一種具有胚乳特異表達(dá)特性的DNA片段pENP5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 胚乳特異表達(dá)啟動子PENP5及其應(yīng)用，該啟動子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中特異性的驅(qū) 動目標(biāo)基因在植物，尤其是水稻的胚乳中表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國最重要的糧食作物，人們?nèi)粘Ｊ秤玫拇竺准礊樗镜呐呷?，胚乳的?成和發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時胚乳也是一個優(yōu)良的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。高 產(chǎn)水稻品種目前存在的一個普遍問題是食味品質(zhì)較差，遠(yuǎn)不能適應(yīng)城鄉(xiāng)人民生活水平的提 高對水稻品質(zhì)的要求。稻米品質(zhì)差，售價相對也較低，增產(chǎn)不能增收，因而挫傷農(nóng)民的種糧 積極性。
[0003] 引起這些高產(chǎn)品種食味品質(zhì)差的主要原因是米粒的直鏈淀粉含量偏高。水稻種子 胚乳中的淀粉可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種，不同水稻品種稻米胚乳中的直鏈淀粉含量 有所不同，秈稻品種一般為20 %~30 %，粳稻品種為15 %~22 %，糯稻為0~2 %。直鏈淀 粉含量偏高則往往會使飯質(zhì)變硬、口感差。
[0004] 所謂組織特異性啟動子是指除具有一般啟動子的結(jié)構(gòu)外，通常還有增強(qiáng)子和沉默 子的一般特性。在組織特異性啟動子的調(diào)控下，基因的表達(dá)常常只發(fā)生在某些特定的器官 或組織部位，并常常表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。這些啟動子的調(diào)控往往受到組織細(xì)胞生理狀 態(tài)和化學(xué)物理信號等物質(zhì)的誘導(dǎo)，還受到發(fā)育階段的調(diào)控，其表達(dá)是多種因子相互作用的 結(jié)果。
[0005] 果實(shí)和種子是植物的生殖器官，也是營養(yǎng)物質(zhì)主要的儲藏場所。利用果實(shí)或種 子等器官特異性啟動子調(diào)控基因表達(dá)，不僅可提高基因在這些部位的表達(dá)量，將生物能耗 降到最低，利于表達(dá)產(chǎn)物的分離，而且可有目的地提高轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)或種子的營養(yǎng)或改 善其品質(zhì)。Sandhu等利用E8啟動子（成熟果實(shí)中乙烯應(yīng)答性基因的啟動子）驅(qū)動呼吸 道合胞病毒F抗原基因成功轉(zhuǎn)化番茄植株，用果實(shí)特異表達(dá)抗原喂飼小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn) 生特異的粘膜免疫反應(yīng)、血清學(xué)抗體反應(yīng)及Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)（Sandhu et al.，2000)。 Vasconcelos等用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅(qū)動大豆鐵蛋白基因，使轉(zhuǎn)基因水 稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且鐵蛋白主要積累在胚乳中，不會在食品加工過程 中丟失（Vasconcelos et al. ,2003)。研究人員在一些單子葉植物的種子儲藏蛋白中也 分離了一些胚乳特異表達(dá)的順式作用元件，最著名的GCM元件被認(rèn)為對維持胚乳特異表 達(dá)活性是必須的（Wu et al.，1998)。但也有文獻(xiàn)報導(dǎo)，GCM元件僅僅是起到增強(qiáng)啟動 子在胚乳中的表達(dá)強(qiáng)度的作用，其并不能決定啟動子胚乳特異表達(dá)的特性（Vickers et al.，2006)。另外，一些種子中特異表達(dá)的啟動子如PsGNS2啟動子（Buchner et al.，2002)、 FAEl (Rossak et al·，2001)啟動子等也有相關(guān)的報導(dǎo)。
[0006] 篩選和分離一些具有組織專一性、高表達(dá)水平的DNA片段以及分析有關(guān)的重要特 異性調(diào)控元件的功能，在基因工程研究中有著廣泛的用途。胚乳是糧食作用營養(yǎng)的最重要 組成部分，因此分離胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)的DNA片段對植物品質(zhì)的改良具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有胚乳特異表達(dá)特性的DNA片段、獲得含有該DNA片 段的轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應(yīng)用。其中，本文中所涉及的"植物"是指單子葉植物，例如水 稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種具有胚乳特異表達(dá)特性的DNA片段， 所述DNA片段包含：
[0009] 1)序列表中SEQ ID NO : 1所不的DNA序列；或者
[0010] 2)在嚴(yán)格條件下與1)中所述的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；或 者
[0011] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0012] 2)和3)中的序列與SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驅(qū)動目標(biāo)基 因在植物中表達(dá)。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNA序列為SEQ ID No: 1所示的序列。
[0014] 優(yōu)選地，序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以用作水稻胚乳特異表達(dá)啟動 子。
[0015] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)，本文中稱為pENP5或啟動子pENP5。具體而言，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本 晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的2062bp的 DNA序列，具有驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)的功能，并且分離克隆、并鑒定了該 DNA序列的功能。但是，需要說明的，后續(xù)人們根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容而人工合成的相同序列 也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0017] 另一方面，本發(fā)明還提供一組用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的DNA片段的全長或其 任意片段的引物對，其特征在于，所述引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物 的DNA序列包含片段：CACAGAAACACACAGGGGATGT ;所述第二引物的DNA序列包含片段： TTTTGTAGGATTCTACTACTAT 〇
[0018] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體為在植物表達(dá)載 體PCAMBIA1391的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA片段得到的重組質(zhì)粒，在所述重組表達(dá)載體中， 所述水稻胚乳特異表達(dá)啟動子PENP5連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游；優(yōu)選的，所 述待表達(dá)的基因?yàn)閷λ九呷橛懈纳乒δ艿幕?。通過本發(fā)明的啟動子驅(qū)動基因在胚乳中 特異性表達(dá)，從而達(dá)到改良作物性狀的作用。
[0019] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的 應(yīng)用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述水稻胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子連接于載體的待 表達(dá)的基因序列上游（例如，將所述啟動子序列置于目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載 體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0020] 并且優(yōu)選地，所述應(yīng)用可以用于改良植物生長特性，所述植物為單子葉植物，例如 水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0021] 本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為（與序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0022] €A^AGAAACA€A^AGGGG^GT tttaaactccaatttttatatatttggcattat TCAAATTGCAAACAAATATGATGACTCTCTTTCTCAAAGAAACATATGCCGTTAGGGTGATCCCAGCGCTTCACTT AGAATGGTTTTTCATAGCATTAAATGATATGCCACGTAGGAAAAAACATGATGTGCCATTTTATTAACTTAGGAAA GAGAAGAAAATTGGGTCTTCTCAAAATGATCATCATCTAACAAAATGTCTCTTTGTTTATTTGTGCAAAGAGTAAA TGTGCATCGTGCAATGTCATGCATGCTGCCAACCAAGATTAATTTCTATTTAGTTGAACCTGTGCAACATTTAAAG TGTGAAGTAATTTTTGTTGGACTTGAAGCGACAAAGCACCTTGGTCGATTAGGCCATCCCCAACCCATGGTGTCCA TGGGTGGTGTCTAGAGCAGTGAGAGATCAATAAATGCATATATGGACACTACCTCCCCATTGCATCGTTTATATAC CAGTTTTCATAGGCAAAAAAAAATTAGTAGCTCTTTGCATGTAACATTAACAGAGGAGGGTCAGCTGTGGCAAGCA AGCAAGCAGACGCGGGAGGGGAGGCGCGCAGCAGGCATGGTGACGGGGTAGGGCGCAGCGGATCGAGATGCGAGGA TTTTTTTTTGGGGGGGTGGGGTGGGGGGAGAGAAACGAGTCATCCAACCCAACGCGGATTTAGCTAGTTTCCAGTG CCTTGGAACAGCCGCCGAAACGGTGTCGCGCATGCGACCTGGTTTCTATGTTTTTGCTTCTTTCTCTTCTTTTATT CCGTTGCCACATCAACTTTTTGTCTAGTTGGCAGCCTAATTAATTCTATGGAAACCAGGTGACATGGAGGGTTGGG GACATGGTGGAAAAAACCGGAACGGGCCGACAGTTCAACCGGAAAAAACCAGAACCCGTTCAGTTCAAAAGAAAGA CCGGACATGCATATGACCCGCTTTGAACCGGCAGAACCGGTCGGTTTTTCTATGAACCGGTCATTAAACCGTCCCC GGTTAGACCGAACAAGCCACAATAATCTTGAAATGGGCCTTGATGTGGCCCAATTGGTCTGCCTAGAGCGTTTTGG TTGGCAAAAATCAATCTCCTATTCTCGGCACGTGTGATATACAATGGTAAGTGAGATATACAATTCTCGGCACGGC TACATTACAAGGTGTCGCATTGTGTCAATGTTTGGTTAATTTGCTAGATTCACATAATACATGCCAGGAAGTTCAG AA