本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體本發(fā)明涉及一種攜帶安全機(jī)制的基因修飾嵌合抗原受體(CAR)免疫效應(yīng)細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)以及其制備方法和應(yīng)用。所述的攜帶安全機(jī)制的CAR細(xì)胞編碼帶安全開(kāi)關(guān)的CAR的核酸序列，該核酸序列結(jié)構(gòu)包括識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域、跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域、CD3ζ刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、整合的自殺基因區(qū)。
背景技術(shù)：
：手術(shù)、放療、化療和姑息治療等作為惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法，在抗腫瘤治療中一直占據(jù)著主導(dǎo)地位。近十年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制及其外在微環(huán)境研究的不斷深入，免疫治療尤其是細(xì)胞免疫治療在腫瘤治療中的應(yīng)用逐漸從幕后走到了前臺(tái)。免疫治療具有突破腫瘤耐藥的遺傳學(xué)和細(xì)胞系機(jī)制、靶向腫瘤細(xì)胞的同時(shí)極少損傷正常組織的特點(diǎn)。近五年來(lái)，可以激活機(jī)體T細(xì)胞殺傷功能的單克隆抗體和經(jīng)基因修飾后可直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，在臨床抗腫瘤試驗(yàn)中體現(xiàn)出明顯強(qiáng)于既往研究的顯著療效，在腫瘤治療領(lǐng)域中引發(fā)了轉(zhuǎn)化研究的新高潮。以色列科學(xué)家ZeligEshhar團(tuán)隊(duì)在1989年模擬TCR的組分，將可特異識(shí)別TNP抗原的抗體編碼的輕鏈和重鏈基因分別克隆并組裝成免疫球蛋白-TCR嵌合受體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞后，使得T細(xì)胞不僅具有特異性識(shí)別抗原的能力，而且通過(guò)嵌合受體傳遞的跨膜-刺激信號(hào)也同時(shí)活化了T細(xì)胞。隨后，在1993年，StevenRosenberg和ZeligEshhar團(tuán)隊(duì)一起合作，將可以特異識(shí)別卵巢癌的抗體序列構(gòu)建為嵌合抗原受體(CAR)，轉(zhuǎn)導(dǎo)至TIL表面，利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以特異識(shí)別并裂解卵巢癌細(xì)胞。此后，LaurenceCooper團(tuán)隊(duì)與CarlJune團(tuán)隊(duì)在第一代CAR-T構(gòu)建的基礎(chǔ)上，在抗體序列和TCR胞內(nèi)部分之間加入了一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)分子，大大提高了CAR-T細(xì)胞的存活能力和抗腫瘤效果，形成了第二代、第三代CAR-T技術(shù)。2011年，CarlJune團(tuán)隊(duì)在兩本不同的高影響力雜志上幾乎同時(shí)發(fā)表了利用第三代CD19CAR-T技術(shù)治療三名B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者的數(shù)據(jù)，其中兩名達(dá)到完全緩解，一名部分緩解，立即引起大量腫瘤學(xué)家重新正視細(xì)胞免疫治療，宣告癌癥免疫治療時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨。淋巴瘤是由B、T和NK等淋巴細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的最新分類(lèi)，淋巴瘤主要分為霍奇金和非霍奇金淋巴瘤兩大類(lèi)，其中非霍奇金淋巴瘤比例約為90％。在非霍奇金淋巴瘤中，源自B細(xì)胞的淋巴瘤/白血病為最常見(jiàn)的亞型，所占比例大致為85％。隨著診斷和治療模式的不斷改進(jìn)，尤其是自針對(duì)CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤/白血病的利妥昔單抗的上市以來(lái)，源自成熟B細(xì)胞的淋巴瘤/白血病患者接受經(jīng)含利妥昔單抗免疫化療為主的綜合治療后，完全緩解率可達(dá)76％。雖然，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病經(jīng)當(dāng)前普遍采用的規(guī)范化治療后有著較高的緩解率，但是仍有20％～30％患者死于腫瘤耐藥所致的復(fù)發(fā)和難治。因此，復(fù)發(fā)和難治B細(xì)胞淋巴瘤/白血病也就成為了當(dāng)前淋巴瘤基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題之一。針對(duì)CD19的CAR-T治療已經(jīng)取得了舉世矚目的成果，但仍有相當(dāng)大一部分淋巴瘤或白血病患者為CD19陰性，因此無(wú)法得到救治。CD20作為B細(xì)胞淋巴瘤與白血病的另一個(gè)重要的表面標(biāo)志物，也是作為嵌合抗原受體細(xì)胞識(shí)別的潛在靶標(biāo)之一。應(yīng)用CD20作為靶標(biāo)，可以很好的填補(bǔ)CD19陰性、CD20陽(yáng)性淋巴瘤與白血病患者的救治問(wèn)題，也可以作為雙陽(yáng)性患者在長(zhǎng)期使用CD19CAR-T后無(wú)效的后備療法或聯(lián)合治療的選擇。雖然CAR-T技術(shù)已被大多數(shù)國(guó)內(nèi)外前期臨床研究證實(shí)具有較高的有效性，但是與常規(guī)淋巴瘤/白血病放、化療治療過(guò)程類(lèi)似，副作用依然不容小覷；并且，與大多數(shù)細(xì)胞過(guò)繼輸入治療相類(lèi)似，CAR-T細(xì)胞應(yīng)用過(guò)程中需要配合使用細(xì)胞因子及其他相關(guān)處理方式，寒戰(zhàn)、發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腫瘤溶解綜合征、細(xì)胞因子風(fēng)暴、B細(xì)胞缺乏引起的低免疫球蛋白血癥等為常見(jiàn)的不良反應(yīng)；此外，外源基因的整合也有導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生突變甚或癌變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，CAR-T技術(shù)面臨的首要重要問(wèn)題就是安全性，對(duì)現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞技術(shù)做安全可控性處理，不僅有利于控制多種不良反應(yīng)，還有利于防止CAR-T細(xì)胞潛在的癌變風(fēng)險(xiǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種攜帶安全機(jī)制的基因修飾嵌合抗原受體(CAR)免疫效應(yīng)細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。具體地，一方面，本發(fā)明提供了一種編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列，該核酸序列結(jié)構(gòu)包括識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域、跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域、CD3ζ刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、自殺基因區(qū)。另一方面，本發(fā)明還提供了一種帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)免疫細(xì)胞，其包含編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列。即，本發(fā)明的攜帶安全機(jī)制的CAR細(xì)胞包括識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域、跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域、CD3ζ刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、整合的自殺基因區(qū)。本發(fā)明是在第二代、第三代CAR技術(shù)上進(jìn)行改造，整合了自殺基因區(qū)域。不同種類(lèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增和轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶自殺機(jī)制的CAR序列后可獲得CAR免疫細(xì)胞，通過(guò)CAR識(shí)別腫瘤細(xì)胞相應(yīng)的抗原后，CAR免疫細(xì)胞可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。使用時(shí)按梯度輸注CAR免疫細(xì)胞并監(jiān)測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子水平的動(dòng)態(tài)變化，需要時(shí)可利用藥物啟動(dòng)自殺基因而清除效應(yīng)免疫細(xì)胞，以取得安全性與療效的最佳平衡，從而在最大程度上保證該技術(shù)在臨床腫瘤治療應(yīng)用上的安全性。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述的腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原選自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、CD171/L1-CAM、WT1、CEA、GD2、FR、PSMA、gp100、CA9、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、c-Met、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、GPC3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、SCC、AFU、EBV-VCA、TSGF、POA、β2-MG和PROGRP中的一種和其任何組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，選擇CD20作為嵌合抗原受體靶標(biāo)抗原。CD20作為B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤與白血病的有效標(biāo)志物已經(jīng)得到很多文獻(xiàn)證據(jù)的證明，針對(duì)CD20的單克隆抗體藥物也已經(jīng)被證明在臨床使用上是有效的，因此將CD20作為抗原嵌合受體的靶向抗原具備治療相關(guān)淋巴瘤和白血病的可能。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域包括跨膜結(jié)構(gòu)域與共刺激信號(hào)分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。所述跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域選自CD8、CD27、CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、CD80、CD86、PD-1、LCK、ICOS、LFA-1、DAP10、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3分子的全部或部分片段。選擇CD3ζ作為刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，選擇CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域與共刺激信號(hào)分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作為跨膜-刺激結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核 酸序列中，所述整合的自殺基因區(qū)選自HSVTK、VZVTK、EC-CD、Caspase1、Caspase8、Caspase9。啟動(dòng)自殺基因的前藥包括丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(ACV)、溴乙烯脫氧尿苷(BVDU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷(AraTP)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)、AP20187、AP1903、他莫昔芬、他克莫司。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體免疫細(xì)胞在制備治療哺乳動(dòng)物與升高的/異常表達(dá)的腫瘤抗原表達(dá)相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的藥物中的應(yīng)用。換而言之，本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動(dòng)物與升高的/異常表達(dá)的腫瘤抗原表達(dá)相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的方法。該方法包括施予哺乳動(dòng)物有效量的本發(fā)明所述的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體免疫細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還提供了所述的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體免疫細(xì)胞在制備用于治療患者淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。換而言之，本發(fā)明還提供了一種治療患者淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤的方法。該方法包括施予患者有效量的本發(fā)明所述的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體免疫細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述患者至少對(duì)一種化療藥劑具有抗性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤為難治型的CD20+淋巴瘤和白血病。本發(fā)明上述的治療方法還可包括患者輸注后產(chǎn)生如細(xì)胞因子風(fēng)暴、危及生命的輸液反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)，或其它臨床判斷可能對(duì)患者產(chǎn)生不利影響的副作用，則可使用啟動(dòng)自殺基因的前藥，以清除體內(nèi)基因工程改造以表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，鑒于輸注針對(duì)CD20的CAR-T進(jìn)行治療后的淋巴瘤患者會(huì)因B細(xì)胞缺乏而導(dǎo)致免疫能力下降，臨床常伴有巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致的肺炎等疾病，且因EB病毒易誘發(fā)淋巴瘤，因此部分淋巴瘤患者為EB病毒攜帶者，在免疫能力下降時(shí)易誘發(fā)單核細(xì)胞增多癥。針對(duì)以上原因，本發(fā)明創(chuàng)造性的選擇HSVTK作為自殺基因區(qū)，選擇丙氧鳥(niǎo)苷(更昔洛韋\GCV)作為自殺基因啟動(dòng)前藥，在患者經(jīng)針對(duì)CD20的CAR-T治療后達(dá)痊愈或因并發(fā)癥需中止治療時(shí)，選擇更昔洛韋啟動(dòng)CAR-T自殺基因，在清除CAR-T細(xì)胞的同時(shí)，可針對(duì)巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染起到治療和預(yù)防的作用。在本發(fā)明中，監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中的細(xì)胞因子風(fēng)暴的方法為使用ELISA方法，所用試劑盒可以為市售試劑盒，檢測(cè)目標(biāo)包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 MCP-1和IL-8等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用上述細(xì)胞因子檢測(cè)方法，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴風(fēng)險(xiǎn)，即使用連續(xù)3天給予更昔洛韋6mg/kg，啟動(dòng)自殺基因，使基因修飾的嵌合抗原受體免疫效應(yīng)細(xì)胞凋亡。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的編碼帶安全開(kāi)關(guān)的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述識(shí)別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域?yàn)榭梢院退瞿[瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原、膜受體特異性識(shí)別并結(jié)合的分子，如蛋白、多肽、單克隆抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab片段或抗體等，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域?yàn)閱捂溈贵w(ScFv)。本發(fā)明的載體可以使用真核表達(dá)質(zhì)粒以及重組病毒；所述真核表達(dá)質(zhì)?？梢詾閜cDNA3.1、pCI和pVAX1、轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒等常用質(zhì)粒；所述重組病毒例如可以為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組慢病毒、腺病毒，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體為Plenti-CMV。本發(fā)明將上述載體搭載CAR片段后導(dǎo)入免疫反應(yīng)細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體。導(dǎo)入方法包括電轉(zhuǎn)法、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法、轉(zhuǎn)染法、基因槍法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法作為導(dǎo)入方法。本發(fā)明中所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括自體或異體的骨髓、外周血、組織來(lái)源。所述免疫反應(yīng)細(xì)胞可選自直接提取的或由其他細(xì)胞分化擴(kuò)增而來(lái)的T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CIK細(xì)胞；其中所述T細(xì)胞例如可以為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、或抑制/和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇自體外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞分化擴(kuò)增而來(lái)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作為免疫反應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明中所述的導(dǎo)入CAR結(jié)構(gòu)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其中當(dāng)所述嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合它相應(yīng)的抗原時(shí)，所述細(xì)胞顯示抗腫瘤免疫。本發(fā)明中所述的腫瘤抗原與實(shí)體瘤相關(guān)，所述的實(shí)體瘤例如為肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、鼻咽癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、腎癌、黑色素瘤、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌或前列腺癌等。本發(fā)明中所述的腫瘤抗原與淋巴瘤及惡性血液病相關(guān)。所述的淋巴瘤及惡性血液病例如彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、幼淋巴細(xì)胞白血病。在本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)基因克隆技術(shù)，將針對(duì)CD20的嵌合抗原受體、CD28的跨膜段與胞內(nèi)段，CD3ζ段，HSVTK基因克隆到以CMV為啟動(dòng)子的慢病毒多 克隆位點(diǎn)上，應(yīng)用慢病毒包裝質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝成具備轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的基因工程載體實(shí)現(xiàn)CAR的構(gòu)建。將通過(guò)采集得到的患者單個(gè)核細(xì)胞加入到專(zhuān)用的無(wú)血清培養(yǎng)基中，并加入IL-2與CD3抗體激活，加入包含上述CAR的載體，培養(yǎng)7日，即形成針對(duì)CD20的具備安全機(jī)制的CAR-T細(xì)胞。依照1×105/kg～10×107/kg計(jì)算治療用總細(xì)胞量，以占總量的10％、30％、60％進(jìn)行每天或隔天給予梯度細(xì)胞輸注，以保障治療的安全性與有效性的平衡。如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴風(fēng)險(xiǎn)，即使用連續(xù)3天給予更昔洛韋(GCV)6mg/kg，啟動(dòng)自殺基因，確保治療安全性。本發(fā)明中所述的搭載CAR結(jié)構(gòu)序列的載體、轉(zhuǎn)染、導(dǎo)入、制備過(guò)程中涉及的常用試劑、免疫反應(yīng)細(xì)胞以及相關(guān)的說(shuō)明書(shū)可組合成為試劑盒。發(fā)明中涉及到的一些名詞解釋?zhuān)盒g(shù)語(yǔ)“嵌合抗原受體”是人工改造嵌合受體，能夠?qū)⒆R(shí)別腫瘤抗原的特異性分子(如抗體)穩(wěn)定表達(dá)在在免疫效應(yīng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)膜表面上，使免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原并殺死腫瘤細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“共刺激信號(hào)分子”(Co-stimulatingmolecule)是指免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通過(guò)與其相應(yīng)的配體結(jié)合，可以激活免疫細(xì)胞的第二信號(hào)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖存活能力及殺傷功能。術(shù)語(yǔ)“腫瘤特異性抗原”(tumorspecificantigen,TSA)是腫瘤細(xì)胞特有的或只存在于某種腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞的一類(lèi)抗原。術(shù)語(yǔ)“腫瘤相關(guān)抗原”(tumor-associatedantigen,TAA)是指非腫瘤細(xì)胞所特有的、正常細(xì)胞和其他組織上也存在的抗原，但其表達(dá)量在腫瘤細(xì)胞中明顯升高的一類(lèi)抗原。術(shù)語(yǔ)“單鏈抗體”(single-chainantibodyvariableregionfragment,scFv)是指由抗體VL區(qū)氨基酸序列和VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)Linker連接而成，具有結(jié)合抗原能力的抗體片段。術(shù)語(yǔ)“自殺基因”(suicidegene)是指將某些病毒或細(xì)菌的基因?qū)氚屑?xì)胞中，其表達(dá)的酶可催化無(wú)毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞被殺死，此類(lèi)基因稱(chēng)為自殺基因。本發(fā)明中，所述多肽通常是指長(zhǎng)度在1～100個(gè)氨基酸的肽鏈分子；蛋白通常是指長(zhǎng)度大于100個(gè)氨基酸的肽鏈分子。在本發(fā)明中所述“選自”是指選自所列項(xiàng)目中的一種或數(shù)種。技術(shù)優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明在國(guó)際上最為流行的第二代、第三代CAR技術(shù)上進(jìn)行改造，加入了自殺基因區(qū)域，可以在保障治療效果的同時(shí)，通過(guò)臨床廣泛應(yīng)用的對(duì)患者無(wú)副作用或不對(duì)腫瘤治療產(chǎn)生影響的藥物，啟動(dòng)自殺基因，從而避免了傳統(tǒng)第二代、第三代CAR免疫效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞過(guò)量、細(xì)胞因子風(fēng)暴、脫靶殺傷正常組織、異體免疫效應(yīng)細(xì)胞導(dǎo)致的急性GVHD等安全隱患。同時(shí)，隨著安全機(jī)制的引入，為臨床同時(shí)使用多種針對(duì)不同靶點(diǎn)的CAR改造細(xì)胞聯(lián)合治療打下基礎(chǔ)。本發(fā)明同時(shí)適用于任何可被CAR技術(shù)改造的免疫效應(yīng)細(xì)胞，極大的提高CAR技術(shù)的臨床有效性及安全性。附圖說(shuō)明圖1：攜帶安全機(jī)制的針對(duì)CD20的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)圖。圖2：攜帶安全機(jī)制的針對(duì)CD20的嵌合抗原受體表達(dá)載體模式圖。(pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-IRES2-HSVTK)。圖3：CAR20-T細(xì)胞的體外致瘤性試驗(yàn)結(jié)果。圖4：經(jīng)過(guò)基因修飾的針對(duì)CD20的T細(xì)胞(CAR20-T)與未經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞(CAR0-T)對(duì)Raji細(xì)胞及Namalwa(CD20淋巴瘤細(xì)胞系)的識(shí)別與殺傷作用。圖5：CAR20-T與對(duì)照組CAR0-T對(duì)Namalwa淋巴瘤小鼠模型的治療作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，圖片A：BALB/c裸鼠接種Namalwa細(xì)胞5×106觀察25d后，可見(jiàn)皮下發(fā)生巨大腫瘤包塊。圖片B：BALB/c裸鼠接種Namalwa細(xì)胞5×106后第二天注射CAR0-T,25d后仍可觀察到小鼠皮下產(chǎn)生巨大腫塊。圖片C：BALB/c裸鼠接種Namalwa細(xì)胞5×106后第二天注射CAR20-T,25d后觀察可見(jiàn)小鼠外表未見(jiàn)任何腫瘤或包塊。圖片D：CAR20-T治療組經(jīng)解剖后可見(jiàn)皮下未存在任何可見(jiàn)腫瘤或由于CAR20-T治療而產(chǎn)生的腫瘤。圖片E1：Namalwa細(xì)胞5×106小鼠腫瘤。圖片E2：Namalwa細(xì)胞5×106+CAR0-T5×106小鼠腫瘤。圖6：更昔洛韋啟動(dòng)CAR20-T自殺基因體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者， 均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：CAR表達(dá)框體的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)構(gòu)成CAR各組分的氨基酸序列與編碼序列，拼接成整個(gè)融合的氨基酸序列與編碼DNA表達(dá)框，全長(zhǎng)序列中含有anti-hCD20scFv(SEQIDNO:2或SEQIDNO:6)和人CD28跨膜及胞內(nèi)段(SEQIDNO:3或SEQIDNO:7)，CD3ζ鏈(SEQIDNO:4或SEQIDNO:8)以及HSVTK自殺基因(SEQIDNO:5或SEQIDNO:9)，合稱(chēng)為anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK序列(如圖1所示)，序列的兩端引入了XbaI和SalI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的編碼序列。本發(fā)明中對(duì)anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK采取了人工合成全長(zhǎng)序列，委托華大基因有限公司有償合成。選用第三代慢病毒載體pLenti-CMV，其5'和3'端均含有自失活序列，以確保不能包裝成完整的具有復(fù)制能力的慢病毒，啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子。其后利用XbaI和SalI限制性內(nèi)切酶同時(shí)酶切合成的序列和載體，經(jīng)回收后連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，利用氨芐青霉素抗性篩選經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性克隆，首先利用PCR鑒定陽(yáng)性克隆并隨后擴(kuò)增陽(yáng)性菌，使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，獲得各重組表達(dá)載體的高品質(zhì)質(zhì)粒,成功獲得pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK慢病毒質(zhì)粒(如圖2所示)。SEQIDNO:#指代片段SEQIDNO:1pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK轉(zhuǎn)移載體(核酸序列)SEQIDNO:2hCD20scFv(核酸序列)SEQIDNO:3hCD28z(核酸序列)SEQIDNO:4hCD3ζ(核酸序列)SEQIDNO:5HSVTK(核酸序列)SEQIDNO:6hCD20scFv(氨基酸序列)SEQIDNO:7hCD28z(氨基酸序列)SEQIDNO:8hCD3ζ(氨基酸序列)SEQIDNO:9HSVTK(氨基酸序列)SEQIDNO:10CMV啟動(dòng)子(核酸序列)SEQIDNO:11PRE(核酸序列)實(shí)施例2：包含CAR結(jié)構(gòu)的病毒包裝采用293FT為包裝細(xì)胞，待長(zhǎng)至90％融合度時(shí)，換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine3000，對(duì)于一個(gè)六孔板，轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒各自用量分別為，vsv-G 0.37μg+tat0.19μg+rev0.19μg+gag0.19μg+vector(pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK)2μg，按照Lipofectamine3000說(shuō)明書(shū)操作，配制好轉(zhuǎn)染液之后，加入至無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的293FT中，6小時(shí)后換為10％胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后收集病毒液，過(guò)濾后按轉(zhuǎn)速90,000gx2小時(shí)離心，加入500μlPBS/管，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?shí)施例3：anti-hCD20-CAR-T(CAR20-T)的制備采用50ml注射器，一次性采集淋巴瘤患者50ml外周血，利用PBS按1:2稀釋之后，緩慢加入至Ficoll分離液上，比例為2：1。室溫下1500rpm離心10分鐘，可見(jiàn)分為三層，中間一層白色的為淋巴細(xì)胞；輕輕吸取淋巴細(xì)胞層到6ml～8mlRPMI1640中洗脫；1500rpm離心10分鐘；去掉上清，加入2mlRPMI1640，計(jì)數(shù)后按0.5x106/ml加入至OpTmizerTMT-cellExpansionSFM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜。將上一步驟中獲得的病毒液按MOI5、polybrene10μg/ml/、1000IU/ml重組人白介素2(rhIL-2)混合加入至過(guò)夜培養(yǎng)后的T細(xì)胞，細(xì)胞濃度為0.5x106/ml，培養(yǎng)過(guò)夜后換用含1000IU/mlrhIL-2的OpTmizerTMT-cellExpansionSFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～7日后，選用山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體為一抗和APC標(biāo)記的驢抗山羊抗體為二抗，對(duì)照為加入經(jīng)空載體包裝獲得的病毒同步感染的T細(xì)胞，檢測(cè)所得的APC陽(yáng)性細(xì)胞即為陽(yáng)性的anti-hCD20-CAR-T細(xì)胞(CAR20-T)。為進(jìn)一步證明CAR20-T細(xì)胞特異識(shí)別人CD20序列，還利用人CD20-Fc融合蛋白(acrobiosystems公司)加APC標(biāo)記的anti-Fc抗體進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)施例的研究結(jié)果表明，陽(yáng)性細(xì)胞比率為40～60％。實(shí)施例4：anti-hCD20-CAR-T細(xì)胞(CAR20-T)特異識(shí)別與殺傷CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株選用Raji細(xì)胞與Namalwa細(xì)胞株，按10μMCFSE標(biāo)記。CAR20-T細(xì)胞按1uMCFSE標(biāo)記。將CAR20-T細(xì)胞和Raji、Namalwa細(xì)胞分別按效靶比1:1和10:1比例進(jìn)行混合，對(duì)照(CAR0-T)為加入經(jīng)空載體包裝獲得的病毒同步感染擴(kuò)增培養(yǎng)的T細(xì)胞。設(shè)置殺傷時(shí)間為8小時(shí)，收集后使用流式檢測(cè)觀察其識(shí)別與殺傷效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示未經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞對(duì)Namalwa細(xì)胞株幾乎沒(méi)有殺傷效果，反而經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后Namalwa細(xì)胞產(chǎn)生了一定的增長(zhǎng)，在1:1與10:1組分別增長(zhǎng)了8.2％與1.38％；未經(jīng)修飾的T細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷效率在1:1與10:1組中分別為7.9％與1.29％。經(jīng)過(guò)基因修飾的CAR20-T細(xì)胞對(duì)Namalwa細(xì)胞與Raji細(xì)胞均產(chǎn)生了識(shí)別與特異性殺傷。在針對(duì)Namalwa細(xì)胞的1:1殺傷實(shí)驗(yàn)中，CAR20-T殺傷了4.7％的Namalwa 細(xì)胞，與對(duì)照組中細(xì)胞反而增殖相比，共抑制了12.9％的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，10:1組殺傷了1.29％的腫瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，共降低了2.67％的腫瘤生長(zhǎng)。CAR20-T細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞1:1的試驗(yàn)中，共殺傷了15％的腫瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，比未經(jīng)修飾的T細(xì)胞多殺傷了7.1％的腫瘤細(xì)胞，10:1組中殺傷了4.36％的腫瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，增加殺傷效率3.07％。上述結(jié)果顯示CAR20-T可特異性識(shí)別CD20抗原，并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，且殺傷效率優(yōu)于未經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞。實(shí)施例5：CAR20-T細(xì)胞致瘤性實(shí)驗(yàn)配制低熔點(diǎn)瓊脂，高壓滅菌后待用。配置如下培養(yǎng)基：1.未加因子的培養(yǎng)基：45mLDMEM+5mL的FBS(10％)，混勻后置于4℃保存(10％FBS+DMEM)。2.1x因子培養(yǎng)液(上層液)：5mL的FBS+42.5mL的DMEM+剩余體積加入1x因子(EGF+GLU)，混勻，4℃保存。3.中層液的配制：10mLFBS+37.5mL的DMEM剩余體積加入2倍體積因子(20％FBS+DMEM+2x因子)。選用HEPG2作為對(duì)照細(xì)胞，與CAR20-T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量“100-200-400”逐孔進(jìn)行，方法：將含有60℃水的燒杯放入安全柜內(nèi)操作，燒杯中放入一直溫度計(jì)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溫度的變化，分別向含細(xì)胞的15mL離心管內(nèi)，快速加入400ul0.5％瓊脂/管，每次加瓊脂均更換槍頭，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后小心垂直加入至含1.5％瓊脂的12孔板內(nèi)。當(dāng)溫度接近40℃時(shí)，將燒杯放入60℃水浴鍋內(nèi)，重新恢復(fù)溫度，然后重復(fù)操作，加完為止。放置10分鐘后，轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日補(bǔ)充上層培養(yǎng)液500～800ul/孔，然后2～3天換液一次，500uL/次。待陽(yáng)性孔內(nèi)的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)大面積的細(xì)胞集落生長(zhǎng)時(shí)，可用結(jié)晶紫染色后，用三維掃描儀掃描。結(jié)果(如圖4顯示)顯示HEPG2形成腫瘤集落，而CAR20-T沒(méi)有集落形成，證明CAR20-T不具備致瘤性。實(shí)施例6：CAR20-T細(xì)胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤預(yù)防性的治療作用取6-8周的SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)9只。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞Namalwa至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS洗滌后，用胎盤(pán)藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞活力，PBS重懸。將腫瘤細(xì)胞5×106接種于每只裸鼠右前肢背部皮下，將接種后的小鼠隨機(jī)分為3組，每組3只，為腫瘤對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞+空載體T細(xì)胞組(CAR0-T)、腫瘤細(xì)胞+CAR20-T組，即后兩組在接種后第二天分別在接種處注射5×106的對(duì)照用空載體T細(xì)胞(CAR0-T)與CAR20-T，共觀察25d。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，試驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)照射后的裸鼠直接皮下 注射N(xiāo)amalwa細(xì)胞株可成功建立淋巴瘤模型，并成功觀察到腫瘤；未經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞在淋巴瘤動(dòng)物模型中未能識(shí)別并殺傷腫瘤，腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，與未治療組基本一致；經(jīng)過(guò)基因修飾的針對(duì)CD20的T細(xì)胞產(chǎn)生了很好的識(shí)別與殺傷效果，全部試驗(yàn)小鼠經(jīng)解剖后未發(fā)現(xiàn)任何腫瘤組織或由于CAR-T細(xì)胞導(dǎo)致的成瘤組織。在實(shí)際臨床治療中，依照1×105/kg～10×107/kg計(jì)算總細(xì)胞量，以占總量的10％、30％、60％進(jìn)行每天或隔天給予梯度細(xì)胞輸注，以取得安全性與療效的最佳平衡。實(shí)施例7：CAR20-T的自殺基因有效性試驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)步驟制備CAR20-T細(xì)胞與CAR0-T細(xì)胞，將CAR20-T細(xì)胞與CAR0-T細(xì)胞分別按照1x104/cm2的密度接種到六孔板中，其中各自再分為2組，設(shè)為給藥組和不給藥組，給藥組給予更昔洛韋1μg/ml；培養(yǎng)72h后，鏡下觀察細(xì)胞存活狀態(tài)。培養(yǎng)72小時(shí)后，鏡下觀察，結(jié)果如圖6所示，CAR20-T給藥組細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，但為給藥組并未出現(xiàn)以上情況；而用空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組(CAR0-T)，給藥組與為給藥組細(xì)胞均存活，且生長(zhǎng)情況一致。在實(shí)際臨床治療中，可依據(jù)患者體重，給予6mg/kg連續(xù)3天以達(dá)到上述效果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3