密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因在基因治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，具體地說，是密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因及其在基 因治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS)來源于傳統(tǒng)中藥天花粉（Radices trichosanthis)。天花粉為萌蘆科栝樓屬多年生攀援草本植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim)或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Herms)的根。天花粉的功效 為：清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿，主治：消渴、黃疸、熱病口渴、肺燥咳血等。TCS由247個 氨基酸殘基組成，屬于I型核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins，RIP)，分 子量約為27kDa，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗艾滋病病毒等多種藥理 活性。臨床將TCS用于引產(chǎn)及異位妊娠已有多年經(jīng)驗(yàn)。最近的一些藥理研究發(fā)現(xiàn)其還有多 種其他生物活性，主要包括：具有RNA N-糖苷酶活性、DNA酶活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)趨化 因子作用等。其抑制腫瘤的藥理活性更被人們重視。其中對肝細(xì)胞癌的殺傷作用也有多次 報(bào)道。TCS在美國已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，只有在靜脈注射最高劑量（I. 2mg/次/周）時 觀察到了輕度的副作用。然而，目前對TCS抗癌的研究多為直接應(yīng)用其蛋白質(zhì)，還沒有將 TCS基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行抗癌的報(bào)道。
[0003] 在不同的生物體之間，遺傳密碼子使用頻率區(qū)別顯著，密碼子偏好性是影響原 核與真核生物以及不同真核生物間基因表達(dá)的重要因素。因此，基因序列的密碼子優(yōu)化 是異源蛋白質(zhì)的基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)常用的優(yōu)化方法，以增加在哺乳動物宿主 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。已經(jīng)有多個關(guān)于外源基因密碼子優(yōu)化的研究，都獲得了相關(guān)蛋白 質(zhì)表達(dá)量的顯著提高。但是關(guān)于一種密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因（codon-optimized Trichosanthin，coTCS)在基因治療中的應(yīng)用目前還未見報(bào)道。
[0004] 腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus，AAV)是一種直徑23納米的細(xì)小病毒，蛋 白質(zhì)外殼為二十面體，包裝有長度約為4. 7kb的單鏈DNA基因組。由于其非致病性等優(yōu)勢， 重組腺相關(guān)病毒（Recombinant Adeno-Associated Virus，rAAV)現(xiàn)在已成為基因治療的重 要載體之一。接下來我們面臨的問題就是：使用密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因，通過rAAV 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，是否可以達(dá)到腫瘤基因治療的目的？

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因在制 備基因治療藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是，提供一種密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因，和攜帶所述的 密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因的腺相關(guān)病毒或質(zhì)粒。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因在制 備基因治療藥物中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，所述的基因治療是對腫瘤的基因治療。
[0009] 優(yōu)選的，所述的腫瘤是肝癌或?qū)m頸癌。
[0010] 優(yōu)選的，所述的密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因是包括密碼子人源化、狗源化、貓?jiān)?化等哺乳動物源化的天花粉蛋白基因。
[0011] 優(yōu)選的，所述的基因治療是以攜帶密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因的腺相關(guān)病毒為 載體對腫瘤的基因治療。
[0012] 優(yōu)選的，所述的基因治療是以攜帶密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因的質(zhì)粒為載體對 腫瘤的基因治療。
[0013] 優(yōu)選的，所述的密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因具有SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 21任 一所述的核苷酸序列。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種密碼子優(yōu)化的天花粉蛋 白基因，所述的密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因具有SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 21任一所述的 核苷酸序列。
[0015] 攜帶所述的密碼子優(yōu)化的天花粉蛋白基因的病毒或非病毒載體。
[0016] 優(yōu)選的，所述的病毒為腺相關(guān)病毒，所述的非病毒載體為質(zhì)粒。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0018] 1、本發(fā)明的天花粉蛋白基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，再通過病毒或非病毒載體給藥， 可以在哺乳動物細(xì)胞中更高水平表達(dá)蛋白質(zhì)，以發(fā)揮更大的生物學(xué)作用；
[0019] 2、本發(fā)明將給藥載體最優(yōu)化，提高其在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，對腫 瘤基因治療的研究和推廣有重要意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1含有TCS的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7_FLuc細(xì)胞后Flag-Tag蛋白表達(dá)的劑量依賴性。
[0021] 圖2含有TCS蛋白不同量的質(zhì)粒對Huh7_FLuc細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0022] 圖3含有TCS蛋白的質(zhì)粒對Huh7細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0023] 圖4含有TCS蛋白的質(zhì)粒對Huh7_FLuc細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0024] 圖5含有TCS蛋白的質(zhì)粒對LH-86細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0025] 圖6在不同啟動子下含有TCS蛋白的不同質(zhì)粒對Huh7_FLuc細(xì)胞的增殖抑制作 用。
[0026] 圖7、8、9在不同啟動子下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7-FLuc細(xì)胞后EGFP的表達(dá)情況。
[0027] 圖10在不同啟動子下含有TCS蛋白的不同質(zhì)粒對HEK293細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0028] 圖11、12、13在不同啟動子下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后EGFP的表達(dá)情況。
[0029] 圖14含有TCS蛋白的質(zhì)粒在體內(nèi)對人肝癌的抑制作用。
[0030] 圖15含有TCS蛋白的病毒在體內(nèi)對人肝癌的抑制作用。
[0031] 圖16含有TCS蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞后PARP蛋白表達(dá)情況。
[0032] 圖17 Life Technologies公司TCS基因密碼子優(yōu)化后的結(jié)果分析。
[0033] 圖18質(zhì)粒coTCS轉(zhuǎn)染后Flag-Tag蛋白表達(dá)的時間依賴性。
[0034] 圖19質(zhì)粒coTCS轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞內(nèi)Gaussia Luciferase的表達(dá)情況。
[0035] 圖20含有coTCS蛋白的質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用：A.含有coTCS蛋白的 質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用；B.含有coTCS蛋白的質(zhì)粒對H印G2細(xì)胞的增殖抑制作 用；C.含有coTCS蛋白的質(zhì)粒對Huh7細(xì)胞的增殖抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 一、實(shí)驗(yàn)材料與方法
[0039] 1.質(zhì)粒，引物
[0040] pdsAAV-AFPp-EGFP質(zhì)粒由 Glushakova等構(gòu)建（Mingozzi F, High KA: Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV!progress and challenges. Nature reviews Genetics 2011,12(5):341-355·)。其中 AFPp 為甲胎蛋白啟動子，EGFP 為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。TCS基因由Life Technologies公司合成，基于公布的序列 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/M34858. I ；T.kirilowiitrichosanthin(TCS) mRNA，complete cds ;GenBank:M34858. I)，并用限制性內(nèi)切酶 Age I 和 Hind III 進(jìn)行亞克 隆，放進(jìn)pdsAAV-AFPp-EGFP、pdsAAV-CBAp-EGFP質(zhì)粒中。其中CBAp為雞β -肌動蛋白啟動 子。所有質(zhì)粒均在使用之前進(jìn)行了測序。coTCS是分別經(jīng)Integrated DNA Technologies 和Life Technologies公司提供的軟件獲得TCS基因優(yōu)化的多種方案，方案中coTCS具有 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 21任一所述的核苷酸序列，其中ATG為起始密碼子，TGA或TAA或 TAG 為終止密碼子。其中 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 20 是由 Integrated DNA Technologies 公司提供的軟件獲得的TCS基因優(yōu)化方案，SEQ ID NO. 21是由Life Technologies公司提 供的軟件獲得的TCS基因優(yōu)化方案。構(gòu)建多個包含不同方案優(yōu)化TCS基因的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn) 染HeLa和HEK293細(xì)胞后Western Blot檢測Flag-Tag蛋白表達(dá)含量。
[0041] 2.細(xì)胞系培養(yǎng)
[0042] 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，胚胎腎