一種水稻非胚乳表達(dá)啟動子safes3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 非胚乳表達(dá)啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻胚乳以外組織中特異表 達(dá)，從而可在不影響胚乳食用安全情況下，達(dá)到通過改變非胚乳結(jié)構(gòu)特性改良水稻性狀的 目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最重要的農(nóng)作物之一，全世界有三分之一以上的人口以稻米為主糧。在我 國，水稻的生產(chǎn)面積約占農(nóng)作物種植面積的40%，水稻生產(chǎn)在國民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的 地位。由于自然環(huán)境的不斷變化和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，常規(guī)育種技術(shù)很難解決的一些生產(chǎn)實(shí) 際問題，如蟲害、病害和逆境脅迫等，需要尋求現(xiàn)代生物技術(shù)解決。轉(zhuǎn)基因技術(shù)因可在基因 水平上改造植物的遺傳物質(zhì)，定向改變植物的遺傳性狀，打破導(dǎo)入外源基因在物種間的生 殖隔離，實(shí)現(xiàn)了基因資源的優(yōu)勢互補(bǔ)。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是實(shí)現(xiàn)水稻品種改良的一種重要手 段。
[0003] 水稻作為主要的糧食之一，水稻食用部位精米即胚乳。在轉(zhuǎn)基因水稻中尤以外源 蛋白在胚乳中的積累及其可能造成的食用安全風(fēng)險，成為制約商業(yè)化進(jìn)程的重要因素。針 對這一問題，利用啟動子策略即選用誘導(dǎo)型、組織特異性及時間依賴型啟動子，使外源基因 只在非食用部分表達(dá)，保證食用部分不含有外源基因表達(dá)的產(chǎn)物，降低其對人類健康帶來 的潛在風(fēng)險，是促進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化進(jìn)程的一條有效途徑。目前國內(nèi)研究中，非胚乳表 達(dá)啟動子的發(fā)明鮮有報道，僅見于楊劍波等發(fā)明的水稻非胚乳表達(dá)啟動子OsTSP I即只在 水稻非胚乳組織(根、莖、葉等）中表達(dá)，在胚乳中不表達(dá)。以及Meng Cai等發(fā)現(xiàn)的僅在水稻 綠色組織部位表達(dá)的啟動子Η)540。
[0004] 如果轉(zhuǎn)基因水稻不能最終實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用于生產(chǎn)，那么再好的研究成果也沒有任 何應(yīng)用價值。針對以上問題，目前需要大力開展功能基因組的研究，大量挖掘和分離具有實(shí) 用價值的非胚乳表達(dá)啟動子，消除公眾對轉(zhuǎn)基因水稻的偏見和顧慮，并利用非胚乳表達(dá)啟 動子的特性，充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)勢，培育出更多更好的新品種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種在水稻非胚乳表達(dá)的啟動子、獲得含有該啟動子序列的 轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻非胚乳表達(dá)啟動子SAFES3,其特 征在于，所述水稻非胚乳表達(dá)啟動子SAFES3包含：
[0007] (a)SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列;或者 [0008] (b)SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列;或者
[0009] (c)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0010] (d)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0011] (e)與SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列;或者
[0012] (f)與SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列;或者
[0013] (g)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0014] (h)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0015] (i)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核苷酸 序列;或者
[0016] (j)SEQ ID N0: 2中所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核苷酸 序列;或者
[0017] (k)與帶有SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物雜交后所獲得的相應(yīng)產(chǎn)物的 對應(yīng)核苷酸序列;或者
[0018] (1)與帶有SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列的植物雜交后所獲得的相應(yīng)產(chǎn)物的 對應(yīng)核苷酸序列。
[0019] 優(yōu)選地，所述水稻非胚乳表達(dá)啟動子由序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列或 SEQ ID N0:2中所示的DNA序列構(gòu)成。序列表中SEQ ID No:l或2所示的DNA序列為來源于日 本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中稱為SAFES3或啟動子SAFES3。 具體而言，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因組中一 段2069bp的具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列具有驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻非胚乳組織表達(dá)的作用。并 且分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
[0020] 需要說明的是：SEQ ID No: 1的啟動子的DNA序列中，序列開頭的序列 "TCACAATCCCAGTTAGCCCTCA"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計(jì)22bp; 序列末尾的序列"GCTAAGCCTACGTACGGTGGTC"為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存 序列(該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)），共計(jì)22bp;該DNA序列中剩余的部分則為獲 自日本晴水稻中的DNA序列，去除頭尾部分則為SEQ ID No:2所示序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文 中所提到的啟動子既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序 列。即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻非胚乳表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0022] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的水稻 非胚乳表達(dá)啟動子，在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻非胚乳表達(dá)啟動子連接于待表達(dá)的 基因序列的上游；優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載體為 PCAMBIA1391-SAFES3,該重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:l所示的序列即SAFES3或啟動子 SAFES3構(gòu)建于pCAMBIAl 391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pCAMBIAl 391-SAFES3。
[0023] 或者待表達(dá)基因可以為任何對水稻的非胚乳組織性狀具有改善能力的基因。通過 本發(fā)明的啟動子驅(qū)動該基因在非胚乳組織中特異性地集中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)改善水稻非胚乳 組織相應(yīng)性狀的功能，而不會對胚乳帶來任何改變或不利影響。
[0024]再一方面，本發(fā)明提供上述水稻非胚乳表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。 所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述水稻非胚乳表達(dá)啟動子連接于載體的待表達(dá)的基因序 列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載體，將所 述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0025]本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID N〇:l中相同）：
[0026] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的2069bp的DNA序列，并將其命名為SAFES3(序列 表中的SEQ ID N〇:l或2)。具體而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該序列具有驅(qū)動基因在水稻非胚乳組織中 特異性表達(dá)的能力，提取出該序列并對上述能力進(jìn)行了鑒定。發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連 接到作物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基 因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在根、莖、葉鞘、葉、 胚等非胚乳組織中有藍(lán)色出現(xiàn)，在胚乳中沒有著色，從而證明該2069bp的序列具有驅(qū)動基 因特異的在非胚乳組織中表達(dá)的活性。
[0027] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與作物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組作物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，可在 非胚乳組織中特異的驅(qū)動靶標(biāo)基因的表達(dá)。
[0028]技術(shù)效果
[0029] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子SAFES3能夠調(diào)控基因在植株中非胚乳部位集中表達(dá)， 在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著價值。如通過該啟動子調(diào)控目標(biāo)基因在綠色組織和根中表達(dá)活性， 而在胚乳中不表達(dá)，改善水稻的生長性能，同時降低了水稻的食用安全風(fēng)險，有助轉(zhuǎn)基因水 稻的商業(yè)推廣。
【附圖說明】
[0030] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0031] 圖1為將SAFES3啟動子構(gòu)建于PCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-SAFES3示意圖，其中示出了利用SAFES3啟動子驅(qū)動 位于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0032] 圖2為對本發(fā)明的啟動子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。
[0033]圖3為利用SAFES3啟動子驅(qū)動Gus基因表達(dá)的結(jié)果示意圖，示出了水稻各部位Gus 染色結(jié)果，其中示出了SAFES3: : gus轉(zhuǎn)基因水稻植株，其中a表示根，b表示莖，c表示葉鞘，d 表示葉，e表示種子縱切圖；從圖中可以看出，除e以外各組織均有藍(lán)色出現(xiàn)，e僅在胚部位出 現(xiàn)藍(lán)色。圖中標(biāo)尺=lcm。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0036]含有酶切位點(diǎn)的SAFES3啟動子的獲得 [0037]步驟1、引物的設(shè)計(jì)
[0038] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組 序列，依據(jù)水稻SAFES3基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn)，設(shè) 計(jì)引物的酶切位點(diǎn)。
[0039] 本實(shí)施例中以水稻雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391 (圖1中A部分，來自于CAMBIA，公開 使用載體，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心水稻組保存） 為例，靶標(biāo)基因?yàn)镚us基因，具體設(shè)計(jì)