本發(fā)明涉及一種人Gal-3重組蛋白誘導表達方法，屬于獲得肽的基因工程方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人半乳糖凝集素（galectin）蛋白家族是動物凝集素的一類，galectin具有大約135個氨基酸組成的高度保守的糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain, CRD），能特異性性識別并結(jié)合β-半乳糖苷。目前已從多種動物的組織和細胞中分離到15種galectin，其中半乳糖凝集素-3（galectin-3，簡稱Gal-3）是galectin家族中唯一的嵌合型代表。Gal-3在正常細胞（如上皮細胞和免疫細胞）和腫瘤細胞中都廣泛表達。作為一個多功能蛋白，Gal-3參與細胞生長、分化、細胞黏附、血管發(fā)生、腫瘤演進、細胞凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物過程。在20世紀80年代末90年代初，研究人員就發(fā)現(xiàn)Gal-3存在于結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤、頭頸部鱗癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、顱后窩腫瘤等腫瘤組織，并具有一定的診斷、預后、治療價值。Gal-3因此成為備受關(guān)注的腫瘤診斷和治療新靶點。目前，包括多糖、Gal-3C（N-端截短型Gal-3）、多肽、抗體、核酸類等多種抑制劑已相繼被研發(fā)出來，用于抗腫瘤或抗肺纖維化（IPF）等疾病治療。但如何實現(xiàn)人Gal-3的構(gòu)建、表達尚未見有報道。

基于此，做出本申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有人類半乳糖凝集素-3表達與合成過程中所存在的上述缺陷，本申請針對人Gal-3開放閱讀框的密碼子進行優(yōu)化和化學合成，成功構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET-25b-Gal3-Homo，并對其重組蛋白誘導表達條件進行了優(yōu)化。

為實現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術(shù)方案如下：

人Gal-3重組蛋白誘導表達方法，具體步驟如下：

（1）密碼子優(yōu)化：

對大腸桿菌20個氨基酸所對應的密碼子進行統(tǒng)計，然后對人Gal-3 ORF碼子優(yōu)化，將優(yōu)化的ORF進行化學合成并連接至pET-28b的Nde I和Xho I克隆位點上，制備重組質(zhì)粒pET-28b-Gal3-Homo；

（2）重組蛋白的誘導表達

①將pET-28b-Gal3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中，將轉(zhuǎn)化液在含卡那霉素Kanamycin的瓊脂盤上劃線后37℃培養(yǎng)12 h，獲得大量單菌落；

②在誘導重組蛋白前一天，挑取單菌落接種于1 mL LB培養(yǎng)液中，進行12h的前培養(yǎng)；

③將前培養(yǎng)按1%的體積接種于20 mL LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 介于0.7～1.0時，向菌液中加入IPTG，然后繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)后，進行離心，徹底去上清。

進一步的，作為優(yōu)選：

步驟（1）中，所述的優(yōu)化是指：人Gal-3gORF中某種氨基酸所對應的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率較高的，則保留該密碼子；反之，當使用的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率很低的或不出現(xiàn)的時，則對其進行優(yōu)化，將原密碼子修改為大腸桿菌的密碼子。

步驟①中，所述的瓊脂盤中，卡那霉素Kanamycin的含量為50 μg ?mL^-1。

步驟②和步驟③中，所述的LB培養(yǎng)液中，卡那霉素Kanamycin的含量為50 μg?mL^-1。

步驟③中，所述的IPTG在菌液中的終濃度為0-1 mmol?L^-1，添加IPTG后，所述的培養(yǎng)時間為1-4小時。

人半乳糖凝集素（galectin）蛋白家族是動物凝集素的一類，galectin具有大約135個氨基酸組成的高度保守的糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain, CRD），能特異性性識別并結(jié)合β-半乳糖苷。目前已從多種動物的組織和細胞中分離到15種galectin，其中半乳糖凝集素-3（galectin-3，簡稱Gal-3）是galectin家族中唯一的嵌合型代表。Gal-3在正常細胞（如上皮細胞和免疫細胞）和腫瘤細胞中都廣泛表達。作為一個多功能蛋白，Gal-3參與細胞生長、分化、細胞黏附、血管發(fā)生、腫瘤演進、細胞凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物過程。在20世紀80年代末90年代初，研究人員就發(fā)現(xiàn)Gal-3存在于結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤、頭頸部鱗癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、顱后窩腫瘤等腫瘤組織，并具有一定的診斷、預后、治療價值。Gal-3因此成為備受關(guān)注的腫瘤診斷和治療新靶點。目前，包括多糖、Gal-3C（N-端截短型Gal-3）、多肽、抗體、核酸類等多種抑制劑已相繼被研發(fā)出來，用于抗腫瘤或抗肺纖維化（IPF）等疾病治療。本申請針對人Gal-3開放閱讀框的密碼子進行優(yōu)化和化學合成，成功構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET-25b-Gal-3-Homo，并對其重組蛋白誘導表達條件進行了優(yōu)化。

附圖說明

圖1為本申請中人重組Gal-3誘導表達；

圖2為本申請中人重組Gal-3可溶性檢測、Western-blotting檢測。

其中，圖1中，泳道1、10為未加IPTG的陰性對照，2-5為誘導表達1h，6-9為誘導表達2h，11-14為誘導表達3h，15-18為誘導表達4h；2、6、11、15為0.001 mmol?L^-1 IPTG誘導表達，3、7、12、16為0.01 mmol?L^-1 IPTG誘導表達，4、8、13、17為0.1 mmol?L^-1 IPTG誘導表達，5、9、14、18為1.0 mmol?L^-1 IPTG誘導表達；圖2中，1-4為考馬斯亮藍染色、5-8為Western-blotting檢測；泳道1、5為未加IPTG的陰性對照，2、6為全菌，3、7為上清，4、8為沉淀。

具體實施方式

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)細胞BL21購自天根生化科技有限公司；X-Tractor裂解液購自TAKARA；Protein Ladder、脫脂奶粉、PVDF膜、小鼠抗His-tag 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；DNA片段合成和載體質(zhì)粒構(gòu)建委托蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1密碼子優(yōu)化

統(tǒng)計實驗室常用的重組蛋白原核表達載體，對大腸桿菌20個氨基酸所對應的密碼子進行統(tǒng)計，然后對人Gal-3 ORF碼子優(yōu)化。具體而言，ORF中某氨基酸所對應的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率較高的，則保留該密碼子。反之，如果使用的密碼子是大腸桿菌中出現(xiàn)頻率很低的或不出現(xiàn)的，則對其進行優(yōu)化，即將原密碼子修改為大腸桿菌的密碼子（具體參見序列1，即人Gal-3g 密碼子優(yōu)化前后ORF及其編碼氨基酸的推導序列）。將優(yōu)化的ORF進行合成并連接至pET-28b的Nde I和Xho I克隆位點上，制備重組質(zhì)粒pET-28b-Gal3-Homo。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達

將pET-28b-Gal-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中，將轉(zhuǎn)化液在含卡那霉素Kanamycin（簡稱Kan，50 μg?mL^-1）的瓊脂盤上劃線后37℃培養(yǎng)12 h，獲得大量單菌落。在誘導重組蛋白前一天，挑取單菌落接種于1 mL LB培養(yǎng)液中（含50 μg?mL^-1 Kan），進行12h的前培養(yǎng)。將前培養(yǎng)按1%的體積接種于20 mL LB培養(yǎng)液中（含50 μg?mL^-1 Kan），37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 介于0.7～1.0時，取2 mL菌液作為對照樣品，將剩余菌液分為4管，加入IPTG，使其終濃度分別為0.001 mmol?L^-1、0. 01 mmol?L^-1、0.1 mmol?L^-1、1 mmol?L^-1，然后繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)時間為1、2、3、4h時分別取兩個0.5 mL樣品進行離心（13200rpm，1min），徹底去上清。將其中一管的菌體溶于50 μL的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中，連同Protein Marker一起于干燥恒溫器中100℃處理3 min，取出后迅速置于冰上冷卻，最后將所有樣品分別取5μL進行SDS-PAGE電泳，檢測人重組Gal3誘導表達情況。剩下的一管保存于-20℃用于后續(xù)的重組蛋白的可溶性檢測。

1.2.4重組蛋白的可溶性檢測

（1）分別取1mL經(jīng)IPTG（終濃度1mmol?L^-1）誘導4h的菌液加入已知重量的1.5ml離心管，13200rpm離心1min，去上清，再次稱量離心管重量，得出菌體重量。

（2）按1μg菌體對應20μL比例加入X-tractor裂解液，充分懸浮菌體。加入DNaseⅠ約0.1μL避免溶液出現(xiàn)粘稠，另加入一定量溶菌酶（終濃度為1mg?mL^-1），室溫放置10min，每2min上下顛倒一次。4℃ 13 200rpm離心20min。

（3）取上清到另一個離心管中（作為上清樣品保留檢測用），再在離心管中加入與X-tractor等量的ddH₂O，將沉淀充分懸浮。

（4）取上清和沉淀懸浮液各10μL，加入2.5μL的5×SDS上樣緩沖液，100℃處理5min后迅速置于冰上。

（5）取5μL處理過的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白水溶性。

按照說明，將有表達重組蛋白的細菌溶解于X-Tractor裂解液。離心后，用SDS-PAGE檢測包涵體和沉淀?？扇苄缘鞍追植加谏锨逯?，而不可溶性蛋白分布于包涵體中。

1.2.5 免疫印跡檢測

誘導表達的重組蛋白在15%分離膠，5%濃縮膠中進行SDS-PAGE分析，電泳后用PVDF膜將凝膠在轉(zhuǎn)印緩沖溶液中轉(zhuǎn)移電泳，65 V恒壓轉(zhuǎn)印3 h，5%脫脂奶封閉，小鼠抗His-tag分別為一抗，HRP 標記的羊抗小鼠IgG為二抗，超敏Ecl 化學發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

（1）pET-28b-Gal3-Homo的構(gòu)建、重組蛋白誘導表達及條件優(yōu)化

將優(yōu)化的密碼子進行化學合成并將其連接至pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點，構(gòu)建pET-28b-Mitogalig-Homo，預測其重組蛋白的分子量為28.351 kD（參見序列2和序列3，即人Gal3優(yōu)化后的ORF插入pET28b的5’NdeI 和 3’XhoI克隆位點及其重組蛋白的推導氨基酸序列）。按材料與方法所述進行重組蛋白誘導表達與檢測。SDS-PAGE結(jié)果表明，0.001mmol?L^-1的IPTG不能誘導重組蛋白的表達，當IPTG濃度介于0.01-1mmol?L^-1時，均在標準分子量25.0-35.0 kD之間出現(xiàn)明顯過量表達的蛋白，與預期28.351 kD基本吻合（參見圖1和圖2）。當IPTG介于達到0.1-1mmol?L^-1時重組蛋白表達量沒有明顯區(qū)別。表達量亦隨誘導時間的延長發(fā)生改變，4h時表達量最佳。根據(jù)可溶性檢測結(jié)果表明，該重組蛋白主要分布于上清中，表明是水溶性蛋白（參見圖2）?；谏鲜龇治觯T導表達的最優(yōu)條件選擇為：37℃條件下，IPTG濃度為0.1mmol?L^-1，誘導4 h。

以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實施方式對所提供技術(shù)方案所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明創(chuàng)造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江農(nóng)林大學

<120> 人Gal-3密碼子優(yōu)化及其重組蛋白誘導表達方法

<160> 3

<210> 1

<211> 753

<212> cDNA

<213> 人工序列

<220>

<222> (1)..(753)

<400> 1

Original：ATGGCAGACAATTTTTCGCTCCATGATGCGTTATCTGGGTCTGGAAACCCAAACCCTCAAGGATGGCCTGGCGCATGGGGGAACCAGCCT 90

Optimized：ATGGCAGATAATTTCTCGCTGCATGATGCGCTATCGGGCTCGGGAAATCCAAATCCACAAGGCTGGCCAGGCGCATGGGGCAATCAGCCA

Original：GCTGGGGCAGGGGGCTACCCAGGGGCTTCCTATCCTGGGGCCTACCCCGGGCAGGCACCCCCAGGGGCTTATCCTGGACAGGCACCTCCA 180

Optimized：GCTGGCGCAGGCGGCTATCCAGGCGCTTCCTATCCAGGCGCCTATCCAGGCCAGGCACCACCAGGCGCTTATCCAGGCCAGGCACCACCA

Original：GGCGCCTACCATGGAGCACCTGGAGCTTATCCCGGAGCACCTGCACCTGGAGTCTACCCAGGGCCACCCAGCGGCCCTGGGGCCTACCCA 270

Optimized：GGCGCCTATCATGGCGCACCAGGCGCTTATCCAGGCGCACCAGCACCAGGCGTCTATCCAGGCCCACCAAGCGGCCCAGGCGCCTATCCA

Original：TCTTCTGGACAGCCAAGTGCCCCCGGAGCCTACCCTGCCACTGGCCCCTATGGCGCCCCTGCTGGGCCACTGATTGTGCCTTATAACCTG 360

Optimized：TCGTCGGGCCAGCCAAGCGCCCCAGGCGCCTATCCTGCCACCGGCCCGTATGGCGCCCCAGCTGGCCCACTGATCGTCCCATATAATCTG

Original：CCTTTGCCTGGGGGAGTGGTGCCTCGCATGCTGATAACAATTCTGGGCACGGTGAAGCCCAATGCAAACAGAATTGCTTTAGATTTCCAA 450

Optimized：CCACTGCCAGGCGGCGTCGTCCCACGCATGCTGATCACCATCCTGGGCACCGTCAAGCCAAATGCAAATAGAATCGCTCTAGATTTCCAA

Original：AGAGGGAATGATGTTGCCTTCCACTTTAACCCACGCTTCAATGAGAACAACAGGAGAGTCATTGTTTGCAATACAAAGCTGGATAATAAC 540

Optimized：AGAGGCAATGATGTCGCCTTCCACTTCAATCCACGCTTCAATGAGAATAATCGGAGAGTCATCGTCTGCAATACCAAGCTGGATAATAAT

Original：TGGGGAAGGGAAGAAAGACAGTCGGTTTTCCCATTTGAAAGTGGGAAACCATTCAAAATACAAGTACTGGTTGAACCTGACCACTTCAAG 630

Optimized：TGGGGCAGAGAGGAGAGACAGTCGGTCTTCCCATTCGAGAGCGGCAAGCCATTCAAGATCCAAGTCCTGGTCGAGCCAGATCACTTCAAG

Original：GTTGCAGTGAATGATGCTCACTTGTTGCAGTACAATCATCGGGTTAAAAAACTCAATGAAATCAGCAAACTGGGAATTTCTGGTGACATA 720

Optimized：GTCGCAGTCAATGATGCTCACCTGCTGCAGTATAATCATCGGGTCAAGAAGCTGAATGAGATCAGCAAGCTGGGCATCTCGGGCGATATC

Original：GACCTCACCAGTGCTTCATATACCATGATATAA 753

Optimized：GATCTCACCAGCGCTTCGTATACCATGATCTAA

<210> 2

<211> 813

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCAGATAATTTCTCGCTGCATGATGCGCTATCGGGCTCGGGAAATCCAAATCCACAAGGCTGGCCAGGCGCATGGGGCAATCAGCCAGCTGGCGCAGGCGGCTATCCAGGCGCTTCCTATCCAGGCGCCTATCCAGGCCAGGCACCACCAGGCGCTTATCCAGGCCAGGCACCACCAGGCGCCTATCATGGCGCACCAGGCGCTTATCCAGGCGCACCAGCACCAGGCGTCTATCCAGGCCCACCAAGCGGCCCAGGCGCCTATCCATCGTCGGGCCAGCCAAGCGCCCCAGGCGCCTATCCTGCCACCGGCCCGTATGGCGCCCCAGCTGGCCCACTGATCGTCCCATATAATCTGCCACTGCCAGGCGGCGTCGTCCCACGCATGCTGATCACCATCCTGGGCACCGTCAAGCCAAATGCAAATAGAATCGCTCTAGATTTCCAAAGAGGCAATGATGTCGCCTTCCACTTCAATCCACGCTTCAATGAGAATAATCGGAGAGTCATCGTCTGCAATACCAAGCTGGATAATAATTGGGGCAGAGAGGAGAGACAGTCGGTCTTCCCATTCGAGAGCGGCAAGCCATTCAAGATCCAAGTCCTGGTCGAGCCAGATCACTTCAAGGTCGCAGTCAATGATGCTCACCTGCTGCAGTATAATCATCGGGTCAAGAAGCTGAATGAGATCAGCAAGCTGGGCATCTCGGGCGATATCGATCTCACCAGCGCTTCGTATACCATGATCTAA

<210> 3

<211> 271

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 3

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQP 50

AGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYHGAPGAYPGAPAPGVYP 100

GPPSGPGAYPSSGQPSAPGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRM 150

LITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNN 200

WGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNE 250

ISKLGISGDIDLTSASYTMI 271