miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細胞工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種miR-126-3p在豬卵巢顆 粒細胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在商品豬肉生產(chǎn)中，母豬的利用年限直接關(guān)系到豬場的經(jīng)濟效益。影響母豬利用 年限的因素主要有繁殖障礙、自然環(huán)境、品種、營養(yǎng)、疾病等，其中繁殖障礙是導(dǎo)致母豬過早 從豬群中淘汰的最主要原因之一。在母豬繁殖障礙中卵巢的疾病是一個重要誘因。
[0003] 卵巢是哺乳動物重要的生殖腺，是卵泡發(fā)育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作為卵 巢的基本組成單位，維持著卵子的存在、發(fā)育與閉鎖。顆粒細胞是卵泡周圍扁平或立方狀細 胞，其生長與分化在卵泡的發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。雌性哺乳卵巢中僅有少數(shù)卵 泡能夠發(fā)育成熟并排卵，而絕大部分卵泡在發(fā)育的各個階段發(fā)生閉鎖退化，其重要且直接 原因來自于顆粒細胞的凋亡。顆粒細胞的凋亡是啟動卵泡閉鎖的重要機制。
[0004] Micr〇RNAS(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，其大小長約20~25個核苷酸。它主要通過與靶基因 mRNA的3'端非翻譯區(qū)（UTR)完全或 不完全配對而降解祀mRNA或抑制mRNA的正常翻譯，進而對基因轉(zhuǎn)錄后表達進行調(diào)控。近年 來，關(guān)于哺乳動物卵巢發(fā)育的miRNA調(diào)控也受到研究者關(guān)注，多項研究表明miRNA廣泛參與 卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育、閉鎖和黃體形成、退化等多個生物學(xué)過程。MiRNA還參與一些卵巢疾病 的調(diào)控，主要有卵巢癌和卵巢早衰。
[0005] 本發(fā)明前期研究中，通過Solexa高通量測序技術(shù)，鑒定不同發(fā)育時期（3月齡青年 母豬，3胎齡母豬，繁殖障礙母豬)母豬卵巢組織miRNA表達譜，其中miR-126-3p呈顯著差異 表達，推測其可能在顆粒細胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
[0006] 目前研究中，由于miRNA與靶基因之間的關(guān)系是多對多，且動物的一種表型變化， 很難通過一個miRNA和其靶基因調(diào)控來控制，基本很難進行活體豬個體水平驗證;另外，在 沒有較高把握成功的實驗情況下，用豬做活體實驗的成本太高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種miR-126_3p在豬卵 巢顆粒細胞中的應(yīng)用。
[0008] 通過基因工程技術(shù)改變該miRNA在顆粒細胞的表達量，進而影響其對顆粒細胞的 凋亡;通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測該miRNA靶基因，研究靶基因的功能，來達到該miRNA在豬卵 巢顆粒細胞中應(yīng)用的目的。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的miR-126-3p的靶基因。
[0010] 本發(fā)明的再一目的在于通過所述的靶基因的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] 本發(fā)明提供一種miR-126-3P在豬卵巢顆粒細胞中的應(yīng)用。
[0013] 所述的miR-126-3p的靶基因為PIK3R2和TSC1。
[0014] 所述的靶基因 PIK3R2和TSC1在豬卵巢顆粒細胞中的應(yīng)用。
[0015] 在顆粒細胞中補充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，能回復(fù)由miR-126-3p引起 的細胞功能表型。
[0016]所述的砧1?-126-3口的序列為5/-1^1；1^01^^61^厶1^厶1?〇6-3/;
[0017]本發(fā)明的驗證結(jié)果如下：
[0018] 1、制備miR-126_3p模擬物(mimic)和抑制劑（inhibitor)及檢測轉(zhuǎn)染效率。在顆粒 細胞中轉(zhuǎn)染miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhibitor，通過qRT-PCR手段，檢測其轉(zhuǎn)染效 率，其中分別轉(zhuǎn)染濃度為50nM的miR-126_3p mimics，以及ΙΟΟηΜ的miR-126_3pinhibitor 后，相對于各自轉(zhuǎn)染的對照組NC，實驗組的轉(zhuǎn)染效率分別能達到超表達2000多倍和抑制10 多倍。
[0019] 2、通過轉(zhuǎn)染達上述效率的miR-126_3p mimic和miR-126_3p inhibitor后，檢測標(biāo) 記基因的表達量，以及顆粒細胞凋亡的變化。通過qRT-PCR手段，檢測miR-126_3p介導(dǎo)的凋 亡標(biāo)記基因的表達，發(fā)現(xiàn)過表達miR-126_3p(即轉(zhuǎn)染miR-126_3p mimic)抑制了促凋亡標(biāo)記 基因 Caspase-3的表達，促進了抑凋亡標(biāo)記基因 BCL2的表達。并通過Annexin V-FITC法檢測 miR-126-3p對顆粒細胞凋亡影響，結(jié)果顯示過表達miR-126-3p抑制顆粒細胞凋亡，而抑制 miR-126_3p促進顆粒細胞凋亡。
[0020] 3、生物信息學(xué)軟件預(yù)測豬miR-126-3p的靶基因，實驗證實其靶基因為PIK3R2和 TSC1 JargetScaruMiRandaARNAhybrid 3個生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-126_3p祀基因，運用 K0BAS 2.0軟件，對預(yù)測的靶基因進行作用通路分析，發(fā)現(xiàn)其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激 酶)-AKT (絲氨酸蛋白激酶)通路中關(guān)鍵PIK3R2 (磷酸酯酶基因）、TSC1 (3-磷酸肌醇依賴激 酶)基因，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1 3^JTR中含有miR-126-3p序列結(jié)合位點，將PIK3R2和TSC1野生 型3'UTR和含有種子序列突變的3'UTR構(gòu)建到真核表達載體pmirGLO中，通過雙熒光素酶報 告分析，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1野生型30JTR上游報告基因受到miR-126-3p調(diào)控，而突變型不受 miR-126_3p調(diào)控。還采用qRT-PCR和We stern blot ting在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗證miR-126-3p調(diào)控PIK3R2和TSC1的表達，發(fā)現(xiàn)miR-126-3p在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平下調(diào)PIK3R2表達，只 在翻譯水平下調(diào)TSC1表達。
[0021 ] 4、合成 3 對靶基因 PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段 / 對照（siRNA-PIK3R2，siRNA-TSCl/ siRNA-NC)，篩選并檢測其干擾效率。轉(zhuǎn)染基因干擾小片段到顆粒細胞中，通過qRT-PCR手 段，最終篩選干擾效果較好的siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段進行后續(xù)實驗。
[0022] 5、PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段(siRNA-PIK3R2-l 和 siRNA-TSCl-3)轉(zhuǎn)染顆粒細胞，研 究靶基因 PIK3R2和TSC1對豬卵巢顆粒細胞凋亡的應(yīng)用。通過Annexin V-FITC法檢測PIK3R2 和TSC1受到siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段干擾后的顆粒細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn) PIK3R2和TSC1促進顆粒細胞凋亡。
[0023] 6、miR-126-3p靶基因 PIK3R2和TSC1功能回復(fù)驗證。在顆粒細胞中補充外源干擾的 靶基因 PIK3R2和TSC1后，能否回復(fù)由miR-126-3p引起的細胞功能表型。顆粒細胞共轉(zhuǎn)染 miR-126-3p inhibitor/NC和PIK3R2和TSC1 干擾小片段（siRNA-PIK3R2-l和8丨1?祖-了5(：1-3)/siRNA-NC，通過Annexin V-FITC法檢測顆粒細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p引起的抑 制顆粒細胞凋亡的功能能夠被PIK3R2和TSC1回復(fù)。
[0024]本發(fā)明以miR-126_3p為研究對象，采用了細胞生物學(xué)方法研究其在豬卵巢顆粒細 胞中的應(yīng)用。關(guān)鍵點和欲保護點：（l)miR-126-3p在豬卵巢顆粒細胞凋亡中的應(yīng)用；（2)在豬 卵巢顆粒細胞中miR-126-3p與基因 PIK3R2和TSC1靶向關(guān)系；（3)基因 PIK3R2和TSC1在豬卵 巢顆粒細胞凋亡中的應(yīng)用；（4)通過靶基因回復(fù)實驗，即在顆粒細胞中補充外源干擾的靶基 因 PIK3R2和TSC1后，驗證能否回復(fù)由miR-126-3p引起的細胞功能表型。
[0025]顆粒細胞的凋亡是啟動卵泡閉鎖的重要機制，本發(fā)明第一次證實miR-126_3p、 PIK3R2在豬卵巢顆粒細胞中的應(yīng)用，以及在豬卵巢顆粒細胞中miR-126-3p與基因 PIK3R2和 TSC1之間的靶向關(guān)系;現(xiàn)在的發(fā)明關(guān)于靶基因功能回復(fù)實驗僅有少量報道，出現(xiàn)這樣的原 因主要是一種表型的變化受到多方面的影響，并且miRNA與靶基因之間的關(guān)系是多對多，即 一個miRNA可以靶向多個基因，一個基因也可以是多個miRNA的靶標(biāo)，所以靶基因的回復(fù)實 驗很難得到結(jié)果，不過，本發(fā)明補充外源干擾的PIK3R2和TSC1能夠回復(fù)由miR-126-3p引起 的細胞功能表型，進一步表明PIK3R2和TSC1在顆粒細胞中是miR-126-3p的重要功能靶標(biāo)， miR-126-3p可以通過PIK3R2和TSC1來調(diào)節(jié)顆粒細胞的發(fā)育。
[0026]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0027]本發(fā)明設(shè)計周詳，結(jié)果可靠。為證明miR-126_3p在顆粒細胞中的應(yīng)用，本發(fā)明除了 研究其自身功能以外還通過靶基因以及靶基因在顆粒細胞中的功能進行研究;本發(fā)明還通 過靶基因回復(fù)實驗，即在顆粒細胞中補充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，驗證能否回 復(fù)由miR-126-3p引起的細胞功能表型。
【附圖說明】
[0028] 圖 1 是qRT-PCR檢測miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhi