專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)靶向抑制內(nèi)源貯藏蛋白增強(qiáng)植物種子中異源多肽的累積的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，且具體地涉及通過(guò)抑制競(jìng)爭(zhēng)單子葉植物胚乳中種子貯藏蛋白的內(nèi)源表達(dá)增加植物種子中異源蛋白表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
許多植物在發(fā)育種子的胚乳中表達(dá)和貯藏大量具有不同功能的蛋白，諸如各種貯藏蛋白，代謝酶，內(nèi)源幾丁質(zhì)酶，蛋白合成抑制因子，蛋白酶抑制因子，淀粉酶，凝集素和過(guò)氧化物酶。胚乳中的貯藏蛋白諸如通常在許多單子葉作物中，可超過(guò)種子干重的15％。因此，在特定的發(fā)育階段，種子胚乳中的細(xì)胞機(jī)構(gòu)主要由這些特定蛋白的制備和貯藏所占據(jù)。此外，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)貯藏蛋白基因在幾天到幾周的時(shí)間內(nèi)以多拷貝形式存在，反映了這些蛋白快速累積的重要性。
作物種子的發(fā)育胚乳中蛋白累積的固有生物學(xué)能力是指許多作物植物，尤其是單子葉植物具有作為用于大規(guī)模生產(chǎn)異源重組蛋白，例如用于制藥工業(yè)的高價(jià)值多肽的實(shí)用和有效載體的潛能；這種生產(chǎn)方法通常稱(chēng)作分子耕作。此外，在種子中貯藏異源多肽減少了下游加工成本，因?yàn)檫@些種子可以貯藏好幾年而不影響異源多肽的特性。這種蛋白的表達(dá)，優(yōu)選在種子-特異性或胚乳-特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下。
當(dāng)提高用于分子耕作的特定植物中異源蛋白的表達(dá)水平時(shí)，利用常規(guī)分子生物學(xué)策略，諸如合適啟動(dòng)子的選擇和亞細(xì)胞定位，盡管表達(dá)水平也受待表達(dá)蛋白的特性及其復(fù)雜性與功能的顯著影響。然而，尤其令人擔(dān)憂的異源蛋白的低表達(dá)水平(總可溶性蛋白的低百分比或％TSP)，甚至當(dāng)在種子表達(dá)時(shí)。需要新的生物技術(shù)方法來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)水平。這是是相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，尤其因?yàn)榧?xì)胞機(jī)理已被程序設(shè)計(jì)用于其內(nèi)源作用，其在發(fā)育種子中，優(yōu)選被貯藏蛋白的累積和休眠依賴(lài)存活者的常規(guī)制備所占據(jù)。最經(jīng)常地用于驅(qū)動(dòng)目的異源基因在單子葉植物的胚乳或種子中表達(dá)的啟動(dòng)子主要為來(lái)自貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子，諸如GluB-1，一種來(lái)自水稻的1.3kb胚乳-特異性啟動(dòng)子(Patel等，2000；GenBank登錄號(hào)X54314)，或來(lái)自大麥的0.45kb D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子(Srensen等，1996；GenBank登錄號(hào)X84368)。盡管這些啟動(dòng)子強(qiáng)烈驅(qū)動(dòng)異源目的蛋白的表達(dá)，它們?cè)跁r(shí)間和空間上的活性與驅(qū)動(dòng)最豐富的貯藏蛋白的內(nèi)源啟動(dòng)子的活性一致，引起有限資源的競(jìng)爭(zhēng)，諸如氨基酸，核醣體結(jié)合位點(diǎn)和參與翻譯翻譯后加工的酶集合。這些競(jìng)爭(zhēng)消極地影響目的異源多肽的表達(dá)水平。
高度理想地是具有一種抑制內(nèi)源基因，諸如在時(shí)間和空間上與異源目的蛋白的表達(dá)積極爭(zhēng)奪資源的許多內(nèi)源貯藏蛋白基因表達(dá)的方法。因此，如果提供了抑制的實(shí)用方法，抑制貯藏蛋白可滿足多種工業(yè)需求。這一點(diǎn)可能是分子耕作中相當(dāng)重大的挑戰(zhàn)，特別是如果內(nèi)源基因?yàn)槎嗷蚣易宓某蓡T時(shí)。在大麥中，例如，胚乳中的主要資源庫(kù)是占高達(dá)50％總胚乳蛋白的B-大麥醇溶蛋白貯藏蛋白(Shewry 1993in Barley；Chemistry and Technology)。
術(shù)語(yǔ)“庫(kù)”，“庫(kù)基因”和“庫(kù)蛋白”在這里是指在細(xì)胞中積極表達(dá)和吸收大量可用資源的基因和基因產(chǎn)物，即，庫(kù)“消耗”細(xì)胞的大部分資源，因此限制了用于表達(dá)其它基因和基因產(chǎn)物的可用資源。
反義技術(shù)是作為減少植物細(xì)胞中特異性?xún)?nèi)源基因產(chǎn)物表達(dá)的有效手段出現(xiàn)的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,759,829；rvar等1997；Coles等，1999)。然而，該技術(shù)并不是直接抑制基因家族成員的基因表達(dá)的實(shí)用方法，例如種子貯藏蛋白的情況，諸如每一單倍體基因組至少20個(gè)的B-大麥醇溶蛋白基因Shewry等，1985)；該技術(shù)較好地適于調(diào)控不屬于基因家族的基因的表達(dá)。
減少內(nèi)源基因表達(dá)的另一方法是用于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的雙鏈RNA的應(yīng)用。此RNA-誘導(dǎo)的基因沉默或RNA-干預(yù)，其中特定內(nèi)源基因的正義及其互補(bǔ)反義RNA鏈在一個(gè)dsRNA中合成，首先顯示于秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)(Fire等，1998等，1998)中。Hamilton等，(1999)顯示短的核苷酸RNAs(21-23核苷酸長(zhǎng))為調(diào)節(jié)植物PTGS中內(nèi)源靶mRNA裂解的裂解產(chǎn)物。植物中雙-鏈基因沉默的更有效的方法為Wesley等(2001)所描述的方法，其中基因沉默基因以轉(zhuǎn)錄后形成“發(fā)夾-環(huán)”RNA(hpRNA)的方式構(gòu)建。hpRNA基因沉默的一種形式是內(nèi)含子-剪接的hpRNA(ihpRNA)其中發(fā)夾-環(huán)中的間隔基為內(nèi)含子。ihpRNA可以是植物中非常強(qiáng)烈的PTGS(參見(jiàn)Waterhouse等2001和Smith等2000)。在特定載體中產(chǎn)生這種PTGS構(gòu)建體的方法描述在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003-A-0049835中。
需要一種提高分子耕作中且特別是單子葉植物諸如大麥中異源基因表達(dá)的新方法。為增加分子耕作中目的藥物蛋白表達(dá)而減少目的異源基因和內(nèi)源“庫(kù)”基因之間表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)的能力，在現(xiàn)有技術(shù)中尚未被實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)也沒(méi)有顯示利用例如hpRNA-誘導(dǎo)的PTGS，靶基因沉默可以為何，事實(shí)上可增加分子耕作中目的異源基因的表達(dá)水平。
發(fā)明概述和目的本發(fā)明的主要目的被概括為提供用于增加在分子耕作中用作制備載體的轉(zhuǎn)基因種子中目的異源多肽的累積水平的方法和核酸構(gòu)建體。主要方法是限制單子葉植物中編碼胚乳-特異性貯藏蛋白的內(nèi)源不希望的mRNA的蛋白翻譯的資源競(jìng)爭(zhēng)來(lái)有利于在上述胚乳中表達(dá)重組產(chǎn)生的目的異源多肽。
上述抑制基因家族成員的基因表達(dá)的方法是靶向所有具有其特征的基因家族成員的編碼序列內(nèi)的獨(dú)立成員或同源區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)以協(xié)調(diào)方式調(diào)控上述基因家族的多數(shù)成員的表達(dá)抑制單基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)來(lái)減弱基因家族的表達(dá)避免以前描述的方法的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一目的是利用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的hpRNA-誘導(dǎo)的PTGS來(lái)抑制單子葉植物的胚乳中主要貯藏蛋白的表達(dá)，且由此，避免利用用于相同目的的本領(lǐng)域更常規(guī)的所謂反義技術(shù)，或所謂的共-抑制。
如果可獲得主要貯藏蛋白基因諸如大麥醇溶蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的hpRNA-誘導(dǎo)的PTGS，而不影響驅(qū)動(dòng)編碼目的異源蛋白的轉(zhuǎn)基因的特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，用于翻譯的有限資源的競(jìng)爭(zhēng)將減少而有助于編碼目的異源蛋白的mRNA，從而導(dǎo)致特定目的異源蛋白累積的增加。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制主要貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)的方法，且由此減少所述貯藏蛋白基因的表達(dá)水平，不影響驅(qū)動(dòng)編碼在植物中產(chǎn)生的異源蛋白的目的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特定啟動(dòng)子的活性。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了增強(qiáng)植物種子中目的異源多肽的表達(dá)和累積的方法，所述方法包括(a)用與編碼一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TF)或其部分、包括不同TFs的嵌合組合、調(diào)節(jié)編碼種子貯藏蛋白的一或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄的DNA序列可操作連接的種子-特異性啟動(dòng)子的DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述TF DNA序列的轉(zhuǎn)錄鏈能夠形成能抑制、延緩或減少所述植物細(xì)胞中一或多種所述種子貯藏蛋白的表達(dá)的“發(fā)夾”RNA，和(b)選擇沒(méi)有被如上(a)中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的種子-特異性啟動(dòng)子，和(c)用與編碼目的異源多肽的DNA序列可操作連接的(b)所述的啟動(dòng)子的DNA序列轉(zhuǎn)化(a)所述的相同的或另一植物細(xì)胞；(d)由所述轉(zhuǎn)化的植物宿主細(xì)胞再生植物，以及在其中所述編碼一或多種TF或其部分的DNA序列被轉(zhuǎn)錄的條件下栽培所述植物，由此減少所述內(nèi)源mRNA的表達(dá)，因此減少所述種子貯藏蛋白的表達(dá)，和由此增強(qiáng)所述異源目的多肽的表達(dá)和累積。
在一個(gè)有用的實(shí)施方案中，步驟(a)的DNA序列以及步驟(c)的DNA序列被導(dǎo)入到相同的植物細(xì)胞中。在這種實(shí)施方案中，該序列可以可操作連接在一個(gè)DNA序列中。
然而，在其它有意義的實(shí)施方案中，步驟(a)的DNA序列被導(dǎo)入到第一植物宿主細(xì)胞的基因組中，且所述步驟(c)的DNA序列被導(dǎo)入到第二植物宿主細(xì)胞的基因組中。然后由所述第一植物宿主細(xì)胞再生第一轉(zhuǎn)基因植物并且由所述第二植物宿主細(xì)胞產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因植物，且由所述第一和第二轉(zhuǎn)基因植物之間的有性雜交產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的子代，該子代植物具有包括編碼所述一或多種TF-s的DNA序列以及編碼目的異源蛋白的DNA序列的細(xì)胞，因此該植物能夠表達(dá)和累積所述的異源蛋白。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制的種子貯藏蛋白為大麥的大麥醇溶蛋白，例如，B-大麥醇溶蛋白和C-大麥醇溶蛋白之一或二者。
編碼目的異源多肽的DNA序列可以是編碼原核或真核生物蛋白的DNA序列，其可以在本發(fā)明的植物細(xì)胞中累積。可選擇用于本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白的實(shí)例為膠原蛋白，膠原酶，同源盒多肽，單克隆抗體，分泌的抗體，單鏈抗體，甘露糖-結(jié)合的凝集素，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，酪蛋白，人生長(zhǎng)激素，人血清白蛋白，人胰島素，乳鐵蛋白，溶菌酶，纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶，肌醇六磷酸酶，水解酶，過(guò)氧化物酶，纖維蛋白原，因子IX，因子X(jué)III，凝血酶，蛋白C，木聚糖酶，異淀粉酶，葡糖淀粉酶，淀粉酶，溶菌酶，β-葡聚糖酶，葡糖腦苷脂酶，酪蛋白，乳糖酶，尿素酶，葡萄糖異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)化酶，鏈霉親和素，酯酶，堿性磷酸酶，蛋白酶抑制因子，蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜酶，激酶，磷酸酶，脫氧核糖核酶，核糖酶，磷脂酶，脂酶，漆酶，蛛絲蛋白，抗凍蛋白，抗微生物肽或防衛(wèi)素，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞分裂素。
在某些實(shí)施方案中，所述DNA序列編碼來(lái)自嗜熱生物的目的蛋白，諸如例如碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。合適的CBM的實(shí)例為來(lái)自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的CBM9-2。CBM9-2基因組DNA序列可獲自GenBank登錄號(hào)Z46264且其屬于CBM-s的IX家族。同時(shí)，包括所述CBM或其它合適CBM的融合蛋白可由DNA序列編碼且在本發(fā)明種子中超表達(dá)。純化這種CBMs和CBM融合蛋白的方法進(jìn)一步具體描述在申請(qǐng)人與此申請(qǐng)同時(shí)申請(qǐng)的懸而未決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)“由植物純化重組蛋白的非-失活方法”和“重組蛋白的蛋白水解和純化的方法”中，且其全文引入作為參考。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述DNA序列包括編碼HoxB4蛋白的人同源盒B4(HoxB4)基因。所述人HoxB4蛋白優(yōu)選地具有SEQ IDNO1序列，或與SEQ ID NO1具有顯著序列同一性的序列，因此表達(dá)的蛋白優(yōu)選地具有天然HoxB4蛋白的所有功能特征。在上下文中的顯著序列同一性表示至少50％序列同一性且更優(yōu)選地至少60％，諸如至少70％的序列同一性，諸如至少80％和優(yōu)選地至少90％的序列同一性，諸如至少95％或99％的序列同一性。
如在這里所顯示的，編碼一或多種TF或其部分的所述DNA序列優(yōu)選地能夠形成能抑制、延緩或減少一或多種所述種子貯藏蛋白的表達(dá)的“發(fā)夾”RNA。所述DNA序列可包含完整的TF序列，然而，有時(shí)即使僅僅TF序列的一部分也在原位影響抑制。因此，在這些實(shí)施方案中，一或多種TF序列的充分長(zhǎng)度部分是影響抑制所需要的。有時(shí)，短至20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分TF序列的是充分的，但優(yōu)選利用至少20-500個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的部分，包括約20-200個(gè)，諸如在20-100范圍內(nèi)，或50-100核苷酸長(zhǎng)的范圍內(nèi)。
在特定有用的實(shí)施方案中，編碼一或多種TF的DNA序列為嵌合DNA序列，如在這里定義的，由編碼TF或其部分的兩種或多種DNA序列的區(qū)域組成。在其它有用的實(shí)施方案中，在嵌合DNA序列中編碼一或多種TF的DNA序列可同時(shí)包括能夠在“發(fā)夾”RNA中形成環(huán)的內(nèi)含子序列。
優(yōu)選的實(shí)施方案利用編碼TF或其部分的DNA序列，包括來(lái)自bZIP蛋白組的編碼TF或其部分的區(qū)域，更優(yōu)選地為選自大麥BLZ1和BLZ2蛋白的bZIP蛋白(參見(jiàn)Onate等，1999)。所述DNA序列可包含編碼這種蛋白的影響抑制的足夠長(zhǎng)度的部分序列，或編碼所述蛋白的部分序列的組合。
所述DNA序列優(yōu)選地包括如SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的序列，或編碼與通過(guò)所述序列編碼的任一氨基酸序列具有顯著序列同一性的蛋白的序列，或具有足夠長(zhǎng)度來(lái)根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)致抑制的SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列的一部分的序列。如上所述，所述序列的任意組合，諸如一或多種部分上述序列的組合可能是有用的，這種組合的實(shí)例顯示為SEQ ID NO5，其是部分BLZ1和部分BLZ2的嵌合體。
本發(fā)明的另一目的是提供利用hpRNA-誘導(dǎo)的PTGS技術(shù)來(lái)抑制主要貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)的方法。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)用hpRNA-誘導(dǎo)的PTGS技術(shù)來(lái)抑制內(nèi)源貯藏蛋白的表達(dá)且，由此增加諸如氨基酸，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和參與翻譯和翻譯后加工的酶的集合，用于翻譯編碼目的異源多肽的mRNA的資源的利用率。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼一或多種優(yōu)選來(lái)自如上所述的bZIP蛋白的組的TF或其部分或組合的DNA序列能夠在所述植物細(xì)胞中表達(dá)“發(fā)夾”RNA(hpRNA)。
所述DNA序列優(yōu)選地包括長(zhǎng)度足以根據(jù)在這里所述的方法尤其在種子和/或胚乳中，諸如優(yōu)選地在大麥胚乳中導(dǎo)致抑制的，選自SEQID NO2，SEQ ID NO4，SEQID NO6或SEQ ID NO7，SEQ IDNO8的序列及其任意的部分或組合。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于減少大麥胚乳中B-大麥醇溶蛋白和C-大麥醇溶蛋白的水平的分子生物學(xué)方法和手段。更具體地，本發(fā)明的目的是提供包括能夠形成hpRNA，且因此能夠減少所述胚乳基因表達(dá)的BLZ1和BLZ2基因的區(qū)域的基因構(gòu)建體。
更具體地，本發(fā)明提供了編碼能在大麥胚乳中形成能夠進(jìn)行PTGS的hpRNA的轉(zhuǎn)錄本的BLZ1和BLZ2基因的區(qū)域的基因構(gòu)建體。
在上述的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備具有降低的胚乳貯藏蛋白水平的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括(1)提供能夠再生成為可繁殖的植物的單子葉植物細(xì)胞，優(yōu)選大麥；(2)用包括在5′至3′方向閱讀的表達(dá)盒，種子特異性?xún)?yōu)選胚乳特異性的啟動(dòng)子，編碼調(diào)節(jié)內(nèi)源種子貯藏蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的核酸序列，另一種子-特異性?xún)?yōu)選沒(méi)有被調(diào)節(jié)待抑制的貯藏蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的胚乳-特異性的啟動(dòng)子，編碼目的異源多肽的核酸序列以及3′非翻譯區(qū)的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(3)再生所述植物細(xì)胞來(lái)提供具有調(diào)節(jié)種子貯藏蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的降低水平以及內(nèi)源貯藏蛋白的降低水平的第一轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也包括在單子葉種子中高水平表達(dá)目的異源多肽的DNA構(gòu)建體。此DNA構(gòu)建體包括在給定的單子葉種子中具有功能，并與編碼目的異源多肽的序列可操作連接的啟動(dòng)子；以及在給定單子葉種子中與功能性啟動(dòng)子可操作連接的編碼能夠形成在大麥胚乳中能夠進(jìn)行PTGS的hpRNA的轉(zhuǎn)錄本的BLZ1和BLZ2基因的區(qū)域的嵌合基因構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了諸如尤其是如上所述的，可通過(guò)在這里描述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物具有上述的目的特性，即抑制選擇的主要資源“庫(kù)″蛋白的表達(dá)以增強(qiáng)重組產(chǎn)生的目的蛋白的表達(dá)和累積。本發(fā)明優(yōu)選的植物包括大麥植物，例如大麥變種，其可用于本發(fā)明來(lái)在種子中表達(dá)和累積異源蛋白。本發(fā)明的大麥植物優(yōu)選地在其基因組序列中編碼在這里描述的優(yōu)選TFs諸如來(lái)自bZIP蛋白的組的TF或其部分。


圖1.由大麥cv.Skegla(開(kāi)花期后49天)利用水溶液萃取(條帶1)，鹽萃取(條帶2)和EtOH萃取(條帶3)獲得總蛋白進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳。箭頭表示B-(下面)和C-大麥醇溶蛋白(上面)。
圖2.利用a)引物SEQ ID NO9和SEQ ID NO10(參見(jiàn)實(shí)施例2)和b)引物SEQ ID NO12和SEQ ID NO13(實(shí)施例3)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析。產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，用溴化乙錠染色并在UV下照相。左邊的大小標(biāo)記物為EcoRI/HindIII-切割的λ。箭頭表示擴(kuò)增的產(chǎn)物。
圖3圖示了二元植物轉(zhuǎn)化載體pbDH101的克隆路線，該載體用于轉(zhuǎn)化具有在D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下在大麥胚乳組織中表達(dá)的密碼子-優(yōu)化的HoxB4-CBM嵌合基因的大麥?？s寫(xiě)D-hor，D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子；CBM，編碼來(lái)自Thermatoga maritima的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的密碼子優(yōu)化的基因；HoxB4，密碼子-優(yōu)化的(SEQ ID NO20)；L，接頭(PTPTPT；P為脯氨酸，T為蘇氨酸)；kd，KDEL序列；pinII，馬鈴薯蛋白酶抑制因子II基因終止信號(hào)；CaMV 35S，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；hph，來(lái)自E.coli的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Genebank登錄號(hào)，K01193)；Nos-ter，胭脂堿合成酶終止信號(hào)；R，右邊界；L，左邊界。
圖4圖示了構(gòu)建用于在D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下發(fā)夾RNA-誘導(dǎo)的靶向抑制大麥中BLZ1和BLZ2的基因構(gòu)建體。正義方向和反義方向中的114bp的BLZ1/BLZ2分別能在發(fā)夾環(huán)中形成莖部分而88bp內(nèi)含子4形成環(huán)。
圖5圖解了二元植物轉(zhuǎn)化載體pbDH104的克隆路線，用于轉(zhuǎn)化具有在D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下在大麥胚乳組織中hpRNA-誘導(dǎo)的靶向抑制BLZ1和BLZ2的大麥?？s寫(xiě)D-hor，D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子；hpB1/2，由獲自BLZ1和BLZ2的核苷酸序列(SEQ ID NO8)組成的620bp抑制因子片段；CBM，編碼來(lái)自Thermatoga maritima的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的密碼子-優(yōu)化的基因；HoxB4，密碼子-優(yōu)化的同源盒B4基因(SEQ ID NO20)；L，接頭(PTPTPT；P為脯氨酸，T為蘇氨酸)；pinII，馬鈴薯蛋白酶抑制因子II基因終止信號(hào)；CaMV 35S，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；hph，來(lái)自大腸桿菌的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Genebank登錄號(hào)K01193)；Nos-ter，胭脂堿合成酶終止信號(hào)；R，右邊界；L，左邊界。
發(fā)明詳述下面將具體描述本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)“蛋白”在這里與“多肽”和“肽”可互換使用。
術(shù)語(yǔ)“異源”在這里與術(shù)語(yǔ)“非天然”或“外來(lái)的”或“外源的”可互換使用，且應(yīng)用于通常在沒(méi)有經(jīng)受包括重組DNA技術(shù)的遺傳操作的宿主生物中未發(fā)現(xiàn)的蛋白和/或體外修飾的DNA序列。在這里使用的術(shù)語(yǔ)“目的異源多肽”或“目的多肽”是指用于在宿主生物中利用本發(fā)明的方法或組合物表達(dá)的任意多肽。作為非-限制的實(shí)例，藥用多肽(例如，用于藥物用途)或工業(yè)多肽(例如，酶)可按照本發(fā)明來(lái)制備。
術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指編碼特異性氨基酸序列的核苷酸序列。
“啟動(dòng)子”被定義為直接轉(zhuǎn)錄可操作連接的核酸的一系列核酸控制序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子是指控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”是指啟動(dòng)子(核酸表達(dá)控制序列，或系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))和第二核酸序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子”或“轉(zhuǎn)錄因子”是指其可結(jié)合于順式作用元件(也稱(chēng)作順式作用基序)的轉(zhuǎn)錄作用調(diào)節(jié)蛋白，所述順式作用元件是位于基因上游或內(nèi)含子內(nèi)的或終止密碼子下游的短DNA序列。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源基因”是指生物基因組中在其天然位置的天然基因。
術(shù)語(yǔ)“嵌合組合”或“嵌合基因”或“雜合基因”是指形成非內(nèi)源性基因的任意兩種或多種連接的DNA序列；包括通常在自然中不是一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和或編碼序列。術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”或“DNA構(gòu)建體”或“核酸構(gòu)建體”是指通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)策略裝配的任意的DNA序列或DNA序列的組合。
這里的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物的生物合成，包括正義(mRNA)，反義RNA或其它由DNA序列的RNA聚合酶-催化的轉(zhuǎn)錄形成的單-或雙-鏈形式的RNA聚合物的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)也可指mRNA由所述基因翻譯為多肽。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指將核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中，產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因”生物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指本發(fā)明的植物宿主細(xì)胞含有至少一個(gè)外來(lái)的，優(yōu)選兩個(gè)外來(lái)的穩(wěn)定地整合到基因組中的核酸分子。植物轉(zhuǎn)化方法的實(shí)例包括農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(DeBlaere等，1987等，1987)和粒子-轟擊或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等，(1987)；美國(guó)專(zhuān)利4,945,050)。
術(shù)語(yǔ)“反義抑制”或“反義”或“反義抑制”是指反義鏈充分互補(bǔ)于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或mRNA使得內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯和表達(dá)被抑制或減少。術(shù)語(yǔ)“靶向抑制”是指利用重組DNA技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)和應(yīng)用能夠編碼能干擾和抑制在某些活生物中選作抑制的內(nèi)源基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本的DNA序列。術(shù)語(yǔ)“抑制轉(zhuǎn)基因”是指編碼能夠干擾和抑制內(nèi)源基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本的任意DNA序列。術(shù)語(yǔ)“共-抑制”是指當(dāng)基因轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到細(xì)胞中并與相同細(xì)胞中的內(nèi)源基因具有相同或類(lèi)似序列時(shí)引起內(nèi)源基因和導(dǎo)入基因的抑制。
在這里使用的“bZIP”蛋白是指含有參與DNA結(jié)合和二聚化的所謂的堿性螺旋/亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域且通常結(jié)合于含有5′ACGT′3核心的DNA序列的調(diào)節(jié)蛋白。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“大麥醇溶蛋白”是指大麥中的貯藏蛋白并具體在胚乳中合成，且被分成4組β(β，也稱(chēng)作B-)，D-，C-和γ大麥醇溶蛋白。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“分子耕作”是指利用植物來(lái)產(chǎn)生用于進(jìn)一步加工的諸如蛋白的有價(jià)值的生物學(xué)化合物的方法。
可遺傳操作的單子葉植物可用于本發(fā)明。優(yōu)選植物為單子葉植物，更優(yōu)選選自大麥、玉米、小麥、燕麥和水稻。大麥具有許多目的特性，使其成為本發(fā)明優(yōu)選的候選物，尤其優(yōu)選的大麥種類(lèi)是大麥。可遺傳轉(zhuǎn)化的植物為可導(dǎo)入，表達(dá)，穩(wěn)定維持，以及被傳遞到隨后產(chǎn)生的子代中的異源DNA序列，包括用于編碼區(qū)DNA序列或編碼能夠形成hpRNA的RNA轉(zhuǎn)錄本的DNA序列的植物。遺傳操作和轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)用于利用除草劑包括例如除草肽或basta或抗生素，諸如潮霉素作為選擇性標(biāo)記產(chǎn)生大麥植物。
選擇合適的宿主植物后，選擇啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的異源基因的表達(dá)。大量在植物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子已描述在文獻(xiàn)中。優(yōu)選用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體中的啟動(dòng)子在累積所需的目的異源多肽的組織，諸如單子葉植物種子的胚乳中具有強(qiáng)烈的活性。進(jìn)一步優(yōu)選地選擇的啟動(dòng)子不受本發(fā)明方法靶向抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，諸如調(diào)節(jié)與目的異源基因表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)資源的內(nèi)源貯藏蛋白基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)。這種啟動(dòng)子可獲自各種植物遺傳物質(zhì)或來(lái)自植物病毒。如下所述，優(yōu)選特定選擇的啟動(dòng)子適于在單子葉植物種子中，更優(yōu)選地在大麥中，且最優(yōu)選地在種子的胚乳組織中表達(dá)異源蛋白。這種可用于本發(fā)明目的的合適啟動(dòng)子的克隆和分析描述在實(shí)施例2中。
更進(jìn)一步優(yōu)選分析選作用于目的異源蛋白累積的靶向組織中的蛋白分布表達(dá)譜且按照本發(fā)明鑒定用于靶向抑制的最豐富的貯藏蛋白。所述分析可依賴(lài)于現(xiàn)有技術(shù)諸如來(lái)自公開(kāi)文獻(xiàn)的資料。這也包括用微陣列法利用由在與選作驅(qū)動(dòng)異源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子該瞬間表達(dá)分布重疊的時(shí)間點(diǎn)的所述組織提取的mRNA，或利用Northern印跡分析，RT-PCR和/或Western印跡同時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)千基因的表達(dá)譜?；谑占男畔?，在時(shí)間和空間上與目的異源基因表達(dá)具有高度表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)的候選基因被選擇用于本發(fā)明的靶向抑制。
可通過(guò)將目的DNA序列連接(插入)到可在細(xì)菌宿主中復(fù)制的合適質(zhì)粒中來(lái)獲得本發(fā)明的重組質(zhì)粒。DNA序列，諸如編碼目的異源蛋白的基因或設(shè)計(jì)用于靶向抑制內(nèi)源基因的DNA序列優(yōu)選地被可操作插入到質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒除用于此目的的啟動(dòng)子之外如果需要，可含有其它的增強(qiáng)子DNA序列，支架-連接區(qū)域，內(nèi)含子，聚腺苷酸添加信號(hào)，核糖體結(jié)合序列以及目的選擇性標(biāo)記基因諸如潮霉素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，除草肽抗性基因等。
實(shí)施例下列實(shí)施例提供了本發(fā)明較好的解釋且用于指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)被理解為相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法。
方法
RNA提取和Northern印跡分析利用TRIzoI(Gibco BRL)按照產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)分離總RNA，且每一泳道按10μg的總RNA進(jìn)行電泳，并通過(guò)毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)入到Hybond N膜(Amersham)上。利用Stratolinker(Stratagene)將RNA與膜交聯(lián)，且如(Daviset等，1994)所述嚴(yán)格雜交濾膜并進(jìn)行沖洗。通過(guò)隨機(jī)引物(T7QuickPrime Kit；Pharmacia)按照產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)用32P放射性標(biāo)記探針。將EtBr-染色印跡的負(fù)片數(shù)字圖象用作負(fù)載對(duì)照。
大麥轉(zhuǎn)化a)用于遺傳轉(zhuǎn)化的植物材料將大麥cv Golden Promise種子播種在75％淺色水蘚泥炭和25％浮石(中等粒度)的混合物上且植物在日間18℃(16小時(shí))和12℃夜間(8小時(shí))以及70％相對(duì)濕度以及日間250μmol m-2s-1的冷-白色熒光中的連續(xù)光照下培養(yǎng)且根據(jù)需求用水地下灌溉。在這些條件下，植物培養(yǎng)生長(zhǎng)約55-95天或直至準(zhǔn)備好用于轉(zhuǎn)化的未成熟種子，其大約為開(kāi)花期后8至14天。種子在旋轉(zhuǎn)振蕩器中的3％次氯酸鈉中滅菌40分鐘并用無(wú)菌水沖洗五次。
b)用于植物轉(zhuǎn)化的菌株及制備物用具有反式二元載體和具有vir區(qū)域的Ti-質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)將具有調(diào)節(jié)目的異源蛋白表達(dá)的DNA構(gòu)建體的T-DNA區(qū)域?qū)氲酱篼溨小?br> 通過(guò)如Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)所描述的電穿孔進(jìn)行E.coli XL-Blue和根癌農(nóng)桿菌二者的轉(zhuǎn)化。為了準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化植物，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的單菌落接種在5ml的Agro培養(yǎng)基(胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸1g/L，KH2PO4250mg/L，MgSO4-7H2O 100mg/L，生物素1μg/L，pH7.0，25μg/ml利福平，50μg/ml狀觀霉素)中并在27℃培養(yǎng)24至40小時(shí)。在200μl培養(yǎng)物的無(wú)菌微量離心管中添加200μl的30％液態(tài)甘油(預(yù)先滅菌)并充分渦旋培養(yǎng)并在-80℃貯藏之前置于工作臺(tái)上2小時(shí)。為進(jìn)行每一次轉(zhuǎn)化，由-80℃冰箱移取一個(gè)管，解凍并將大約200μl的農(nóng)桿菌細(xì)菌原種添加至無(wú)抗生素的5ml Agro培養(yǎng)基中。然后在用于接種植物種子(參見(jiàn)下文)之前在27℃培養(yǎng)培養(yǎng)物17到20小時(shí)。
c)制備用于農(nóng)桿菌-誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大麥外植體大約開(kāi)花期后8至14天的一天挑選在約10個(gè)大麥頭，除去芒和種子且選擇1.5mm和2mm之間大小的胚芽。初始植物種子需要是健康和成熟的，而不是浸滿水的，且種子應(yīng)該是綠色的，沒(méi)有病征或真菌。種子置于50ml falcon管(不超過(guò)一半)中并用70％乙醇沖洗且然后倒掉乙醇。然后添加20％的漂白溶液(White King)并混合20分鐘。在薄層氣流通風(fēng)柜中倒掉漂白溶液，用無(wú)菌水沖洗種子(約5-8次)并將管置于4℃的CO/N。將兩個(gè)種子置于顯微鏡臺(tái)上的無(wú)菌皮式培養(yǎng)皿中。胚芽的位置位于遠(yuǎn)離種子切口的末端且產(chǎn)生沿著種子側(cè)面的切口。然后種子用鉗子固定并對(duì)種子的中部施加壓力使得胚芽突出來(lái)。
用鉗子固定胚芽并將解剖刀片插入到子葉盤(pán)和莖軸之間的凹槽中并且慢慢地切除莖軸。將除去莖軸的胚芽置于再生培養(yǎng)基上，切口朝上，在皮式培養(yǎng)皿的中心，每平皿具有約25個(gè)胚芽。
d)所有二元載體在含有100μg/ml狀觀霉素的E.coli XI-Blue LB培養(yǎng)基中37℃增殖且隨后利用QIAGENPlasmid Midi試劑盒由過(guò)夜培養(yǎng)的100ml培養(yǎng)物純化載體。通過(guò)將1μl(1μg)的載體放置在具有0.1cm缺口(BioRad)的無(wú)菌小玻璃管中用電穿孔將純化的二元載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌中，用40μl的電感受態(tài)細(xì)胞沖洗載體，且設(shè)置電壓在2.5kV以及電容在21uF用于電穿孔。將細(xì)胞涂布在含有100μg/ml狀觀霉素和20μg/ml利福平的YEP選擇平皿上，在28℃培養(yǎng)2天。由A.tumefaciens轉(zhuǎn)化體進(jìn)行質(zhì)粒限制性降解分析，然后來(lái)證明二元載體的完整性。
e)大麥外植體的農(nóng)桿菌感染將約20μl的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物吸取到每一胚芽上，確保所有胚芽和溶液接觸。輕彈胚芽(切面朝下)并且將再生培養(yǎng)基橫向拖拉至平皿的外面，除去過(guò)量的農(nóng)桿菌。然后以均勻的間距(每平皿25)將胚芽轉(zhuǎn)入新鮮的再生培養(yǎng)基平皿(切面朝上)上并在24℃置于黑暗箱中。
f)感染農(nóng)桿菌后大麥組織培養(yǎng)物中的再生和器官形成三天后，將胚芽轉(zhuǎn)入具有選擇性標(biāo)記諸如除草肽或潮霉素的新鮮再生培養(yǎng)基并保持四到六周，每?jī)芍芤品N一次。為了再生小芽，將愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)小芽的培養(yǎng)基(SIM)并且使愈傷組織存活并再生每?jī)芍苻D(zhuǎn)入新鮮的SIM的小芽直至形成小的幼苗。然后將幼苗轉(zhuǎn)入根-誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RIM)中并將成活的植物盆栽在土壤中用于進(jìn)一步的篩選。
DNA提取，PCR和克隆利用來(lái)自Clonetech的NucleoSpin Plant試劑盒并按照產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)由ca 200mg的嫩葉組織提取用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。在具有加熱的蓋的peltier熱循環(huán)儀(MJ Research，PTC-200)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用完全自動(dòng)的DNA合成儀(Perkin-Elmer)化學(xué)合成所有引物。在1％EtBr-染色的瓊脂凝膠上在紫外線燈下對(duì)所有DNA片段進(jìn)行大小分級(jí)并利用QIAquickGel Extration試劑盒(Qiagen)純化。限制性酶購(gòu)自New England Biolabs Inc(Beverly，Mass.)和Fermentas并按照產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行使用?？寺〖捌渌麯NA操作按照Maniatis等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，但所有連接反應(yīng)使用以下條件在緩沖液[50mM Tris-HCl(pH7.6)，5mM MgCl2，1mM DTT，0.5mM ATP，2.5％聚乙二醇-8000]中T4DNA連接酶(2.5U)16℃，16小時(shí)。感受態(tài)的大腸桿菌XL-Blue用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的受體用于DNA操作和質(zhì)粒克隆的構(gòu)建。利用QiagenPlasmid Midi試劑盒(Qiagen)制備所有質(zhì)粒DNA midi制備物并利用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI，Pharmacia)測(cè)定DNA片段的序列。
實(shí)施例1大麥胚乳中“庫(kù)”蛋白的分析可利用由開(kāi)花期后49天收集的種子中提取的蛋白的SDS-PAGE來(lái)鑒定那些對(duì)胚乳的總蛋白水平起主要貢獻(xiàn)的胚乳-表達(dá)的蛋白大麥種子品種Skegla中的蛋白表達(dá)分析且，因此，用作靶向抑制的潛在候選物。在添加合適的提取緩沖液之前將來(lái)自大麥的五個(gè)莖軸的所有種子在液氮中手工精細(xì)地研磨。兩種提取緩沖液，除水提取之外用于二樣品。首先，在還原條件下在1％的2-巰基乙醇，10mM Tris-HCl pH8.0和1％聚乙烯吡咯烷(MW 360.000)存在下用乙醇提取(70％EtOH)進(jìn)行總蛋白的提取。其次，在還原條件下在170mM NaCl，1％2-巰基乙醇，10mM Tris-HCl pH8.0和1％聚乙烯吡咯烷啶(MW 360.000)存在下提取總蛋白。在液氮中研磨樣品后將提取緩沖液添加于提取小瓶中然后繼續(xù)研磨3分鐘。通過(guò)在40℃4000rpm離心10分鐘純化提取物，然后在Ultrafree-4濃縮器中用分子5kDa截流(UFV4BCC00-Millipore Corp.Bedford，MA，USA)十倍離心濃縮。100μl純化的樣品，濃縮的提取物添加到100μl的2×樣品緩沖液中且將混合物置于沸水浴中5分鐘。冷卻后，將10μl樣品裝載在12％聚丙烯酰膠凝膠上用SDS PAGE分離。SDS-后用考馬斯藍(lán)R250著色劑染色，并脫色觀察蛋白帶。結(jié)果表明大麥品種Skegla的發(fā)育胚乳中最豐富的蛋白為B-和C-大麥醇溶蛋白(圖1)。
結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明抑制調(diào)節(jié)編碼B和C大麥醇溶蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子非常可能減少資源競(jìng)爭(zhēng)并允許增加表達(dá)的異源多肽的累積。
實(shí)施例2用作外源蛋白表達(dá)的大麥中B-和C-大麥醇溶蛋白靶向抑制的啟動(dòng)子的選擇
B-大麥醇溶蛋白(GenBank登錄號(hào)X53690)和C-大麥醇溶蛋白(GenBank登錄號(hào)M36941)的基因啟動(dòng)子包含100％相同的在參與它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的二者中鑒定的順式作用元件(Muller and Knudsen 1993；Vicente-Carbajosa等，1992)。這些順式元件在位于翻譯起始密碼子上游約300bp的所謂胚乳盒(EM)內(nèi)。EM停泊兩種用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的不同順式作用基序，醇溶蛋白盒(PB)，5′-TGTAAAG-3′和GCN4-樣基序(GLM)，5′-(G/A)TGA(G/C)TCAT-3′。GLM由兩種轉(zhuǎn)錄因子BLZ1(GenBank登錄號(hào)X80068)，和BLZ2(GenBank登錄號(hào)X80068)識(shí)別。在結(jié)合后，特定基因的轉(zhuǎn)錄被激活(參見(jiàn)Onate等，1999)。此兩個(gè)基因?yàn)閱慰截惢蚯乙虼耸怯糜诒景l(fā)明所述靶向抑制的良好候選物。Vieente-Carbajosa等，(1998)測(cè)定了它們?cè)谒矔r(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的反義抑制而沒(méi)有研究對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或?qū)A藏蛋白累積的影響。此外，還沒(méi)有研究這種抑制對(duì)異源蛋白在相同組織中累積的影響。本發(fā)明工程操作的靶向抑制中的重要原則是驅(qū)動(dòng)編碼目的異源蛋白的轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子不應(yīng)包含由負(fù)責(zé)待抑制貯藏蛋白表達(dá)的特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子所識(shí)別的順式作用基序。由于B-和C-大麥醇溶蛋白包含被BLZ1和BLZ2識(shí)別的GLM，B-和C-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子不能用于驅(qū)動(dòng)編碼目的異源蛋白的異源轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。另一個(gè)重要原則是驅(qū)動(dòng)抑制因子轉(zhuǎn)基因本身的啟動(dòng)子由組織特異性，例如胚乳-特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，使得轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在其它可能需要的組織中的表達(dá)將不被影響。這是很重要的，因?yàn)樵S多轉(zhuǎn)錄因子，諸如大麥中的BLZ1，在不止一種組織中表達(dá)。另一個(gè)原則是通過(guò)利用啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)不具有被本發(fā)明待抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的抑制因子轉(zhuǎn)基因避免抑制因子轉(zhuǎn)基因的“自我-抑制”。
基于這些原則，選擇候選啟動(dòng)子來(lái)靶向抑制B-和C-大麥醇溶蛋白。
來(lái)自大麥cv Skegla的D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子的分離、克隆和分析基于GenBank序列id.X84368所述的D-大麥醇溶蛋白基因的翻譯起始位點(diǎn)作為如下的正義引物和翻譯引物設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增-435到-16的鄰近啟動(dòng)子區(qū)域，正義引物為5′GGAATTCCEcoR1CTTCGAGTGCCCGCCGAFGCCAGCAATGG(SEQ IDNO9)，具有在5′末端導(dǎo)入的EcoRI限制性位點(diǎn)，反義引物為5′ATAAGAATGCGGCCGCNotlAATGAATTGATCTCTAGTTTTGTGG(SEQ ID NO10)，具有在5′末端導(dǎo)入的NotI限制性位點(diǎn)。在引物的5′末端導(dǎo)入這些限制性位點(diǎn)的目的是有助于克隆擴(kuò)增的片段。利用來(lái)自大麥cv.Skegla的基因組DNA作為模板用于擴(kuò)增420bp片段的反應(yīng)溶液的組合物如下基因組DNA溶液 4μl(50ng)無(wú)菌水 12μl10×PCR緩沖液[100mM Tris-HCl(8.8)500mM KCl，0.8％Nonidet P40] 2.5μl50pmol/μl正義引物 1μl(50pmol)50pmol/μl反義引物 1μl(50pmol)MgCl21μl(2.5mM)dNTP2.5μl(1mM)Taq DNA聚合酶(Fermentas)1μl(5U)總計(jì)25μl徹底混合上述反應(yīng)溶液，除9μl無(wú)菌水和Tag DNA聚合酶，且加熱溶液到94℃3分鐘，然后冷卻至80℃30秒并添加Tag DNA聚合酶和9μl的無(wú)菌水。第一循環(huán)的PCR進(jìn)行如下反應(yīng)加熱至94℃30秒，冷卻至57℃30秒用于退火，然后加熱至72℃45秒用于延伸。緊接著如下30個(gè)循環(huán)94℃熱變性30秒，62℃退火30秒并72℃延伸45秒。30個(gè)循環(huán)完成后，反應(yīng)在72℃加熱4分鐘。420bp擴(kuò)增的片段(圖2a)用EcoRI/NotI降解然后連接于pKOH122載體的EcoRI/NotII位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生重組質(zhì)粒pDH104。然后測(cè)定420bp DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO11)的插入。根據(jù)序列，D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子不包含GLM且因此，通過(guò)靶向抑制BLZ1或BLZ2抑制B-并C-大麥醇溶蛋白(參見(jiàn)上述的討論)將不影響D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子的活性和目的異源蛋白的表達(dá)。此外，由于D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子是胚乳-特異性的，此啟動(dòng)子可用于設(shè)計(jì)用于抑制BLZ1和BLZ2表達(dá)的抑制因子轉(zhuǎn)基因。
由于關(guān)鍵是避免抑制因子轉(zhuǎn)基因的“自我-抑制”，通過(guò)利用啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)不具有被本發(fā)明抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的抑制因子轉(zhuǎn)基因，利用缺少GLM的D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)抑制BLZ1和BLZ2的抑制因子基因，將不會(huì)導(dǎo)致這種“自我-抑制”。
實(shí)施例3D-大麥醇溶蛋白編碼區(qū)的克隆和D-大麥醇溶蛋白基因在mRNA水平的內(nèi)源表達(dá)的分析正義引物，5′GGAATTCCEcoR1ATGGCTAAGCGGCTGGTCCTC(SEQ ID NO12)，和反義引物，5′GGAATTCCEcoRITTGCAATTGGATAGGTCTCTTG(SEQID NO13)，被設(shè)計(jì)來(lái)由如GenBank序列id.X84368所描述的D-大麥醇溶蛋白基因的編碼區(qū)擴(kuò)增727bp的片段。利用來(lái)自Hordeum vulgarecv.Skegla的基因組DNA作為模板，用于擴(kuò)增727bp片段的反應(yīng)溶液的組合物如下基因組DNA溶液4μl(50ng)無(wú)菌水 12μl10×PCR緩沖液[100mM Tris-HCl(8.8) 2.5μl500mM KCl，0.8％Nonidet P40]50pmol/μl正義引物 1μl(50pmol)50pmol/μl反義引物 1μl(50pmol)MgCl21μl(2.5mM)dNTP 2.5μl(1mM)Taq DNA聚合酶(Fermentas) 1μl(5U)總計(jì) 25μl
徹底混合上述反應(yīng)溶液，除9μl無(wú)菌水和Tag DNA聚合酶，且溶液加熱到94℃3分鐘，然后冷卻至80℃30秒并添加Tag DNA聚合酶和9μl的無(wú)菌水。第一循環(huán)的PCR進(jìn)行如下反應(yīng)加熱至94℃30秒，冷卻至60℃30秒用于退火，然后加熱至72℃45秒用于延伸。緊接著如下30個(gè)循環(huán)94℃熱變性30秒，65℃退火30秒并在72℃延伸45秒。30個(gè)循環(huán)完成后，反應(yīng)在72℃加熱4分鐘。用EcoRI降解727bp的擴(kuò)增片段(圖2b)然后連接于pKOH122載體的EeoRI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生重組質(zhì)粒pDH136。然后測(cè)定DNA插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO14)。
利用Northern印跡分析適當(dāng)?shù)胤治雠呷?0DAP，胚芽40DAP，葉子、莖和根中D-大麥醇溶蛋白基因的mRNA穩(wěn)定水平總RNA分離自200-250mg來(lái)自大麥cv Skegla的不同組織或植物部分的植物材料，在1.2％瓊脂-甲醛凝膠上分離并根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)點(diǎn)樣在Zeta-探針膜(Millipore，Bedford，Mass.)上。如(Davis等，1994)所描述進(jìn)行點(diǎn)樣、雜交和沖洗。利用D-大麥醇溶蛋白基因(SEQ ID NO14)的32P放射性標(biāo)記的，隨機(jī)-引物延伸的747bp片段作為探針進(jìn)行雜交。
實(shí)施例4將大麥胚乳-密碼子-優(yōu)化的HoxB4克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pbDH101中通過(guò)GeneArt GmbH(德國(guó))，利用如(參見(jiàn)申請(qǐng)人的共同懸而未決的申請(qǐng)“在植物中利用密碼子優(yōu)化高水平表達(dá)多肽的方法”)所描述的GeneBank ID NM_O24015中所述的基本序列信息和用于在胚乳中D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下密碼子-優(yōu)化表達(dá)的密碼子-用法信息，合成大麥中D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)的密碼子-優(yōu)化的HoxB4。通過(guò)NcoI位點(diǎn)(CCATGG)側(cè)接791bp的片段(SEQ ID NO20)用于克隆且包括編碼3′末端的接頭-腸激酶切割位點(diǎn)DDDDKPTPTPT的27核苷酸序列。HoxB4片段被連接于pKOH122的NcoI/NcoI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生pDH170。然后用NcoI釋放片段并連接到pDH152中的NcoI位點(diǎn)，取代pDH152中的EK-L片段來(lái)產(chǎn)生pDH156。然后將來(lái)自pDH104的D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子片段連接到pDH156的EcoRI/NotI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生pDH157。用Sse83871/SfI釋放D-啟動(dòng)子/SP/HoxB4-E-L/CBM/kd/pinII片段并連接到pKOH250的Sse83871/SfI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體pbDH101(圖3)。
實(shí)施例5具有在D-大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下的BLZ1和BLZ2的發(fā)夾RNA-誘導(dǎo)的靶向抑制的植物轉(zhuǎn)化載體pbDH104的構(gòu)建通過(guò)GeneArt GmbH(德國(guó))合成用于BLZ1和BLZ2的發(fā)夾RNA-誘導(dǎo)的靶向抑制的基因作為592bp抑制因子片段繼之以265bp nos-末端片段(SEQ ID NO8)，并克隆到pUC19中的HindIII/EcoRI位點(diǎn)中來(lái)產(chǎn)生pDH144。該片段是來(lái)自形成正義和反義臂的BLZ1-基因(SEQIDNO2)和BLZ2-基因(SEQ ID NO4)的核苷酸序列，和被設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)錄后形成RNA發(fā)夾環(huán)(圖4)的表示來(lái)自BLZ1基因(GenBank序列id.X80068)的內(nèi)含子4的88bp核苷酸序列的嵌合組合物。用SacII/EcoRI釋放857bp片段hpB1/2-nos且取代pDH158中的反義BLZ1-nos片段來(lái)產(chǎn)生pDH160。用Sse83871/SgfI降解釋放pDH160中的完全插入子并連接到pKOH250的Sse83871/SgfI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生二元植物轉(zhuǎn)化載體pbDH104(圖5)，所述二元植物轉(zhuǎn)化載體能夠?qū)⑤d體的左邊界(L)和右邊界(R)之間的DNA序列穩(wěn)定整合到植物基因組中。
實(shí)施例6用pbDH101和pDH104遺傳轉(zhuǎn)化大麥開(kāi)花后約8至14天收獲大麥cv Golden Promise未成熟種子，并在4℃黑暗中貯藏過(guò)夜。冷-溫育的未成熟種子在70％EtOH中處理1分鐘然后在0.6％氯化鈉中處理10分鐘，繼之以在無(wú)菌蒸餾水中徹底沖洗(5-8次)，并置于無(wú)菌條件下在層流凈化罩中的解剖顯微鏡下的無(wú)菌Petri平皿中。胚芽的位置位于種子切口的末端并沿著種子側(cè)面產(chǎn)生切割。然后用鉗子固定種子并對(duì)種子的中部施加壓力使得胚芽被擠出。用鉗子固定胚芽，將解剖刀片插入到子葉盤(pán)和莖軸之間的凹槽中并且慢慢地切除莖軸。將子葉盤(pán)置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，切面朝上，并用25μl至40μl的攜帶植物轉(zhuǎn)化載體的全強(qiáng)度根癌農(nóng)桿菌接種1至5分鐘。接種后，將子葉盤(pán)拉至平皿的外面來(lái)降低細(xì)菌載量和減少共培養(yǎng)階段的過(guò)度生長(zhǎng)。將感染的子葉盤(pán)轉(zhuǎn)入新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基平皿且在24℃遮光溫育平皿3天時(shí)間。3天后將子葉盤(pán)轉(zhuǎn)入新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中具有100μg/ml用于殺死農(nóng)桿菌的timentin和50μg/ml用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的潮霉素，在24℃遮光培養(yǎng)4周時(shí)間，2周后繼代培養(yǎng)。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入包括2.5mg/L BAP，50μg/mltimentin和25μg/ml潮霉素的小芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在高亮度中培養(yǎng)4至10周。將個(gè)體再生幼苗轉(zhuǎn)入根培養(yǎng)基(50μg/ml timentin和25μg/ml潮霉素且沒(méi)有激素)。發(fā)育至具有根的5到7cm小芽后，將轉(zhuǎn)基因植物移到土壤中并在完全的光下培養(yǎng)。
實(shí)施例9靶向抑制BLZ1和BLZ2后HoxB4-CBM蛋白的累積為測(cè)定B-和C-大麥醇溶蛋白在用pbDH101(僅hoxB4-ebm)或pbDH104(用hoxB4-cbm表達(dá)的BLZ1/2hpRNA)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中的累積，可使用Smith(The Protein Protocols Handbooked.，Walker，第二版，Humana Press，2002)描述的膠體考馬斯亮藍(lán)G法。然后用SDS-PAGE和標(biāo)準(zhǔn)蛋白由種子提取物分離可溶性蛋白，隨后用染色溶液(0.04％(w/v)亮藍(lán)G的3.5％(w/v)高氯酸溶液)對(duì)凝膠染色1小時(shí)，然后在蒸餾水中脫色4小時(shí)。用掃描密度測(cè)定法分析相應(yīng)的B-和C-大麥醇溶蛋白條帶的強(qiáng)度并比較用pbDHI01或pbDH104轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中的相對(duì)條帶強(qiáng)度。產(chǎn)生了對(duì)由BLZ1/2hpRNA引起的B-和C-大麥醇溶蛋白的抑制的評(píng)價(jià)。用pbDH101或pbDH104轉(zhuǎn)化的植物中HoxB4-CBM的同一性和表達(dá)水平可通過(guò)包含一式兩份樣品的相同凝膠的片段的Western印跡進(jìn)行證明和測(cè)定?？衫肂iorad′s Mini transblot細(xì)胞將條帶由凝膠片段電點(diǎn)樣到硝化纖維膜上，但凝膠片段的外形在印跡之前在濾紙上進(jìn)行標(biāo)記。印跡和凝膠膜夾心分解后，用抗CBM的多克隆抗血清雜交硝化纖維，且多次沖洗步驟后(2*5分鐘，2*15分鐘，1*5分鐘)，與結(jié)合于辣根過(guò)氧化酶(HRP)的次級(jí)抗體一起溫育45分鐘。隨后的沖洗步驟后，如上所述，且在添加底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基藍(lán)四唑氯化物于膜后，HRP顯色反應(yīng)陽(yáng)性鑒定條帶為HoxB4-CBM且產(chǎn)生和判斷了BLZ1/2hpRNA表達(dá)對(duì)hoxB4-CBM水平的影響。
盡管僅僅具體描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可預(yù)料能產(chǎn)生本發(fā)明上述實(shí)施例所述的大量的改進(jìn)和變化，只要不背離本發(fā)明的精神和范圍。
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序列表<110>ORF Liftaekni hf.
<120>通過(guò)靶向抑制內(nèi)源貯藏蛋白增強(qiáng)植物種子中異源多肽的累積(ENHANCINGACCUMULATION OF HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES INPLANT SEEDS THROUGH TARGETED SUPPRESSION OF ENDOGENOUS STORAGE PROTEINS)<130>P3505PC00<150>IS 6931<151>2003-08-27<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>251<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Met Ser Ser Phe Leu Ile Asn Ser Asn Tyr Val Asp Pro Lys1 5 10 15Phe Pro Pro Cys Glu Glu Tyr Ser Gln Ser Asp Tyr Leu Pro Ser Asp20 25 30His Ser Pro Gly Tyr Tyr Ala Gly Gly Gln Arg Arg Glu Ser Ser Phe35 40 45Gln Pro Glu Ala Gly Phe Gly Arg Arg Ala Ala Cys Thr Val Gln Arg50 55 60Tyr Ala Ala Cys Arg Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro65 70 75 80Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ser Pro Arg Ala Pro Ala Pro85 90 95Pro Pro Ala Gly Ala Leu Leu Pro Glu Pro Gly Gln Arg Cys Glu Ala100 105 110
Val Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ala Gln Asn Pro Leu His115 120 125Pro Ser Pro Ser His Ser Ala Cys Lys Glu Pro Val Val Tyr Pro Trp130 135 140Met Arg Lys Val His Val Ser Thr Val Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Gly145 150 155 160Glu Pro Lys Arg Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Gln Gln Val Leu Glu165 170 175Leu Glu Lys Glu Phe His Tyr Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg180 185 190Val Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Ser Glu Arg Gln Ile Lys Ile195 200 205Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp His Lys Leu Pro210 215 220Asn Thr Lys Ile Arg Ser Gly Gly Ala Ala Gly Ser Ala Gly Gly Pro225 230 235 240Pro Gly Arg Pro Asn Gly Gly Pro Arg Ala Leu245 250<210>2<211>1173<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>2atggagcgcg tcttctccgt cgaggagatc cccgacccgt tctggggcca gccgtcgccg 60cggcagcgcg ggcgccggcc gccggagggc gccatgaacc ggtgcccgtc cgagtggtac120ttccagaagt tcctcgagga ggccgtgctc gacagccccg ccgccgaccc tagcccgatg180tccggtgcta gcggacgagg tcaagcggcc tgccgtccgc gtggcgtggc ggggacggcg240
acgggcccgg cggtggaccc ggtggagtac aacgccatgc tcaagcagaa gctcgagaag300gacctcgccg ccgtcgccat gtggagggcc tctggtgcca tgcctccaga acgttttgca360gctagtccgt catgcccaaa tgcagatggt cagcatatag gcactattaa tcccatagga420ggtaatgtgg ttccacttca aaacaagcta gctggtggcg caagcggggt gtcgggtcca480catctggtac aaaatgctga tgcccttgta aagcaagccg ctagctcttc ttcgcgggag540cagtcagaag atgatgatat ggaaggagaa gatgagatca ctgggaatgg ggtccctact600gatcaaaggc tgcggaggag gaagcaatcc aatcgggaat cggccaggcg ttcaagaagc660agaaaggcag ctcacctgaa tgaactcgaa gcacaggtat cacagttaag agttgaaaac720tcctcgctgt taaggcggct tgctgatgtt aatcagaaat acaatggtgc tgctgttgac780aatagggtgt taaaggcgga tgttgaaacc ttaagagcaa aggtgaagat ggccgaggac840tcggtgaagc gggtgacagg catgagcgct ctgttccctg cagggtccga catgtcatct900ctcagcatgc ccttcactgg ctctccatca gaagccacct ccgacgctgc gttcccggac960gacctgagcg cttacttctc cacaagcgag gctggaggta acaacggata catgcccgag 1020atggcttcct cggcgcaaga ggatgacaac ttcctcaacg agaccatgga taccagcaag 1080atgggcagac ccgactcgct gcatcgtgtg gcgagcctgg agcacctcca gaagaggatg 1140tgcggcgggc cagcttcgtc cggatcgacc tca1173<210>3<211>334<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>3ggccgaggac tcggtgaagc gggtgacagg catgagcgct ctgttccctg cagggtccga 60catgtcatct ctcagcatgc ccttcactgg ctctccatca gaagccacct ccgacgctgc120gttcccggac gacctgagcg cttacttctc cacaagcgag gctggaggta acaacggata180catgcccgag atggcttcct cggcgcaaga ggatgacaac ttcctcaacg agaccatgga240taccagcaag atgggcagac ccgactcgct gcatcgtgtg gcgagcctgg agcacctcca300gaagaggatg tgcggcgggc cagcttcgtc cgga334
<210>4<211>1230<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>4atggagcccg tgttctcact gctggaggag gcgatgcccg agcccgactc taaccccggt 60cggacctcgc cgccgcagct gcaggcacac gtgctcgccg gaggagtcag aggagcagga120ggagtgggcg tcggtgagat cgttggcgat ggcgcgacag aattgtgctt cgacaagtcc180atggaggagc cgtcgctgct caacgtcccc acggagccag tggcgaaccc ggacgcctcg240acgcttcacc ctaatcccac ggcggaggtg agccgcaaga ggcggtacga cgttcatgag300gaggaggagg tggtgggggt catccccacg ccgcctgcgg cgggcgcggt gctggacccc360gtgggctaca acgcgatgct gagacggaag ttggacgcgc atctcgccgc cgtcgccatg420tggaggacta ctcgaggaat ttgccgacaa agctcccatg acaatagagc atcacaaaat480ccagattcta tccaaggctc agaaaatcac actggagatg ctagtgtgca acaacttagc540tcttcctcat gggagccatc accatcggat gatgatatgg aaggggaggc acaaacaatt600ggaactatga atattagtgc agagaaagtg aacaaaagaa aagaatctaa ccgggattcg660gcgagacgct caaggagtag aaaagcagct catacgaagg aactagagga gcaagtctca720ctattaagag ttgcaaataa ctccttgatg agacatctag cagatgtaag tcacagatac780gtcaataccg ctattgacaa tagggtattg aaggcaaatg ttgaaaccct agaagcaaag840gtaaagatgg ccgaggaaac tatgaagaga attacatcca ccaacaattt cccccaagca900atatctggca tgtcatctct caggacccat ttcagtggtt cccaattgga tggcatcttt960gatactacat tgccaaccca aaacatgtca cttaaccatt tttccactac agcaacaaat 1020tttgatgtga gcagcaacta catccccgag ctagctccgg cataccagat ccatgatcaa 1080atatcttcgc tacatacgca acctatgcca tgcttggatc atcacccacg gaggatgccc 1140tttggtattc caagtacatt ggtgcctacc ccacaacggg aatccactac attggattca 1200aatgaaatag gcaacatggt gatgcagtag1230
<210>5<211>733<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>5gatactacat tgccaaccca aaacatgtca cttaaccatt tttccactac agcaacaaat 60tttgatgtga gcagcaacta catccccgag ctagctccgg cataccagat ccatgatcaa120atatcttcgc tacatacgca acctatgcct gcttggatca tcacccacgg aggatgccct180ttggtattcc aagtacattg gtgcctaccc cacaacggga atccactaca ttggattcaa240atgaaatagg caacatggtg atgcagtagg aattatgtga gagacctgag ccggaattat300tattttaaaa taaatattgt cgttgttctt ggtggccatt gggggtattt gtaatggttt360ctcaccttgt taagctcaga cttgtttaag gccggccggg gccgaggact cggtgaagcg420ggtgacaggc atgagcgctc tgttccctgc agggtccgac atgtcatctc tcagcatgcc480cttcactggc tctccatcag aagccacctc cgacgctgcg ttcccggacg acctgagcgc540ttacttctcc acaagcgagg ctggaggtaa caacggatac atgcccgaga tggcttcctc600ggcgcaagag gatgacaact tcctcaacga gaccatggat accagcaaga tgggcagacc660cgactcgctg catcgtgtgg cgagcctgga gcacctccag aagaggatgt gcggcgggcc720agcttcgtcc gga 733<210>6<211>346<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>6ccgcggactg ggaatggggt ccctactgat caaaggctgc ggaggaggaa gcaatccaat 60cgggaatcgg ccaggcgttc aagaagcaga aaggcagctc acctgaatga actcgaagca120ctcgagcagg tttgacaatt tacattgttg tttcttgact ggcagtggat tctgaaaaag180gcgctaatga gtttttgttg tggatggctc gttacaggtt agatcttgct tcgagttcat240tcaggtgagc tgcctttctg cttcttgaac gcctggccga ttcccgattg gattgcttcc300tcctccgcag cctttgatca gtagggaccc cattcccagt tctaga 346
<210>7<211>358<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>synthesized portion of BLZ1 cDNA<400>7ccgcggacaa acaattggaa ctatgaatat tagtgcagag aaagtgaaca aaagaaaaga 60atctaaccgg gattcggcga gacgctcaag gagtagaaaa gcagctcata cgaaggaact120agaggactcg agcaggtttg acaatttaca ttgttgtttc ttgactggca gtggattctg180aaaaaggcgc taatgagttt ttgttgtgga tggctcgtta caggttagat cttcctctag240ttccttcgta tgagctgctt ttctactcct tgagcgtctc gccgaatccc ggttagattc300ttttcttttg ttcactttct ctgcactaat attcatagtt ccaattgttt gttctaga 358<210>8<211>857<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>sequence encoding hpRNA，stem from both BLZ1 andBLZ2<400>8aagcttccgc ggactgggaa tggggtccct actgatcaaa ggctgcggag gaggaagcaa 60tccaatcggg aatcggccag gcgttcaaga agcagaaagg cagctcacct gaatgaactc120gaagcaacaa acaattggaa ctatgaatat tagtgcagag aaagtgaaca aaagaaaaga180atctaaccgg gattcggcga gacgctcaag gagtagaaaa gcagctcata cgaaggaact240agaggactcg agcaggtttg acaatttaca ttgttgtttc ttgactggca gtggattctg300aaaaaggcgc taatgagttt ttgttgtgga tggctcgtta caggttagat cttcctctag360ttccttcgta tgagctgctt ttctactcct tgagcgtctc gccgaatccc ggttagattc420ttttcttttg ttcactttct ctgcactaat attcatagtt ccaattgttt gttgcttcga480gttcattcag gtgagctgcc tttctgcttc ttgaacgcct ggccgattcc cgattggatt540gcttcctcct ccgcagcctt tgatcagtag ggaccccatt cccagttcta gagaagcaga600
tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat660gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat720gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc780gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat840gttactagat cgaattc 857<210>9<211>39<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>synthesized primer<400>9ggaattccct tcgagtgccc gccgatttgc cagcaatgg39<210>10<211>41<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>synthesized primer<400>10ataagaatgc ggccgcaatg aattgatctc tagttttgtg g 41<210>11<211>414<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>11ccttcgagtg cccgccgatt tgccagcaat ggctaacaga cacatattct gccaaaaccc 60cagaacaata atcacttctc gtagatgaag agaacagacc aagatacaaa cgtccacgct120tcagcaaaca gtaccccaga actaggatta agccgattac gcggctttag cagaccgtcc180ctgttttgca aagctccaat tcctccttgc ttatccaatt tcttttgtgt tggcaaactg240cacttgtcca accgattttg ttcttcccgt gtttcttctt aggctaacta acacagccgt300
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<223>synthesized primer<400>12ggaattccat ggctaagcgg ctggtcctc 29<210>13<211>30<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>synthesized primer<400>13ggaattcctt gcaattggat aggtctcttg 30<210>14<211>3<212>DNA<213>Hordeum vulgare<400>14ggg3<210>15<211>791<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>synthesized cDNA<400>15ccatggcaat gagctccttc ttgatcaact ccaactacgt ggatcccaag ttcccaccat 60gcgaggagta ctcccaaagc gattacctcc ccagcgatca ttccccaggg tactacgccg120
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1.一種增強(qiáng)植物種子中目的異源多肽的表達(dá)和累積的方法，所述方法包括(a)用種子-特異性啟動(dòng)子的DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述啟動(dòng)子與編碼一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TF)或其部分，包括不同TF的嵌合組合可操作連接，調(diào)節(jié)一或多種編碼種子貯藏蛋白的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述序列的轉(zhuǎn)錄鏈能夠抑制、延緩或減少所述植物細(xì)胞中一或多種所述種子貯藏蛋白的表達(dá)，和(b)選擇沒(méi)有被(a)中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的種子-特異性啟動(dòng)子，和(c)用(b)中的種子-特異性啟動(dòng)子的DNA序列轉(zhuǎn)化(a)中的相同或其它的植物細(xì)胞，所述種子-特異性啟動(dòng)子與編碼目的異源多肽的DNA序列可操作性連接；(d)由所述轉(zhuǎn)化的植物宿主細(xì)胞再生植物，并在使所述編碼一或多種TF或其部分的DNA序列被轉(zhuǎn)錄的條件下培養(yǎng)所述植物，由此減少所述內(nèi)源mRNA的表達(dá)，因此減少所述種子貯藏蛋白的表達(dá)，且由此增強(qiáng)所述異源目的多肽的表達(dá)和累積。
2.權(quán)利要求1的方法，其中編碼一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TF)或其部分的所述序列的轉(zhuǎn)錄鏈能夠形成可抑制、延緩或減少所述植物細(xì)胞中一或多種所述種子貯藏蛋白的表達(dá)的“發(fā)夾”RNA。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述植物宿主細(xì)胞選自單子葉植物。
4.權(quán)利要求的方法3，其中所述植物宿主細(xì)胞選自包含大麥、玉米、小麥、燕麥和水稻的單子葉植物。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a)的所述DNA序列和步驟(b)的所述DNA序列可操作地連接在一個(gè)DNA序列中。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a)的所述DNA序列和步驟(b)的所述DNA序列導(dǎo)入到相同的植物細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a)的所述DNA序列被導(dǎo)入到第一植物宿主細(xì)胞的基因組中，且其中所述步驟(b)的DNA序列被導(dǎo)入到第二植物宿主細(xì)胞的基因組中。
8.權(quán)利要求7的方法，其中由所述第一植物宿主細(xì)胞再生第一轉(zhuǎn)基因植物并由所述第二植物宿主細(xì)胞產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因植物，且其中由所述第一和第二轉(zhuǎn)基因植物間的有性雜交產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的子代群體。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述一或多種種子貯藏蛋白是大麥的大麥醇溶蛋白。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中編碼目的異源多肽的所述DNA序列編碼來(lái)自原核或真核生物的蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中編碼目的異源多肽的所述DNA序列編碼來(lái)自嗜熱生物的蛋白。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述序列編碼碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。
13.權(quán)利要求10的方法，其中編碼原核的或真核生物蛋白的所述DNA序列選自如下蛋白的DNA序列膠原蛋白，膠原酶，同源盒多肽，單克隆抗體，分泌的抗體，單鏈抗體，甘露糖-結(jié)合的凝集素，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，酪蛋白，人生長(zhǎng)激素，人血清白蛋白，人胰島素，纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶，肌醇六磷酸酶，水解酶，過(guò)氧化物酶，纖維蛋白原，因子IX，因子X(jué)III，凝血酶，蛋白C，木聚糖酶，異淀粉酶，葡糖淀粉酶，淀粉酶，溶菌酶，β-葡聚糖酶，葡糖腦苷脂酶，酪蛋白，乳糖酶，尿素酶，葡萄糖異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)化酶，鏈霉親和素，酯酶，堿性磷酸酶，蛋白酶抑制因子，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜酶，激酶，磷酸酶，脫氧核糖核酶，核糖酶，磷脂酶，脂酶，漆酶，蛛絲蛋白，抗凍蛋白，抗微生物肽或防衛(wèi)素，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞分裂素。
14.權(quán)利要求13的方法，其中編碼真核生物蛋白的所述DNA序列為編碼HoxB4蛋白的人同源盒B4(HoxB4)基因。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述HoxB4蛋白與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中編碼一或多種TF的所述DNA序列為包含兩種或多種編碼TF-s或其部分的DNA序列的區(qū)域的嵌合DNA序列。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼TF或其部分的DNA序列包括編碼來(lái)自bZIP蛋白的TF或其部分的區(qū)域。
18.權(quán)利要求17的方法，其中編碼bZIP蛋白的所述DNA序列包括選自如下的DNA序列a)編碼大麥BLZ1蛋白或其部分的DNA序列；b)編碼大麥BLZ2蛋白或其部分的DNA序列；c)a)和b)的組合。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述DNA序列選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5及其任意的部分或組合。
20.權(quán)利要求1的方法，其中編碼TF的所述DNA序列能夠在所述植物細(xì)胞中表達(dá)發(fā)夾RNA(hpRNA)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中編碼TF的所述DNA序列包括編碼來(lái)自bZIP蛋白的TF的區(qū)域或其部分。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述bZIP蛋白選自BLZ1，BLZ2以及BLZ1和BLZ2的嵌合組合。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述DNA序列包括選自如下的序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO7，SEQ ID NO8及其任意的部分或組合。
24.可由權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是大麥植物。
26.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因大麥植物，在其基因組中具有a)編碼種子-特異性啟動(dòng)子的DNA序列，所述啟動(dòng)子可操作連接于編碼一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TF)或其部分的DNA序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括不同TF的嵌合組合，調(diào)節(jié)一或多種編碼種子貯藏蛋白的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，b)沒(méi)有被所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子識(shí)別的順式作用元件的種子-特異性啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可操作連接于編碼目的異源蛋白的DNA序列，其中所述植物在其種子中表達(dá)所述異源蛋白且比相應(yīng)的非-重組植物顯著地表達(dá)較少的種子貯藏蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及增加植物種子中異源蛋白的累積水平的改進(jìn)方法，通過(guò)靶向抑制與異源蛋白競(jìng)爭(zhēng)有限資源，諸如氨基酸、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及參與翻譯和翻譯后加工的酶的作用的內(nèi)源蛋白來(lái)用于分子耕作。本發(fā)明提供了利用反義“抑制”或雙鏈RNA－誘導(dǎo)的RNA干預(yù)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)來(lái)抑制通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活大麥醇溶蛋白基因獲得的大麥中的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1842601SQ200480024618
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者比約登·拉魯斯·奧瓦爾 申請(qǐng)人:奧夫萊夫塔?？四峁?br>