養(yǎng)箱內孵育4h。
[0060] ⑵培養(yǎng)箱內孵育96孔板4h。
[0061] ⑶ 4h 后用 VERSAmax tunable microplate reader 測定 450nm 處的吸光度。
[0062] 5.細胞內 Gaussia Luciferase 的檢測使用 New England Biolabs 公司B:i〇:L.UX? Gaussia Luciferase Assay Kit試劑盒，具體實驗步驟參照試劑盒說明操作為在質粒轉染 后48h后，將不同樣品培養(yǎng)液上清加入白色不透明的96孔板中，20 μ 1培養(yǎng)液上清/well， 加入50 μ 1/well Glue assay solution到樣品培養(yǎng)液上清中，每次檢測一個孔，快速使用 FLUOstar optima檢測吸光度。
[0063] 6.實驗動物
[0064] 所有的動物實驗由美國動物保護與使用委員會批準，并且按照佛羅里達大學 (Gainesville，F(xiàn)L，USA)或上海第二軍醫(yī)大學動物保護規(guī)范進行操作。6-10周鼠齡，體 重 15-20g 的 nonobese diabetic/severe combined immunodeficient gamma (NSG),雄 性或雌性小鼠購于Jackson實驗室（Bar Harbor，ME，USA)，喂養(yǎng)在佛羅里達大學醫(yī)學院 (Gainesville，F(xiàn)L，USA)，室溫，小鼠自由取水取食。
[0065] 7.人肝癌異種接種小鼠模型
[0066] 含有TCS質粒轉染人肝癌細胞后種植皮下瘤的熒光素酶檢測。細 胞 Huh7-FLuc 鋪于 6 個 15cm2培養(yǎng)皿內。24h 后將質粒 pAAV-CMVp-IRES-hrGFP、 pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP轉染Huh7-FLuc細胞。其中CMVp為人巨細胞病毒啟動 子，IRES為核糖體內部進入位點，hrGFP為人源化綠色熒光蛋白。使用Lip 〇fectamineTMLTX Reagent來做轉染，實驗步驟按照試劑盒說明操作。48h后加入胰酶消化液消化并收集細 胞，1000 rpm離心5min，棄上清，加入PBS重懸細胞，調整細胞濃度至1. 0 X IOiVml，按50 μ 1/ 只接種于NSG小鼠腋部皮下，每組各6只。接種后每周檢測腫瘤細胞的熒光值。操作方法參 照Caliper Life Sciences 公司 Preparation of Luciferin for In Vivo Bioluminescent Assays試劑盒操作。具體操作方法為每只小鼠10 μ 1/g。腹腔注射IuciferinlO~15min 后用小動物活體成像儀IVIS Lumina II拍照。
[0067] 腫瘤內注射含有TCS的病毒后焚光素酶檢測。細胞Huh7_FLuc鋪于6個15cm2 培養(yǎng)皿內。24h后加入胰酶消化液消化并收集細胞，1000 rpm離心5min，棄上清，加入PBS 重懸細胞，調整細胞濃度至1.0 X l〇s/ml，按50 μ 1/只接種于NSG小鼠腋部皮下，每組各 6只。接種后每周檢測腫瘤細胞的焚光值。操作方法參照Caliper Life Sciences公司 Preparation of Luciferin for In Vivo Bioluminescent Assays 試劑盒操作。具體操作 方法為每只小鼠10 μ 1/g。腹腔注射luciferin 10~15min后用小動物活體成像儀IVIS Lumina II拍照。每隔3天觀察腫瘤生長情況，觀察至腫瘤可觸及，腫瘤內注射腺相關病毒 rAAV3-2M-AFPp-TCS、rAAV3-2M-AFPp-EGFP。其中2M為雙突變的AAV3。腫瘤內注射病毒前 檢測熒光值，注射病毒后每周檢測二次腫瘤細胞的熒光值，每周測量二次腫瘤大小。
[0068] 8.含有TCS的質粒轉染人肝癌細胞后PARP蛋白檢測
[0069] 質粒 pAAV-CMVp-IRES-hrGFP、pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP 轉染 Huh7、!fepG2 細胞（6孔板）。
[0070] (1)樣品制備使用Lipofectamine?LTX Reagent來做轉染，實驗步驟按照試劑盒 說明操作。轉染Id前將處于對數(shù)生長期的Huh7、HepG2細胞作單細胞懸液，細胞計數(shù)后稀 釋成濃度為5X 105/well的細胞懸液，按3ml/well接種分別接種于6孔培養(yǎng)板內，24h后將 6個質粒用500 μ 1無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋2500ng/well。具體轉染方法同上。在37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48后抽提蛋白。蛋白抽提過程如下：吸去培養(yǎng)液，冷PBS洗兩遍，吸 干6孔板內液體，加入150 μ 1含I Xprotease inbibitor的預冷RIPA細胞裂解液，迅速將 細胞刮下來。4°C，放置IOmin后，12000rpm離心15min，收集上清液，用Bio-Rad Protein Assay kit定量蛋白濃度，調整蛋白濃度為5mg/ml，加入2XLaemmli sample buffer蛋白 上樣緩沖液，于沸水中煮l〇min，使蛋白變性，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0071] (2) SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳
[0072] 按照配方配制10%的分離膠注入玻璃夾層中，用異丁醇封面，聚合后，倒去異丁 醇，用去離子水沖洗數(shù)次，灌入積層膠，插入上樣梳子，拔去上樣梳，沖洗，用微量加樣器分 別吸取待分析樣品，加樣體積為15 μ 1，接通電源，電壓70V，待樣品在積層膠部分濃縮成一 條線后，100V恒壓電泳60min。
[0073] (3)蛋白印跡分析
[0074] 取出凝膠，切除積層膠，將膠、Nitrocellulose膜和濾紙同時浸泡于預冷的轉移緩 沖液中。按照陽極、濾紙、Nitrocellulose膜、凝膠、濾紙、陰極順序放好固定，插入電轉移 槽，放入冰水混合物盒中，l〇〇V，2h。取下Nitrocellulose膜，染色2min，蛋白條帶出現(xiàn)后用 水洗去染液。含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉，搖床振蕩60rpm，lh。TBST洗滌3次， 每次振蕩60印111，101^11。將將？41^一抗按1 :1000比例稀釋于含511115%脫脂奶粉的了85丁 溶液中，均勻加入盛有NitrocelIulose膜的小船里，4°C，振蕩，50rpm，過夜。TBST洗滌3次。 加入辣根過氧化物酶標記抗鼠的二抗按1:5000稀釋于含5 %脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫 振蕩，60rpm，lh。TBST 洗滌 3 次。取 Chemiluminescent Substrate 顯色試劑兩種底物 1:1 的比例混合，滴在Nitrocellulose膜上，室溫避光孵育5min。吸取多余的反應液，保鮮膜包 好，放入X光片夾中。在暗室內將X-ray感光膠片置膜上，關上暗盒，曝光約lmin，顯影。
[0075] 9.統(tǒng)計
[0076] 結果以中位數(shù)土標準差表示，采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件分析，多組均數(shù)比較用單 因素方差分析，兩組均數(shù)比較用t檢驗，P〈0. 05視為有統(tǒng)計學意義。
[0077] 二、結果
[0078] 1.含有TCS的質粒功能檢測的結果
[0079] 根據(jù)已知的TCS基因序列SEQ ID NO. 22,對它的序列進行了合成。利用分子克隆的 技術將TCS基因片段放入pAAV-CMV-IRES-hrGFP載體中。采用Western Blot方法，觀察質 粒 pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP 轉染肝癌細胞 Huh7-FLuc 72h 后是否有 Flag-Tag 蛋 白的表達，其中質粒pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP轉染時分別轉染不同的質粒量，分 別為標準質粒轉染量的1/2、1/10。結果顯示與對照質粒pAAV-CMVp-IRES-hrGFP相比，含有 Flag的TCS質粒轉染Huh7-FLuc后Flag-Tag蛋白有表達，且Flag-Tag蛋白表達量隨著轉 染量的升高而升高，提示在后續(xù)的實驗中可以使用質粒pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP。 見圖1。
[0080] 2. TCS基因對肝癌細胞的體外影響
[0081] 質粒 pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP 轉染 Huh7-FLuc 細胞 24h、48h、72h 后，檢 測細胞增殖情況。Huh7-FLuc細胞在給予質粒pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP轉染24h、 48h、72h后，與對照質粒pAAV-CMVp-IRES-hrGFP相比活細胞數(shù)目有顯著減少，且細胞數(shù)目 下降量隨著質粒轉染量的升高而升高，提示TCS蛋白對Huh7-FLuc細胞有抑制作用。對照 質粒pAAV-CMVp-IRES-hrGFP轉染Huh7-FLuc細胞72h后，細胞內hrGFP的表達情況。見圖 2〇
[0082] 質粒 pAAV-CMVp-TCS-Flag-IRES-hrGFP