us軟件分析膠片中的蛋白條帶。
[0088] 實(shí)施例5顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0089] 本發(fā)明中Annexin V-FITC技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，參照BioVision公司Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit操作說(shuō)明書(shū)，具體操作步驟如下：
[0090] (1)將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在室溫，用2mL PBS溶液輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，去除PBS溶 液；
[0091] (2)加入不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕重懸于步驟(1)中的培養(yǎng)基使其密 度大約為1X10 6細(xì)胞/mL;
[0092] (3)將0.5mL細(xì)胞懸液從細(xì)胞培養(yǎng)板中（約5 X 105個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心 管內(nèi)，加入500yL lXBinding Buffer;
[0093] (4)加5yL Annexin V-FITC和室溫5yL propidium iodide;
[0094] (5)室溫避光反應(yīng)5min;
[0095] (6)立即用FACSCal ibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析(每組三個(gè)重復(fù)）。
[0096] 實(shí)施例6熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)
[0097] 焚光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)，參照Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒，具體操作步驟如下：
[0098] (1)轉(zhuǎn)染48h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，每孔細(xì)胞加入100yL的Glo Lys is Buffer，室溫輕微振搖5min，收集細(xì)胞裂解液；
[0099] (2)將30yL細(xì)胞裂解液加入96孔發(fā)光板后，在其中加入75yL Dual-GI〇⑧ Luciferase Assay Reagent，混勾后在20~25°C靜置 15~30min。在BioTek公司Synergy 2 多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)發(fā)光值，對(duì)應(yīng)于螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)水平；
[0100] (3)再加入75yL Stop&Gl〇(R、lteagent試劑，混勾后在20~25°C靜置15~30min。檢 測(cè)發(fā)光值，對(duì)應(yīng)于海腎熒光素酶的表達(dá)水平；
[0101] (4)螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶表達(dá)量的比值為螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性， 即為對(duì)應(yīng)靶基因活性(三個(gè)重復(fù)）。
[0102] 結(jié)果分析：
[0103] 1、制備miR-126_3p模擬物(mimic)和抑制劑（inhibitor)及檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。在顆粒 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhibitor，通過(guò)qRT-PCR手段，檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效 率，其中分別轉(zhuǎn)染濃度為50nM的miR-126_3p mimics，以及100nM的miR-126_3pinhibitor 后，相對(duì)于各自轉(zhuǎn)染的對(duì)照組NC，實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率分別能達(dá)到超表達(dá)2000多倍和抑制10 多倍。結(jié)果如圖1所不。
[0104] 2、通過(guò)轉(zhuǎn)染上述效率的miR-126_3p mimic和miR-126_3p inhibitor后，檢測(cè)標(biāo)記 基因的表達(dá)量，以及顆粒細(xì)胞凋亡的變化。通過(guò)qRT-PCR手段，檢測(cè)miR-126_3p介導(dǎo)的凋亡 標(biāo)記基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-126_3p(即轉(zhuǎn)染miR-126_3p mimic)抑制了促凋亡標(biāo)記基 因 Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)了抑凋亡標(biāo)記基因 BCL2的表達(dá);結(jié)果如圖2所示。并通過(guò)Annexin V-FITC法檢測(cè)miR-126-3p對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-126-3p抑制顆粒細(xì)胞 凋亡，而抑制miR-126-3p促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡;結(jié)果如圖3所示。
[0105] 3、生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)豬miR-126-3p的靶基因，實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)其靶基因?yàn)镻IK3R2 和TSC1 JargetScaruMiRandaNRNAhybrid 3個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-126_3p祀基因，運(yùn) 用KOBAS 2.0軟件，對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行作用通路分析，發(fā)現(xiàn)其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激 酶)-ΑΚΤ (絲氨酸蛋白激酶)通路中關(guān)鍵PIK3R2 (磷酸酯酶基因）、TSC1 (3-磷酸肌醇依賴(lài)激 酶)基因，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1 3^JTR中含有miR-126-3p序列結(jié)合位點(diǎn)，將PIK3R2和TSC1野生 型3'UTR和含有種子序列突變的3'UTR構(gòu)建到真核表達(dá)載體pmirGLO中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào) 告分析，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1野生型（PIK3R2-WT和TSCl-rOS'UTR上游報(bào)告基因受到miR-126-3p調(diào)控，而突變型（PIK3R2-MUT和TSC1-MUT)不受miR-126-3p調(diào)控。還采用qRT-PCR和 Western blotting在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗(yàn)證miR-126-3p調(diào)控PIK3R2和TSC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) miR-126-3p在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平下調(diào)PIK3R2表達(dá)，只在翻譯水平下調(diào)TSC1表達(dá)。結(jié)果如圖4和 圖5所示。
[0106] 4、合成 3 對(duì)靶基因 PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段 / 對(duì)照（siRNA-PIK3R2，siRNA-TSCl/ siRNA-NC)，篩選并檢測(cè)其干擾效率。結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)染基因干擾小片段到顆粒細(xì)胞中， 通過(guò)qRT-PCR手段，最終篩選干擾效果較好的siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段進(jìn)行 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0107] siRNA-PIK3R2-l：57-GGAGAAGUUACUUCAGGAA-37 ；
[0108] siRNA-PIK3R2-2：5/ -GGAACAACAAGCUGAUCAA-37 ；
[0109] siRNA-PIK3R2-3：5/ -GGUAUGUAGGCAAGAUCAA-37 ；
[0110] siRNA-TSCl-1:5,-GCUGGAGAUCUUAGAUUUA-3,；
[0111] siRNA-TSCl-2:5,-GCUUCGACUCUCCCUUCUA-3,；
[0112] siRNA-TSCl-3:5,-CCACGUGACAGAAAUCUAU-3,；
[0113] 上述干擾小片段由廣州市銳博生物科技有限公司合成;對(duì)照siRNA-NC來(lái)自廣州市 銳博生物科技有限公司。
[0114] 5、PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段(siRNA-PIK3R2-l 和 siRNA-TSCl-3)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，研 究靶基因 PIK3R2和TSC1對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的應(yīng)用。通過(guò)Annexin V-FITC法檢測(cè)PIK3R2 和TSC1受到siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段干擾后后顆粒細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn) PIK3R2和TSC1促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。結(jié)果如圖7所示。
[0115] 6、miR-126-3p靶基因 PIK3R2和TSC1功能回復(fù)驗(yàn)證。在顆粒細(xì)胞中補(bǔ)充外源靶基因 PIK3R2和TSC1后，能否回復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表型，顆粒細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-126-3p inhibitor/NC和PIK3R2和TSC1 干擾小片段（siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3)/siRNA-NC，通過(guò)Annexin V-FITC法檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p引起的抑制顆粒細(xì)胞 凋亡的功能能夠被PIK3R2和TSC1回復(fù)。結(jié)果如圖8和圖9所示。
[0116] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于:所述的 miR-126-3p 的靶基因?yàn)?PIK3R2 和 TSC1。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于:靶基因 PIK3R2和TSC1在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于:在顆粒 細(xì)胞中補(bǔ)充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，能回復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表 型。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，屬于細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以miR-126-3p為研究對(duì)象，采用了細(xì)胞生物學(xué)方法研究其在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明第一次證實(shí)miR-126-3p、PIK3R2在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，以及在豬卵巢顆粒細(xì)胞中miR-126-3p與基因PIK3R2和TSC1之間的靶向關(guān)系；補(bǔ)充外源干擾的PIK3R2和TSC1能夠回復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表型，進(jìn)一步表明PIK3R2和TSC1在顆粒細(xì)胞中是miR-126-3p的一個(gè)重要功能靶標(biāo)，miR-126-3p可以通過(guò)PIK3R2和TSC1來(lái)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的發(fā)育。
【IPC分類(lèi)】C12N15/113
【公開(kāi)號(hào)】CN105567686
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610034858
【發(fā)明人】李加琪, 張愛(ài)玲, 鄧熙, 張哲 , 張豪
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日