一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法，包括樹脂切片的制作、切片的染色、圖像的采集、圖像的前處理和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析等步驟；圖像的前處理利用Photoshop軟件的鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進(jìn)行精確的勾勒和描邊。本發(fā)明不僅可以用來分析胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，還可以進(jìn)一步分析胚乳細(xì)胞內(nèi)容物(淀粉和蛋白)的特性。通過Photoshop和Image-Pro Plus軟件在原位對胚乳細(xì)胞進(jìn)行精確地處理和分析，極大地減少了誤差，并可以實現(xiàn)大批量、全自動的分析。本發(fā)明克服了常規(guī)方法會造成細(xì)胞損失、分析結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，為谷物的育種、加工和利用提供理論依據(jù)，對提高種子的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要的意義。
【專利說明】一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物種子檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻、小麥、玉米等谷類作物的種子是人類糧食、牲畜飼料和工業(yè)原料的主要來源。胚乳細(xì)胞是谷物種子的重要組成部分，它的發(fā)育和充實狀況決定著種子的重量(粒重)與品質(zhì)。谷物種子的粒重與胚乳細(xì)胞的數(shù)目具有顯著的相關(guān)性，胚乳細(xì)胞數(shù)目的增加導(dǎo)致粒重的增加。谷物種子的粒形(粒長、粒寬、粒厚)受胚乳細(xì)胞的數(shù)目、長度、寬度等形態(tài)學(xué)特征的影響。因此，對胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分析，能夠從細(xì)胞學(xué)角度研究谷物種子的發(fā)育和充實，進(jìn)而闡明導(dǎo)致種子品質(zhì)發(fā)生差異的細(xì)胞學(xué)原因，為谷物的育種、加工和利用提供理論依據(jù)，對提高種子的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要的意義。
[0003]目前，對谷物種子胚乳細(xì)胞的研究主要采用以下2種方法進(jìn)行:①利用纖維素酶分解胚乳細(xì)胞壁，將胚乳細(xì)胞分離開再進(jìn)行分析；②利用切片技術(shù)將胚乳細(xì)胞切開，再通過染色技術(shù)顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓以及內(nèi)容物后分析。其中，方法①存在較大的弊端:a)纖維素酶分解胚乳細(xì)胞壁的操作較復(fù)雜，對酶濃度以及酶解時間的要求非常嚴(yán)格，濃度過高、時間過長將導(dǎo)致細(xì)胞壁被破壞，而濃度過低、時間過短將導(dǎo)致胚乳細(xì)胞分離不充分，最終導(dǎo)致胚乳細(xì)胞的分析不準(zhǔn)確山)纖維素酶分解胚乳細(xì)胞的過程容易造成細(xì)胞的損失，最終導(dǎo)致胚乳細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計不準(zhǔn)確；c)分離的胚乳細(xì)胞是混合物，無法準(zhǔn)確定位胚乳不同部位胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；d)無法分析胚乳細(xì)胞內(nèi)容物(淀粉和蛋白)的特性。而方法②很好地解決了方法①的諸多弊端，但仍存在缺陷:a)染色后細(xì)胞的輪廓不夠清晰，造成分析的困難；b)分析的手段單一、過程復(fù)雜，耗費(fèi)大量時間，且精確度較低；c)無法大批量分析，且分析的形態(tài)學(xué)特征太少。
[0004]目前，已有不少生命科學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者利用各種專業(yè)軟件對顯微物體的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了分析，如:①用Smileview對淀粉體和蛋白體進(jìn)行手動測量；②用Image J軟件分析水稻淀粉粒的幾何特性、測量肝臟體積；③用PractiStat軟件分析小麥大、小淀粉粒的軸長；④用Photoshop和Image-Pro Plus軟件分析小麥胚乳淀粉粒的幾何特性等。其中前三種方法操作復(fù)雜，隨意性較大，導(dǎo)致誤差很大；而第④種方法先采用了 Photoshop軟件的“魔棒”和“橡皮擦”工具對淀粉粒進(jìn)行摳圖和著色，再利用Image-P1 Plus軟件的“count/size”工具對所有上色淀粉粒進(jìn)行精確的分析，相比前三種方法，極大地簡化了操作步驟，并能批量化分析目標(biāo)的形態(tài)學(xué)特征，操作簡便，結(jié)果精確。但第④種方法依舊存在以下缺陷:a)Photoshop軟件的“魔棒”工具只適用于如淀粉粒、蛋白體等單一、均質(zhì)的目標(biāo)，不適用于內(nèi)含許多異質(zhì)內(nèi)容物的目標(biāo)，比如內(nèi)含大量蛋白體、淀粉粒的谷物胚乳細(xì)胞；b)Photoshop軟件的“魔棒”工具和“橡皮擦”工具只適用于數(shù)量較少且較分散的目標(biāo)，因為當(dāng)目標(biāo)數(shù)量很多并且分布很緊湊時，“魔棒”工具就無法快速的將每個目標(biāo)區(qū)分開，需要借助其他工具(如“套索”工具)區(qū)分目標(biāo)，同時該工具選中的區(qū)域為選區(qū)，無法進(jìn)行保存，必須一次性處理完所有目標(biāo)；c)著色過程太復(fù)雜，必須借助“橡皮擦”工具對每一個目標(biāo)的邊緣進(jìn)行精確地處理，工作量依舊很大?，F(xiàn)有的技術(shù)方法已不能滿足分析谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，因為:①谷物種子的胚乳細(xì)胞相互間緊挨著，且內(nèi)含大量蛋白體和淀粉粒，“魔棒”工具無法準(zhǔn)確勾勒細(xì)胞的輪廓若采用“套索”工具進(jìn)行勾勒，則需要對每個細(xì)胞進(jìn)行描邊和著色，谷物種子的胚乳細(xì)胞數(shù)量眾多，工作量巨大；③著色操作需要借助“橡皮擦”工具對每一個目標(biāo)的邊緣進(jìn)行精確地處理，操作較繁瑣。因此，需要亟需對現(xiàn)有的胚乳細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析方法進(jìn)行改良和優(yōu)化，發(fā)明一種谷物種子細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法。
經(jīng)過長時間的摸索，我們利用Photoshop軟件的“鋼筆工具”對胚乳細(xì)胞的顯微圖片進(jìn)行簡便、快捷、精確的前處理，生成細(xì)胞輪廓清晰、反差明顯的圖片，再運(yùn)用Image-Ρ-- Plus軟件對細(xì)胞進(jìn)行精確的分析，形成了一套行之有效的分析方法，很好的彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有胚乳細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析方法的不足，本發(fā)明提供了一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法，包括以下步驟:
(I)樹脂切片的制作:
[0008]①取材和固定:采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24h ；
[0009]②漂洗和脫水:用0.1M磷酸緩沖液充分漂洗固定后的穎果，再用30% -50% -70% -90% -100% -100%乙醇對穎果逐級脫水，每級15min ；
[0010]③樹脂滲透、包埋和聚合:用25% -50% -75% -100% -100%倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h，再將滲透完的穎果放于包埋模具內(nèi)，注入純樹脂，將包埋模具放在烘箱內(nèi)，60°C聚合1-2天，使樹脂硬化；
[0011]④修塊和半薄切片:對包埋塊進(jìn)行手工修塊，削去穎果周圍多余樹脂，用超薄切片機(jī)切厚度為2微米的切片，將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45°C加熱板上干燥，使切片展平；
[0012](2)切片的染色:用碘液、番紅-甲基紫染液或熒光增白劑染液對展平的切片染色,通過對細(xì)胞內(nèi)容物的染色反襯出細(xì)胞輪廓或直接對細(xì)胞壁進(jìn)行染色顯示細(xì)胞輪廓；
[0013](3)圖像的采集:在光學(xué)顯微鏡下拍攝切片上胚乳細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保存圖片:
[0014]①當(dāng)使用碘液或番紅-甲基紫染液進(jìn)行染色時，采用正常光模式進(jìn)行拍攝；
[0015]②當(dāng)使用熒光增白劑染液進(jìn)行染色時，采用熒光模式進(jìn)行拍攝；
[0016](4)圖像的前處理:用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，利用鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進(jìn)行精確的勾勒，再用畫筆工具對路徑進(jìn)行描邊，保存圖片；
[0017](5)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析:用Image-Pro Plus軟件打開前處理的圖片,利用“Count/Size”工具對胚乳細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，導(dǎo)出分析的形態(tài)學(xué)特征。
本發(fā)明的步驟(4)中，所述圖像的前處理具體操作如下:
①用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區(qū)域，點(diǎn)選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點(diǎn)選“文件”-“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內(nèi)容改為“背景色”，點(diǎn)擊“確定”新建一個像素與待分析的區(qū)域相同的畫布(背景為黑色)；
②點(diǎn)選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區(qū)域復(fù)制到新畫布上；
③選擇“鋼筆工具”，逐一對細(xì)胞壁進(jìn)行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒；
④打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標(biāo)”，輸入路徑名稱，點(diǎn)擊“確定”保存路徑；
⑤選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%”；
⑥選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，待分析區(qū)域清晰地顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓；
⑦在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復(fù)制圖層”，點(diǎn)擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，顯示出背景為黑色，細(xì)胞輪廓為白色的圖像；
⑧點(diǎn)選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
[0018]與現(xiàn)有胚乳細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0019](I)建立了適用于多種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法。
[0020](2)聯(lián)合運(yùn)用樹脂切片、染色、顯微拍照、軟件處理和分析技術(shù)，對谷物種子胚乳細(xì)胞進(jìn)行原位的形態(tài)學(xué)分析，直觀簡便，定位準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，不僅可以比較不同品種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異，還可以比較同一品種谷物種子不同部位胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。
[0021](3)不僅可以用來分析胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，還可以進(jìn)一步分析胚乳細(xì)胞內(nèi)容物(淀粉、蛋白)的特性。
[0022](4)通過Photoshop軟件的鋼筆工具在原位對細(xì)胞輪廓進(jìn)行精確地勾勒和描邊，克服了“魔棒”、“套索”、“橡皮擦”工具的缺陷，極大地減少了誤差，簡化了操作，節(jié)省了大量分析時間。
[0023](5)通過Image-Pro Plus軟件的“count/size”工具可以大批量、全自動的分析大量胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，操作簡便，結(jié)果精準(zhǔn)，可信度高，應(yīng)用前景寬廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為碘染色水稻種子切片的顯微照片；
[0025]圖2為用Photoshop軟件處理圖1后生成的圖片，顯示清晰的細(xì)胞壁輪廓；
[0026]圖3為用Photoshop軟件處理圖2后生成的圖片，背景為黑色，細(xì)胞壁輪廓為白色；
[0027]圖4為用Image-Pro Plus軟件分析圖3后生成的圖片，顯示了參與計算的細(xì)胞編號;
[0028]圖5為Image-Pro Plus軟件分析圖3后獲得的形態(tài)學(xué)特征結(jié)果圖。
[0029]圖6為熒光增白劑染色小麥種子切片的顯微照片；
[0030]圖7為用Photoshop軟件處理圖6后生成的圖片，顯示清晰的細(xì)胞壁輪廓；
[0031]圖8為用Photoshop軟件處理圖7后生成的圖片，背景為黑色,細(xì)胞壁輪廓為白色；
[0032]圖9為用Image-Pro Plus軟件分析圖8后生成的圖片，顯示了參與計算的細(xì)胞編號;
[0033]圖10為Image-Pro Plus軟件分析圖8后獲得的形態(tài)學(xué)特征結(jié)果圖。
[0034]圖11為番紅-甲基紫染色玉米種子切片的顯微照片；
[0035]圖12為用Photoshop軟件處理圖11后生成的圖片，顯示清晰的細(xì)胞壁輪廓；
[0036]圖13為用Photoshop軟件處理圖12后生成的圖片，背景為黑色，細(xì)胞壁輪廓為白色；
[0037]圖14為用Image-Pro Plus軟件分析圖13后生成的圖片，顯示了參與計算的細(xì)胞編號;
[0038]圖15為Image-Pro Plus軟件分析圖13后獲得的形態(tài)學(xué)特征結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0040]實施例一:水稻種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析
[0041]1.樹脂切片的制作:
[0042](I)取材和固定:
[0043]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):
[0044]a)母液A (0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液):稱取71.64g Na2HPO4.12 H2O,用蒸餾水定容至100mL ；
[0045]b)母液B (0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液):稱取31.21g NaH2PO4.2 H2O,用蒸餾水定容至100mL ；
[0046]c)按照A液:B液=81:19的比例混合，用A液或B液調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0047]②配制10%多聚甲醛水溶液:
[0048]a)稱取20g多聚甲醒于250mL三角錐形瓶中，加入200mL蒸懼水,放入25*9mm規(guī)格的磁力攪拌子；
[0049]c)配制0.lmol/L氫氧化鈉水溶液:稱取40mg氫氧化鈉于1mL離心管中，加入1mL蒸餾水，混合均勻；配制0.lmol/L鹽酸水溶液:量取4.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.5%的濃鹽酸，用蒸懼水定容至500mL ；
[0050]d)向錐形瓶中逐滴滴加0.lmol/L氫氧化鈉水溶液至多聚甲醛水溶液恰好澄清；
[0051]e)冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0052]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.4) +80mL 10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液(國藥集團(tuán)，F(xiàn)EM進(jìn)口分裝)充分混勻，用氫氧化鈉或鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0053]④從稻穗上取下水稻種子，用解剖針小心剝?nèi)シf殼，取出完整穎果，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0054]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部1_厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細(xì)胞充分固定。
[0055](2)漂洗和脫水:
[0056]①配制0.lmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4): 10mL 0.2mol/L磷酸緩沖液+10mL蒸懼水，充分混勻。
[0057]②用干凈的吸管小心吸去固定液，不要碰到穎果斷面，再用0.lmol/L磷酸緩沖液漂洗固定后的穎果，共漂洗5次,每次30min,充分洗去固定液。
[0058]③配制濃度為30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度對穎果逐級脫水:每級 1mLjj^K 15min。
[0059](3)樹脂滲透、包埋和聚合:
[0060]①配制倫敦白膠(LR White)樹脂:量取40mL樹脂于50mL離心管中，稱取0.8g催化劑(Benzoyl Peroxide)倒入離心管中,磁力攪拌20min使充分溶解,放于4°C冰箱24h后使用；
[0061]②配制濃度為25%、50%和75%的樹脂乙醇溶液:樹脂和無水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0062]③按照25% -50% -75% -100% -100 %的梯度對穎果逐級滲透:每級5mL，放于4°C冰箱，滲透12h。
[0063]④用鑷子輕輕夾住穎果側(cè)面，將橫斷面朝下放于包埋模具內(nèi)，用200mL移液槍緩慢注入純樹脂浸沒穎果，避免出現(xiàn)氣泡。
[0064]⑤將包埋模具放在烘箱內(nèi)，60°C聚合1-2天(時間必須控制在2天之內(nèi)，防止引起樹脂皺縮，導(dǎo)致切片困難)，使樹脂硬化。
[0065](4)修塊和半薄切片:
[0066]①先用銼刀將樣品表面包埋劑磨去，露出穎果；
[0067]②然后將包埋塊夾在切片機(jī)的樣品夾上，頂端露出2_，在體視顯微鏡下用鋒利的刀片在穎果的四周以和水平面成45°的角削去包埋劑，其側(cè)面修成錐形體，樣品的正面修成上下邊平行的六邊形；
[0068]③安裝玻璃刀，放在刀夾中夾緊；
[0069]④調(diào)整好包埋塊和玻璃刀的位置，在體視鏡下對刀，使刀鋒和樣品面對齊:
[0070]a)打開底部的背光燈，關(guān)閉其他照明燈，進(jìn)刀使樣品面與刀鋒靠近，可以看見樣品面上出現(xiàn)一個亮條，利用這個亮條判斷樣品與刀是否對齊；
[0071]b)先調(diào)整樣品面上下兩條邊與刀鋒平行:觀察亮條的上下兩條邊是否平行，若不平行，則調(diào)整樣品夾旋轉(zhuǎn)旋鈕，使其平行；
[0072]c)再調(diào)整樣品面的左右與刀鋒平行:觀察亮條的左右兩條邊是否等長，若不等長，則調(diào)整刀鋒旋轉(zhuǎn)旋鈕，使其相等；
[0073]d)最后調(diào)整樣品面的上下與刀鋒平行:上下移動樣品面，觀察亮條左右兩條邊的長度是否變化，若有變化，則調(diào)整樣品面旋轉(zhuǎn)旋鈕，使其長度不變；
[0074]⑤對刀完成后，進(jìn)刀使刀鋒與樣品接近，樣品面下緣與刀鋒等高，轉(zhuǎn)動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運(yùn)動，使刀鋒剛好切到組織為止；
[0075]⑥切片厚度設(shè)為2微米，進(jìn)行手動切片:右手緩慢轉(zhuǎn)動樣品臂升降鈕開始切片，在切片的整個過程中，包埋塊的正面勻速、緩慢地下移，玻璃刀鋒逐漸切下切片，左手拿睫毛筆輕輕放在切片前端邊緣的正上方，防止其卷曲，此過程要始終保持穩(wěn)定，防止睫毛碰到刀鋒或戳破切片；
[0076]⑦取干凈的載玻片，滴加蒸餾水，用鑷子小心夾住切片邊緣，將切片以和水平面成45 °角輕輕放在水滴上,45 V加熱板上干燥,使切片展平。
[0077]⑧將切片放于烘箱中，60°C烘12h，防止染色過程中脫片。
[0078]2.切片的染色:
[0079](I)碘液配制:5g碘+1g碘化鉀+85mL蒸餾水，完全溶解后用50%甘油稀釋80倍作為染液。
[0080](2)碘染色:滴加碘液后避光靜置lOmin，用蓋玻片封片后顯微鏡下觀察；
[0081]3.圖像的采集:用Olympus BX53顯微鏡的正常光模式觀察胚乳細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)，用附帶的CCD進(jìn)行拍照，獲得顯微圖片I。
[0082]4.圖像的前處理:
[0083](I)用Photoshop軟件打開拍攝的圖片1，用“矩形選框工具”選出待分析的區(qū)域，點(diǎn)選菜單欄的“編輯“拷貝”，再點(diǎn)選“文件“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內(nèi)容改為“背景色”，點(diǎn)擊“確定”新建一個像素與待分析的區(qū)域相同的畫布(背景為黑色)；
[0084](2)點(diǎn)選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區(qū)域復(fù)制到新畫布上；
[0085](3)選擇“鋼筆工具”，逐一對細(xì)胞壁進(jìn)行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒；
[0086](4)打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標(biāo)”，輸入路徑名稱，點(diǎn)擊“確定”保存路徑；
[0087](5)選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%，，；
[0088](6)選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，待分析區(qū)域清晰地顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓，如圖2 ；
[0089](7)在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復(fù)制圖層”，點(diǎn)擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，顯示出背景為黑色，細(xì)胞輪廓為白色的圖像，如圖3 ；
[0090](8)點(diǎn)選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
[0091]5.細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析:
[0092](I)標(biāo)尺的設(shè)定:
[0093]①用Image-Pro Plus軟件打開Cl型測微尺圖片，點(diǎn)選菜單欄的“Measure”-“Calibrat1n” - “Spatial ”,在彈出的窗口中點(diǎn)選“New”新建標(biāo)尺,在上方的“Name” 一欄下的“spatial cal O”處點(diǎn)一下，輸入標(biāo)尺名“ 10X” ;
[0094]②“Unit”一欄選擇“ μ m” 作為單位，勾選 “convert when change unit”；
[0095]③點(diǎn)選“Units/pixel” 一欄中的“Image”,彈出“scaling”對話框，同時在標(biāo)尺圖片左上角顯出一個標(biāo)尺，將鼠標(biāo)移到這個標(biāo)尺的橫杠上，點(diǎn)一下左鍵，光標(biāo)就立即變成了小手，就用這個小手把標(biāo)尺拖下來，再將小手依次移到移到橫杠的左右兩端，利用“放大鏡”工具，用左鍵拖這兩個端點(diǎn)到圖片兩邊的標(biāo)尺該線處，在“scaling”對話框中填上標(biāo)尺長度，點(diǎn)擊“0K”關(guān)閉對話框。
[0096](2)定義標(biāo)尺:點(diǎn)選菜單欄的 “Measure” - “Calibrat1n”- “Select Spatial”，在彈出的窗口中點(diǎn)選新建的“ 10X”標(biāo)尺。
[0097](3)形態(tài)學(xué)分析:
[0098]①點(diǎn)選菜單欄的“Measure” - “count/size”,彈出 “count/size” 對話框；
[0099]②點(diǎn)選對話框菜單欄的“Measure” - “Select Measurements”，彈出“Select Measurements"對話框，點(diǎn)選所需測量的參數(shù)，這里我們選擇“Area(面積)”、“Roundness (圓度)” “Size (length)(長軸長度)”和 “Size (width)(短軸長度)”，點(diǎn)擊“0K” 返回 “count/size” 對話框；
[0100]③點(diǎn)選“AutomaticDark 0bjects”，勾上“Measure 0bjects”、“Apply FilterRanges”和“Display 0bjects”復(fù)選框，點(diǎn)擊“Count”按鈕完成參數(shù)的計算，圖片上將顯示參與計算的每個細(xì)胞標(biāo)號，如圖4 ；
[0101]④點(diǎn)選對話框菜單欄的“View”- “Measurement Data”,獲得胚乳細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，如圖5。其中面積單位為μ m2，圓度單位為μ m2/μ m2，長度單位為μπι。
[0102]⑤各參數(shù)的含義:
[0103]a) “Area”:表示測量對象的面積；
[0104]b) “Roundness”:表示對象的圓度,計算公式=(周長2)/(4* π *面積);圓物體的圓度為1，其它形狀圓度大于I ;
[0105]c) iiSize(Iength) ”:表示對象沿主軸(長軸)方向的對象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑；
[0106]d) "Size(width) ”:表示對象沿副軸(短軸)方向的對象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑。
[0107]實施例二:小麥種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析
[0108]1.樹脂切片的制作:
[0109](I)取材和固定:
[0110]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):方法同實施例一。
[0111]②配制10%多聚甲醛水溶液:方法同實施例一。
[0112]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:方法同實施例一。
[0113]④從麥穗上取下小麥種子，用解剖針小心剝?nèi)シf殼，取出完整穎果，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0114]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部1_厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細(xì)胞充分固定。
[0115](2)漂洗和脫水:方法同實施例一。
[0116](3)樹脂滲透、包埋和聚合:方法同實施例一。
[0117](4)修塊和半薄切片:方法同實施例一。
[0118]2.切片的染色:
[0119](I)熒光增白劑染液配制:1mg熒光增白劑+ImL 7jC，充分混勻溶解后稀釋10倍作為染液。
[0120](2)熒光增白劑染色:
[0121]①切片放于加熱板上加熱至55°C ;
[0122]②滴加熒光增白劑染液染色1min ;
[0123]③水洗lOmin，加熱板上烘干后顯微鏡下觀察。
[0124]3.圖像的采集:用Olympus BX51顯微鏡的突光模式觀察胚乳細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu),用附帶的CCD進(jìn)行拍照，獲得細(xì)胞的顯微圖片6。
[0125]4.圖像的前處理:方法同實施例一，獲得圖片7和8。
[0126]5.細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析:方法同實施例一,獲得圖片9和10。
[0127]實施例三:玉米種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析
[0128]1.樹脂切片的制作:
[0129](I)取材和固定:
[0130]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):方法同實施例一。
[0131]②配制10%多聚甲醛水溶液:方法同實施例一。
[0132]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:方法同實施例一。
[0133]④從玉米棒上取下玉米種子，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0134]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部Imm厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細(xì)胞充分固定。
[0135](2)漂洗和脫水:方法同實施例一。
[0136](3)樹脂滲透、包埋和聚合:方法同實施例一。
[0137](4)修塊和半薄切片:方法同實施例一。
[0138]2.切片的染色:
[0139](I)番紅-甲基紫染液配制:
[0140]①番紅染液:Ig番紅+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；
[0141]②甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸餾水。
[0142](2)番紅-甲基紫染色:
[0143]①切片放于加熱板上加熱至55°C ;
[0144]②滴加番紅染液染色12min ；
[0145]③水洗5min，加熱板上烘干；
[0146]④滴加甲基紫染液染色5min ；
[0147]⑤水洗5min，加熱板上烘干后顯微鏡下觀察。
[0148]3.圖像的采集:方法同實施例一，獲得細(xì)胞的顯微圖片11。
[0149]4.圖像的前處理:方法同實施例一，獲得圖片12和13。
[0150]5.細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析:方法同實施例一，獲得圖片14和15。
【權(quán)利要求】
1.一種谷物種子胚乳細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析方法，包括以下步驟:(1)樹脂切片的制作；(2)切片的染色；(3)圖像的采集；(4)圖像的前處理；(5)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析，其特征在于，步驟(4)圖像的前處理利用Photoshop軟件的鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進(jìn)行精確的勾勒和描邊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)樹脂切片的制作 ①取材和固定:采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24h ； ②漂洗和脫水:用0.1M磷酸緩沖液充分漂洗固定后的穎果，再用30% -50% -70% -90% -100% -100%乙醇對穎果逐級脫水，每級15min ； ③樹脂滲透、包埋和聚合:用25%-50% -75% -100% -100%倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h，再將滲透完的穎果放于包埋模具內(nèi)，注入純樹脂，將包埋模具放在烘箱內(nèi)，60°C聚合1-2天，使樹脂硬化； ④修塊和半薄切片:對包埋塊進(jìn)行手工修塊，削去穎果周圍多余樹脂，用超薄切片機(jī)切厚度為2微米的切片，將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45°C加熱板上干燥，使切片展平； (2)切片的染色:用碘液、番紅-甲基紫染液或熒光增白劑染液對展平的切片染色，通過對細(xì)胞內(nèi)容物的染色反襯出細(xì)胞輪廓或直接對細(xì)胞壁進(jìn)行染色顯示細(xì)胞輪廓； (3)圖像的采集:在光學(xué)顯微鏡下拍攝切片上胚乳細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保存圖片； (4)圖像的前處理:用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，利用鋼筆工具對種子細(xì)胞的輪廓進(jìn)行精確的勾勒，再用畫筆工具對路徑進(jìn)行描邊，保存圖片； (5)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析:用Image-ProPlus軟件打開前處理的圖片，利用“Count/Size，，工具對胚乳細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，步驟(3)中，圖像的采集過程在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行: ①當(dāng)使用碘液或番紅-甲基紫染液進(jìn)行染色時，采用正常光模式進(jìn)行拍攝； ②當(dāng)使用熒光增白劑染液進(jìn)行染色時，采用熒光模式進(jìn)行拍攝。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的形態(tài)學(xué)分析方法，其特征在于，步驟(4)中，所述圖像的前處理具體操作如下: ①用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區(qū)域，點(diǎn)選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點(diǎn)選“文件”-“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內(nèi)容改為“背景色”，點(diǎn)擊“確定”新建一個像素與待分析的區(qū)域相同的畫布(背景為黑色)； ②點(diǎn)選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區(qū)域復(fù)制到新畫布上； ③選擇“鋼筆工具”，逐一對細(xì)胞壁進(jìn)行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒； ④打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標(biāo)”，輸入路徑名稱，點(diǎn)擊“確定”保存路徑； ⑤選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%”； ⑥選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，待分析區(qū)域清晰地顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓； ⑦在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復(fù)制圖層”，點(diǎn)擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，顯示出背景為黑色，細(xì)胞輪廓為白色的圖像； ⑧點(diǎn)選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
【文檔編號】C12Q1/02GK104450859SQ201410811254
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】韋存虛, 蔡燦輝, 趙凌霄 申請人:揚(yáng)州大學(xué)