本發(fā)明涉及一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用，屬于基因工程領域。

二、

背景技術：

右旋糖酐(dextran)，又稱葡聚糖，是蔗糖經腸膜狀明串珠菌發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由α(1-6)糖苷鍵連接，伴有少量α(1-3)和α(1-4)糖苷鍵，也可以通過工程菌生產的右旋糖酐蔗糖酶制備。因其具有安全、無毒、生物相容性、結構特異性等多種優(yōu)點，在食品、醫(yī)學、色譜分析、材料等多個領域都有了廣泛的應用。不同結構的右旋糖酐其物理化學性質都有較大的差異，根據其功能都有其特定的用途，例如由明串珠菌發(fā)酵的95％α(1-6)糖苷鍵的右旋糖酐70是目前公認的優(yōu)良血漿替代品，由面包酵母發(fā)酵的右旋糖酐可作為食品添加劑改善食品的口感。右旋糖酐由于其超高的分子量，和鏈上的一些活性官能團，可以吸附分散體系中微粒，形成架橋作用，將分散體系中的微粒絮凝沉降下來，右旋糖酐或者改性右旋糖酐(接枝不同的官能團)在絮凝劑方面有很大的應用價值。

目前國內制糖工業(yè)采用的傳統(tǒng)澄清手段主要是采用石灰和二氧化硫為主要清凈劑。混合汁經預灰、一次加熱、硫熏中和、二次加熱后入沉降器，分離出清凈汁和泥汁，泥汁經過濾得濾清汁，它與清凈汁混合再經加熱、多效蒸發(fā)成糖漿，再經糖漿硫熏得清糖漿作結晶原料?；蛘咭允液投趸紴橹饕鍍魟┑恼嶂鍍舴āＦ涔に嚵鞒虨椋夯旌现浺淮渭訜?、預灰，然后在加入過量的石灰乳的同時通入二氧化碳進行一次碳酸飽充，使產生大量鈣鹽沉淀，隨即加熱、過濾得一碳清汁，再經第二次碳酸飽充，然后加熱、過濾，得二碳清汁，又經硫熏、加熱、蒸發(fā)成糖漿。然后進行硫漂使pH降至5.8～6.4，供結晶之用。大量的二氧化硫和石灰石的使用，不僅需要投入大量資金，同時對環(huán)境和人體也會有很大的影響和危害。而使用蔗糖為底物合成的右旋糖酐作為澄清劑，將會使澄清步驟綠色，無污染，更加節(jié)約資源。

分析發(fā)現(xiàn)，要完善右旋糖酐作為絮凝劑的生產工藝，有2個關鍵性問題尚待解決：①因為右旋糖酐結構多樣性，其功能也是多樣性的，首先要選擇分子量和支鏈化程度適宜的右旋糖酐用作絮凝劑或其絮凝劑前提的研究。②通過基因手段理性設計右旋糖酐技術，要想得到不同結構的右旋糖酐，就要從其上游，右旋糖酐蔗糖酶基因的改造來獲得結構特異的右旋糖酐。通過對右旋糖酐基因序列和其表達蛋白三維結構分析，設計合理的基因序列，獲得所需結構的右旋糖酐。

迄今為止，有關于改造右旋糖酐蔗糖酶基因生產右旋糖酐應用于絮凝劑的研究在國內外文獻未見報道。目前右旋糖酐主要應用于血漿替代品，文獻中大多是對右旋糖酐蔗糖酶催化機理，以及蛋白結構分析等基礎研究報道，應用方面大多是對原始菌株表達的右旋糖酐應用研究。通過分子生物學手段特異性的改造右旋糖酐，國內外均為見報道?；蚋脑焓侄沃苽淠康挠倚囚I(yè)將是以后國際研究熱點和解決問題的關鍵。

三、

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用，通過該酶從而改良右旋糖酐性質，使其更適合絮凝劑或絮凝劑前提的研究。

本發(fā)明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌是以右旋糖酐蔗糖酶基因(Genbank No.DQ345760)為模板，去除3’端的1584bp堿基、保留上游3000bp堿基dex-YG-bMU01后重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌。

本發(fā)明涉及保藏菌株為高枝化型重組右旋糖酐蔗糖酶工程菌dex-YG-bMU01基因工程菌，分類命名為高枝化型重組右旋糖酐蔗糖酶大腸桿菌BL21(DE3)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏日期2016年05月12日，保藏編號CGMCC No.12437。

本發(fā)明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法，包括引物設計、重組質粒構建和宿主菌轉化各單元過程：

所述引物設計是根據右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)序列和載體pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer 5軟件設計引物如下：

上游引物選擇BamH I作為酶切位點：

5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’

下游引物選擇Hind III作為酶切位點：

5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’；

所述重組質粒構建是以右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)為模板，利用PCR擴增技術，得到含BamH I和Hind III酶切位點截短后的基因克隆片段dex-YG-bMU01；將上述的基因克隆片段用BamH I和Hind III雙酶切，酶切產物連接到載體pET-28a-(+)的雙酶切位點上，得到重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01；

所述宿主菌轉化是將重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)(購自全式金生物公司)中，經過卡那霉素抗性篩選、酶切、菌液PCR和DNA測序驗證后，獲得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。

實施例中提供了利用該基因工程菌株發(fā)酵表達右旋糖酐蔗糖酶，利用該酶生產右旋糖酐 以及右旋糖酐的絮凝效果考量的具體方法。

通過本發(fā)明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌制備右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括如下步驟：

將基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5％的接種量(體積)接種到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，轉速250r/min，35～40℃培養(yǎng)16～18小時；從上述培養(yǎng)液中吸取2mL加入至200mL的A培養(yǎng)基中，放置于37℃下，220～240r/min(往復式)或者260～280r/min(回轉式)搖床培養(yǎng)，當富集培養(yǎng)的菌液用蒸餾水稀釋10倍后的OD₆₀₀在0.20～0.24時(約3.5h之后)即可加入500μL IPTG開始誘導產酶，保持25℃，220～230r/min(往復式)或者250～260r/min(回轉式)搖床誘導發(fā)酵4-6小時，將誘導發(fā)酵后的菌懸液在0℃下，6000r/min離心12～15min，一支離心管對應一瓶菌懸液，然后加入蒸餾水振蕩清洗，再次離心；向每支離心管中加入20mL pH值5.4的醋酸-醋酸鈣緩沖液震蕩搖勻，外加冰水浴，超聲破碎15min，離心分離，上清液即為粗酶液，酶活80-100U/mL。

所述A培養(yǎng)基中各組分及濃度為：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸鉀10g/L，Na₂HPO₄ 12H₂O 17.105g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄ 7H₂O 0.1mM/L。

利用獲得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，包括如下步驟：

按100g蔗糖/800ml緩沖液(pH值5.4的醋酸-醋酸鈣)的比例配置反應液，酶用量按酶活2U/ml比例加入，將混合液在25℃下攪拌反應24-28小時，將反應液過濾，以2-3倍體積的乙醇醇沉，洗滌，干燥后得到右旋糖酐。

本發(fā)明構建的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌，合成的右旋糖酐支鏈化程度提高，其中的α(1-3)比例從原來的5％提高到了17％，其水溶液黏度增加，絮凝效果方面得到明顯改良，其產酶仍然保持了較高的活性。

四、附圖說明

圖1是本發(fā)明蔗糖酶工程菌的構建示意圖。

圖2是本發(fā)明右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐催化原理。

圖3是野生型與突變株右旋糖酐核磁檢測對比圖。其中a為基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG發(fā)酵生產右旋糖酐核磁圖；b為基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01發(fā)酵生產右旋糖酐核磁圖。從5.2ppm左右處的質子峰可以看出分子改造的右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐α(1-3)比例從原有的5％提高到了17％。

五、具體實施方式

實施例1：重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01的構建

1、根據右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)序列和載體pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer5軟件設計引物如下：

上游引物選擇BamH I作為酶切位點：

5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’

下游引物選擇Hind III作為酶切位點：

5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’；

2、以右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)為模板，利用PCR擴增技術，得到含BamH I和Hind III酶切位點截短后的基因克隆片段；將上述的基因克隆片段用BamH I和Hind III酶切，酶切產品連接到載體pET-28a-(+)的雙酶切位點上，得到重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01：

①利用PCR技術獲得截短的基因片段：50μL的PCR反應體系分別加入10μL的Buffer、4μL的dNTP mixture、兩種引物Primer各2.5μL、DNA模板2μL、28μL的ddH₂O，最后加入1μL的polymerase。

②利用PCR儀進行擴增，反應條件：變性溫度98℃，10s；退火溫度60℃，15s；延伸溫度68℃，90s；以變性、退火、延伸過程為一個循環(huán)重復反應35個循環(huán)。

③利用takara的膠回收試劑盒對PCR擴增后截短片段進行純化回收，將純化回收后基因片段和空載pET-28a-(+)質粒載體分別用BamHI和HindIII在37℃條件下水浴2小時進行雙酶切，混合后加入T4DNA連接酶16℃過夜進行酶連，構建重組表達質粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01。

實施例2：右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01的構建

1、從-70℃冰箱中取200μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(購自北京全式金生物公司)懸液，置于冰上解凍。

2、加入實施例1制備的重組表達質粒的溶液，每100ul感受態(tài)細胞加入20ng質粒DNA，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。

3、42℃水浴中熱激90秒，熱激后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)混勻后，37℃培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗性基因。

5、將上述菌液搖勻后取100μL涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時，當菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16-24小時。挑選陽性菌落，菌液PCR進行驗證后，獲得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。

實施例3：右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01的表達

將工程菌株BL21(DE3)/dex-YG按0.5％的接種量接種到含50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16-18小時，轉接到優(yōu)化后的A培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，當OD值達到2.0時加入1mmol/ml的IPTG進行誘導，4-5小時后，進行破碎離心，對所取樣品做SDS-PAGE電泳分析，所表達出的右旋糖酐蔗糖酶的蛋白分子量約為130KDa與預測值一致。

所述A培養(yǎng)基中各組分及濃度為：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸鉀10g/L，Na₂HPO₄ 12H₂O 17.105g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄ 7H₂O 0.1mM/L。

實施例4：基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01發(fā)酵產酶

將基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5％的接種量接種到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，轉速250r/min，35～40℃培養(yǎng)，培養(yǎng)16～18小時，從上述種子培養(yǎng)液中吸取2mL菌液加入至200ml的A培養(yǎng)基中，放置于37℃下，220～240r/min(往復式)或者260～280r/min(回轉式)搖床培養(yǎng)。當富集培養(yǎng)的菌液用蒸餾水稀釋10倍后的OD₆₀₀在0.20～0.24時(約3.5h之后)即可加入500μL IPTG開始誘導產酶，保持25℃，220～230r/min(往復式)或者250～260r/min(回轉式)搖床誘導發(fā)酵4～6小時，將誘導發(fā)酵后的菌懸液在0℃下，6000r/min離心12～15min，一支離心管對應一瓶菌懸液，然后加入適量的蒸餾水振蕩清洗，再次離心。向每支離心管中加入20mL的pH值5.4的醋酸-醋酸鈣緩沖液震蕩搖勻，外加冰水浴，超聲破碎15min，離心分離，上清液即為粗酶液，酶活80-100U/mL。

所述A培養(yǎng)基中各組分及濃度為：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸鉀10g/L，Na₂HPO₄ 12H₂O 17.105g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄ 7H₂O 0.1mM/L。

實施例5：產品轉化

利用實施例4獲得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，具體步驟為：

1、酶反應體系配制：蔗糖100g，緩沖液800ml(pH5.4，5mmol/L的乙酸-乙酸鈣緩沖液)。

2、按2U/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

3、將上述混合液在25℃下攪拌反應24-28小時，催化獲得右旋糖酐。

4、將催化后的反應液進行過濾、醇沉洗滌、真空干燥即可得到大分子右旋糖酐，該右旋糖酐的α(1-3)比例明顯提升，溶解后的粘度明顯增加，絮凝效果得到改善。

實施例6：絮凝效果

1、稱取1g的高嶺土溶于250ml的水中，攪拌使其呈渾濁狀態(tài)。

2、加入200μL的1mmol/ml的Al₂(SO₄)₃和200μL的1mmol/ml的右旋糖酐溶液，快速攪拌1min，然后緩慢攪拌3min，靜置10min。

3、吸取一定量的上清液使用紫外分光光度計在550nm測量吸光值。

絮凝率的計算公式F＝(A₀-A)/A₀×100％

式中A₀為高嶺土混懸液吸光值，A為處理后上清液吸光值。絮凝率均達到90％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 合肥工業(yè)大學

<120> 一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用

<130> 一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1001

<212> PRT

<213> dex-YG-bMU01氨基酸序列

<220>

<221> SIGNAL

<222> (9)..(27)

<223>

<220>

<221> VARIANT

<222> (27)..(269)

<223>

<220>

<221> SITE

<222> (547)..(641)

<223>

<220>

<221> REPEAT

<222> (270)..(316)

<223>

<220>

<221> DOMAIN

<222> (270)..(1000)

<223>

<400> 1

Met Pro Phe Thr Glu Lys Val Met Arg Lys Lys Leu Tyr Lys Val Gly

1 5 10 15

Lys Ser Trp Val Val Gly Gly Val Cys Ala Phe Ala Leu Thr Ala Ser

20 25 30

Phe Ala Leu Ala Thr Pro Ser Val Leu Gly Asp Ser Ser Val Pro Asp

35 40 45

Val Ser Ala Asn Asn Val Gln Ser Ala Ser Asp Asn Thr Thr Asp Thr

50 55 60

Gln Gln Asn Thr Thr Val Thr Glu Glu Asn Asp Lys Val Gln Ser Ala

65 70 75 80

Ala Thr Asn Asp Asn Val Thr Thr Ala Ala Ser Asp Thr Thr Gln Ser

85 90 95

Ala Asp Asn Asn Val Thr Glu Lys Gln Ser Asp Asp His Ala Leu Asp

100 105 110

Asn Glu Lys Val Asp Asn Lys Gln Asp Ala Val Ala Gln Thr Asn Val

115 120 125

Thr Ser Lys Asn Glu Glu Ser Ala Val Ala Ser Thr Asp Thr Asp Pro

130 135 140

Ala Glu Thr Thr Thr Asp Glu Thr Gln Gln Val Ser Gly Lys Tyr Val

145 150 155 160

Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr Tyr Tyr Phe Asp Asp Gly Lys Asn Ala

165 170 175

Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp Asn Asn Ile Gln Tyr Phe Asp Glu Ser

180 185 190

Gly Lys Gln Val Lys Gly Gln Tyr Val Thr Ile Asp Asn Gln Thr Tyr

195 200 205

Tyr Phe Asp Lys Asp Ser Gly Asp Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ser Ile

210 215 220

Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe Asn Asp Glu Gly Gln Gln Ile Phe Asn

225 230 235 240

Gln Tyr Tyr Gln Ser Glu Asn Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Asp Lys

245 250 255

Gly His Ala Ala Thr Gly Ile Lys Asn Ile Glu Gly Lys Asn Tyr Tyr

260 265 270

Phe Asp Asn Leu Gly Gln Leu Lys Lys Gly Phe Ser Gly Val Ile Asp

275 280 285

Gly Gln Ile Met Thr Phe Asp Gln Glu Thr Gly Gln Glu Val Ser Asn

290 295 300

Thr Thr Ser Glu Ile Lys Glu Gly Leu Thr Thr Gln Asn Thr Asp Tyr

305 310 315 320

Ser Glu His Asn Ala Ala His Gly Thr Asp Ala Glu Asp Phe Glu Asn

325 330 335

Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Trp Tyr Arg Pro Thr Asp Ile

340 345 350

Leu Arg Asn Gly Thr Asp Trp Glu Pro Ser Thr Asp Thr Asp Phe Arg

355 360 365

Pro Ile Leu Ser Val Trp Trp Pro Asp Lys Asn Thr Gln Val Asn Tyr

370 375 380

Leu Asn Tyr Met Ala Asp Leu Gly Phe Ile Ser Asn Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Glu Thr Gly Asp Ser Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Ser Asn Tyr Val

405 410 415

Gln Lys Ser Ile Glu Met Lys Ile Cys Ala Gln Gln Ser Thr Glu Trp

420 425 430

Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala Phe Ile Val Thr Gln Pro Gln Trp Asn

435 440 445

Glu Thr Ser Glu Asp Met Ser Asn Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Leu

450 455 460

Thr Tyr Val Asn Ser Pro Leu Thr Pro Asp Ala Asn Ser Asn Phe Arg

465 470 475 480

Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr Asn Gln Thr Gly Glu Gln Ala Tyr Asn

485 490 495

Leu Asp Asn Ser Lys Gly Gly Phe Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val

500 505 510

Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu Tyr

515 520 525

Tyr Leu Met Asn Phe Gly Thr Ile Thr Ala Asn Asp Ala Asp Ala Asn

530 535 540

Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu

545 550 555 560

Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr Phe Lys Leu Ala Tyr Gly Val Asp Gln

565 570 575

Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln His Leu Ser Ile Leu Glu Asp Trp Ser

580 585 590

His Asn Asp Pro Leu Tyr Val Thr Asp Gln Gly Ser Asn Gln Leu Thr

595 600 605

Met Asp Asp Tyr Val His Thr Gln Leu Ile Trp Ser Leu Thr Lys Ser

610 615 620

Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met Gln Arg Phe Val Asp Tyr Tyr Met Val

625 630 635 640

Asp Arg Ser Asn Asp Ser Thr Glu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Tyr Ser

645 650 655

Phe Val Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln Thr Val Ile Ala Gln Ile

660 665 670

Val Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Val Glu Asn Ser Leu Ala Pro Thr Thr

675 680 685

Glu Gln Leu Ala Ala Ala Phe Lys Val Tyr Asn Glu Asp Glu Lys Leu

690 695 700

Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Met Ala Ser Ala Tyr Ala Met

705 710 715 720

Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu

725 730 735

Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Thr Lys Ser Pro Tyr Tyr Asp

740 745 750

Ala Ile Asn Thr Leu Leu Lys Ala Arg Val Gln Tyr Val Ala Gly Gly

755 760 765

Gln Ser Met Ser Val Gly Ser Asn Asp Val Leu Thr Ser Val Arg Tyr

770 775 780

Gly Lys Asp Ala Met Thr Ala Ser Asp Thr Gly Thr Ser Glu Thr Arg

785 790 795 800

Thr Glu Gly Ile Gly Val Ile Val Ser Asn Asn Ala Glu Leu Gln Leu

805 810 815

Glu Asp Gly His Ser Val Thr Leu His Met Gly Ala Ala His Lys Asn

820 825 830

Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Thr Thr Ala Asp Gly Leu Ala Tyr

835 840 845

Tyr Asp Thr Asp Glu Asn Ala Pro Val Ala Tyr Thr Asp Ala Asn Gly

850 855 860

Asp Leu Ile Phe Thr Asn Glu Ser Ile Tyr Gly Val Gln Asn Ala Gln

865 870 875 880

Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Trp Val Pro Ile Gly Ala Gln Gln Asp

885 890 895

Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ser Asp Lys

900 905 910

Val Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser Gln Val Ile Tyr Glu Gly

915 920 925

Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Asp Ser Ser Glu Tyr Thr Asn

930 935 940

Val Val Ile Ala Gln Asn Ala Asp Gln Phe Lys Gln Trp Gly Val Thr

945 950 955 960

Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser Ser Thr Asp Thr Ser Phe

965 970 975

Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp

980 985 990

Leu Gly Tyr Gly Thr Pro Thr Lys Ala

995 1000

<210> 2

<211> 3003

<212> DNA

<213> dex-YG-bMU01

<220>

<221> sig_peptide

<222> (27)..(81)

<223>

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3000)

<223>

<220>

<221> N_region

<222> (81)..(1590)

<223>

<220>

<221> variation

<222> (81)..(807)

<223>

<300>

<308> Genbank No. DQ345760

<309> 2011-04-12

<313> (1)..(3003)

<300>

<308> CGMCC No. 12437

<309> 2016-05-12

<313> (1)..(3003)

<400> 2

atgccattta cagaaaaagt aatgcggaaa aagctttata aagttgggaa aagttgggta 60

gttggtgggg tttgtgcttt tgcattaacc gcctcatttg ctttagcaac accaagtgtt 120

ttgggagaca gtagtgtacc tgatgtgagt gcgaataacg ttcaatctgc ttcagataat 180

acaacggata cgcagcagaa cactacggtt accgaagaaa atgataaagt acagtctgca 240

gctactaatg acaatgtaac aacagctgca agcgacacaa cgcaatctgc tgataataat 300

gtgacagaaa aacagtcaga tgatcatgca cttgataatg aaaaagtcga taacaaacaa 360

gatgcagtcg ctcaaactaa tgttactagc aaaaatgagg aatcagcagt tgcttcaact 420

gacactgatc ctgctgaaac gacaactgac gaaacacaac aagttagcgg caagtacgtt 480

gaaaaagacg gtagttggta ttattatttt gatgatggca aaaatgctaa aggtttatca 540

acgatagaca acaatattca atattttgac gagagtggta aacaagtcaa aggacagtat 600

gtcacaattg ataatcaaac atattatttt gataaggact caggtgatga gttaactggt 660

ctgcaaagca ttgatgggaa catagttgct tttaacgatg aagggcaaca aatttttaat 720

caatattacc aatctgaaaa tggtacaaca tactactttg atgataaagg acacgctgct 780

accggtatta agaatatcga gggcaaaaat tattattttg ataatcttgg gcaactaaaa 840

aaaggcttct ctggtgtgat tgatggtcaa ataatgacat ttgatcagga aacagggcaa 900

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attcaaaacg ggtatgcatt cacggatcgt tatgacttag gttatggcac accgacagaa 3000

taa 3003