttacat1260

cccttctacacatgctgtttacgatacaatcaacaaccctaacgctgatcttcaagttga1320

ttcttctggcgttaaaacagatcttgttgctgttacacttggcgaaaaccctgatgtttc1380

tcatacactttctatccaaacagaagattaccaagctggccaagttatccctcgtaaagt1440

tcttgattcttctcaatactactactctggcgatgatcttggcaacacatacacaaaaaa1500

cgctacaacattcaaagtttgggctcctacatctacacaagttaacgttcttctttacaa1560

ctctgctacaggcgctgttacaaaaacagttcctatgacagcttctggccatggcgtttg1620

ggaagctacagttaaccaagatcttgaaaactggtactacatgtacgaagttacaggcca1680

aggctctacacgtacagctgttgatccttacgctacagctatcgctcctaacggcacacg1740

tggcatgatcgttgatcttgctaaaacagatcctgctggctgggaatctgataaacatat1800

cacacctaaaaacatcgaagatgaagttatctacgaaatggatgttcgtgatttctctat1860

cgattctaactctggcatgaaaaacaaaggcaaataccttgctcttacagaaaaaggcac1920

aaaaggccctgataacgttaaaacaggcgttgattctcttaaacaacttggcatcacaca1980

tgttcaacttcaacctgttttcgctttcaactctgttaacgaaaacgatcctacacaata2040

caactggggctacgatcctcgtaactacaacgttcctgaaggccaatacgctacaaacgc2100

taacggcacaacacgtatcaaagaattcaaagaaatggttctttctcttcatcaagatca2160

tatcggcgttaacatggatgttgtttacaaccatacattcgctacacaaatctctgattt2220

cgataaaatcgttcctgaatactactaccgtacagatgatgctggcaactacacaaacgg2280

ctctggcacaggcaacgaaatcgctgctgaacgtcctatggttcaaaaattcatcatcga2340

ttctcttaaattctgggttaacgaataccatgttgatggcttccgtttcgatcttatggc2400

tcttcttggcaaagatacaatgtctaaagctgctacacaacttcatgctatcgatcctgg2460

catcgctctttacggcgaaccttggacaggcggcacatctgctcttcctgctgatcaact2520

tcttacaaaaggcgctcaaaaaggcatgggcgttgctgttttcaacgataaccttcgtaa2580

cggccttgatggctctgttttcgattcttctgctcaaggcttcgctacaggcgctacagg2640

ccttacagatgctatcaaaaacggcgttgaaggctctatcaacgatttcacagcttctcc2700

tggcgaaacaatcaactacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgc2760

tcaatctaaccctaacgattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagc2820

tatcgttatgacatctcaaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtac2880

aaaaggcggcaacgataactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtc2940

tcgtaaagctcaataccctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtct3000

tgatcatcctgctttccgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattcct3060

taactctcctgaaaacacagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatg3120

gggcaacatcgttgttatctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttc3180

tggcaaatgggaaatcaacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagc3240

tgaaggctctgttcaagttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctcc3300

ttctgatggcaaataaagaagcaggttcctccatacctgcttctttttaa3350

<210>12

<211>6932

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pmk4-cre

<400>12

gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca60

cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagct120

cactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaat180

tgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgg240

ctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactga300

aattatgggtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaaga360

agatttatttgaggtagcccttgcctacctagcttccaagaaagatatcctaacagcaca420

agagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaat480

tttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagcg540

gataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaa600

tttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacat660

gttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccg720

gtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaaga780

tgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagca840

acatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacag900

caatgctgtttcactggttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacg960

tgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatgga1020

aaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacac1080

cctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacgg1140

tgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtaga1200

gaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgt1260

agctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgcc1320

atctgccaccagccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcg1380

attgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacag1440

tgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcat1500

gcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatag1560

tgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgattaggcatgcgaattcactgg1620

ccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttg1680

cagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgccctt1740

cccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgc1800

atctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccg1860

catagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtc1920

tgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcaga1980

ggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttt2040

tataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaa2100

atgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctca2160

tgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattc2220

aacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctc2280

acccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggtt2340

acatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgtt2400

ttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacg2460

ccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtact2520

caccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctg2580

ccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccga2640

aggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttggg2700

aaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaa2760

tggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaac2820

aattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttc2880

cggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca2940

ttgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggga3000

gtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgatta3060

agcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttc3120

atttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccatatccttctttttctgaaccgacttc3180

tcctttttcgcttctttattccaattgctttattgacgttgagcctcggaacccttaaca3240

atcccaaaacttgtcgaatggtcggcttaatagctcacgctatgccgacattcgtctgca3300

agtttagttaagggttcttctcaacgcacaataaattttctcggcataaatgcgtggtct3360

aatttttatttttaataaccttgatagcaaaaaatgccattccaatacaaaaccacatac3420

ctataatcgataaccacataacagtcataaaaccactcctttttaacaaactttatcaca3480

agaaatatttaaattttaaatgcctttattttgaattttaaggggcattttaaagattta3540

ggggtaaatcatatagttttatgcctaaaaacctacagaagcttttaaaaagcaaatatg3600

agccaaataaatatattctaattctacaaacaaaaatttgagcaaattcagtgtcgattt3660

tttaagacactgcccagttacatgcaaattaaaattttcatgattttttatagttcctaa3720

cagggttaaaatttgtataacgaaagtataatgtttatataacgttagtataataaagca3780

ttttaacattatacttttgataatcgtttatcgtcgtcatcacaataacttttaaaatac3840

tcgtgcataattcaacagctgacctcccaataactacatggtgttatcgggaggtcagct3900

gttagcacttatattttgttattgttcttcctcgatttcgtctatcattttgtgattaat3960

ttctcttttttcttgttctgttaagtcataaagttcactagctaaatactctttttgttt4020

ccaaatataaaaaatttgatagatatattcggttggatcaatttcttttaagtaatctaa4080

atccccattttttaatttctttttagcctctttaaataatcctgaataaactaatacctg4140

tttacctttaagtgatttataaaatgcatcaaagactttttgatttattaaataatcact4200

atctttaccagaatacttagccatttcatataattctttattattattttgtcttatttt4260

ttgaacttgaacttgtgttatttctgaaatgcccgttacatcacgccataaatctaacca4320

ttcttgttggctaatataatatcttttatctgtgaaatacgatttatttactgcaattaa4380

cacatgaaaatgaggattataatcatctctttttttattatatgtaatctctaacttacg4440

aacatatccctttataacactacctactttttttctctttataagttttctaaaagaatt4500

attataacgttttatttcattttctaattcatcactcattacattaggtgtagtcaaagt4560

taaaaagataaactcctttttctcttgctgcttaatatattgcatcatcaaagataaacc4620

caatgcatcttttctagcttttctccaagcacagacaggacaaaatcgatttttacaaga4680

attagctttatataatttctgtttttctaaagttttatcagctacaaaagacagaaatgt4740

attgcaatcttcaactaaatccatttgattctctccaatatgacgtttaataaatttctg4800

aaatacttgatttctttgttttttctcagtatacttttccatgttataacacataaaaac4860

aacttagttttcacaaactatgacaataaaaaaagttgctttttcccctttctatgtatg4920

ttttttactagtcatttaaaacgatacattaataggtacgaaaaagcaactttttttgcg4980

cttaaaaccagtcataccaataacttaagggtaactagcctcgccggcaatagttaccct5040

tattatcaagataagaaagaaaaggatttttcgctacgctcaaatcctttaaaaaaacac5100

aaaagaccacattttttaatgtggtcttttattcttcaactaaagcacccattagttcaa5160

caaacgaaaattggataaagtgggatatttttaaaatatatatttatgttacagtaatat5220

tgacttttaaaaaaggattgattctaatgaagaaagcagacaagtaagcctcctaaattc5280

actttagataaaaatttaggaggcatatcaaatgaactttaataaaattgatttagacaa5340

ttggaagagaaaagagatatttaatcattatttgaaccaacaaacgacttttagtataac5400

cacagaaattgatattagtgttttataccgaaacataaaacaagaaggatataaatttta5460

ccctgcatttattttcttagtgacaagggtgataaactcaaatacagcttttagaactgg5520

ttacaatagcgacggagagttaggttattgggataagttagagccactttatacaatttt5580

tgatggtgtatctaaaacattctctggtatttggactcctgtaaagaatgacttcaaaga5640

gttttatgatttatacctttctgatgtagagaaatataatggttcggggaaattgtttcc5700

caaaacacctatacctgaaaatgctttttctctttctattattccatggacttcatttac5760

tgggtttaacttaaatatcaataataatagtaattaccttctacccattattacagcagg5820

aaaattcattaataaaggtaattcaatatatttaccgctatctttacaggtacatcattc5880

tgtttgtgatggttatcatgcaggattgtttatgaactctattcaggaattgtcagatag5940

gcctaatgactggcttttataatatgagataatgccgactgtactttttacagtcggttt6000

tctaatgtcactaacctgccccgttagttgaagaaggtttttatattacagctccagatc6060

taggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttc6120

cactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctg6180

cgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccg6240

gatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca6300

aatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccg6360

cctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg6420

tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctga6480

acggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatac6540

ctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtat6600

ccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcc6660

tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtga6720

tgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc6780

ctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtg6840

gataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgag6900

cgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga6932