專(zhuān)利名稱(chēng)：絲裂霉素c-右旋糖酐及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療惡性腫瘤的藥物及其制備方法，尤其是用于惡性腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移的藥物及其制備方法。
惡性腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后有很大關(guān)系。如胃癌無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者根治后的生存率是有淋巴轉(zhuǎn)移者的二倍。胃癌復(fù)發(fā)死亡病例中以淋巴組織復(fù)發(fā)為死因者占20%。將抗癌藥直接注入到淋巴管中的方法因技術(shù)上的困難，臨床應(yīng)用價(jià)值有限，常規(guī)的全身給藥方法也沒(méi)有很好解決淋巴轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。大量抗癌藥不能轉(zhuǎn)運(yùn)并集中于胃周淋巴結(jié)，高血濃度產(chǎn)生嚴(yán)重副作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)消化道惡性腫瘤的治療的研究多集中于5-FU及博萊霉素的乳化劑和脂質(zhì)體，以及活性碳吸附MMC，這些藥物與載體的結(jié)合力屬于物理因素。MMC存在的問(wèn)題是靜脈給藥后，由于血中脂蛋白及其它物質(zhì)的作用而迅速裂解，并迅速由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，如肝脾吞噬而清除，這對(duì)化療中靶組織非肝脾者是不利的，如骨髓抑制，胃腸道損害和不可避免的局部壞死，不能通過(guò)改變用藥途徑解決。藥物在淋巴組織中的含量聚集是一種預(yù)防淋巴轉(zhuǎn)移及術(shù)后淋巴組織癌復(fù)發(fā)的可靠方法，并可通過(guò)檢測(cè)給織中的抗腫瘤藥物濃度來(lái)決定可能的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的目的在于提供一種在不降低抗腫瘤活性的前提下，具有向淋巴管、淋巴結(jié)集中，并且釋放緩慢維持時(shí)間長(zhǎng)，可消除淋巴組織中微小轉(zhuǎn)移灶，也就是提出一種通過(guò)改變藥代動(dòng)力學(xué)特性，使其濃度宜于聚集在淋巴系統(tǒng)的藥物及其制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，絲裂霉素C-右旋糖酐依據(jù)如下原理MMC的分子量為334.34，是一個(gè)小分子物質(zhì)。由于毛細(xì)血管中血液的流速為淋巴管內(nèi)淋巴液流速的500倍，如果沒(méi)有淋巴管選擇吸收的機(jī)制，織中的藥物主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和濾過(guò)作用經(jīng)血液吸收并清除，而不經(jīng)過(guò)淋巴管道，故治療腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移是困難的。毛細(xì)血管壁上存在半徑為40 左右的細(xì)孔最多，尚有少數(shù)半徑大40 4～19倍的細(xì)孔，當(dāng)藥物分子量從2萬(wàn)(半徑為32 )向4萬(wàn)(半徑為49 )過(guò)渡時(shí)，淋巴液藥物濃度/血漿濃度比值增加。將MMC與7萬(wàn)分子量的右旋糖酐相連接，合成的MMC-D半徑為74 。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的由絲裂霉素(Mitomycin)C、右旋糖酐(Dextran)、6-氨基己酸(ε-aminocaproic acid)、碳二亞胺鹽酸鹽(3-dimethyl-aminoprpyl)及溴化氰(Cyemogen bromide)合成MMC-D。氫氧化鈉、丙酮及碳酸鈉均為分析純化劑。本發(fā)明的制備方法是將120mg(效價(jià))MMC除鹽，放入100ml的圓底容器中，加入60ml的丙酮搖勻;將紅色上清倒入250ml的容器中，用H-B循環(huán)水或真空干燥機(jī)干燥;將250ml的容器放到磁力攪拌器上，內(nèi)加磁力攪拌子，通電，向容器中加入雙蒸餾水10ml及右旋糖酐(T70)克，待溶解后，分三次加入0.2、0.2、0.15克溴化氰，同時(shí)測(cè)定PH值，滴入1N NaOH使PH值保持于10.7，加入1克6-氨基己酸，用1N HCl使PH值保持于9.0，反應(yīng)24小時(shí);把反應(yīng)所得溶液倒入透析袋中，置于0.1mol/L Na2CO3溶液中，10分鐘換一次Na2CO3溶液，重復(fù)六次;將100Mg MMC加入透析后的溶液中，放入催化劑碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)定PH值為5-6，反應(yīng)24小時(shí)，加入丙酮，將沉淀物置于G6玻璃纖維漏斗上，過(guò)濾，真空干燥，所得物置于4℃冰箱內(nèi)保存。
檢測(cè)MMC-D交聯(lián)情況合成完畢后及保存一年時(shí)二次檢測(cè)，判斷交聯(lián)情況及穩(wěn)定性。采用美國(guó)Waters液相色譜系統(tǒng)，高效液相色譜法檢測(cè)MMC-D的交聯(lián)，分析柱TSR-GEL3，000W，流動(dòng)相PH7.0磷酸緩沖液，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)365nm，靈敏度0.2AUFS。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大白鼠，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，Wistar系，雄性，體重248+20.6克，按組間一致的原則將動(dòng)物隨機(jī)分為MMC給藥組及MMC-D給藥組，(1)用乙醚開(kāi)放麻醉;(2)用生理鹽水配制1mg當(dāng)量MMC/ml的MMC及MMC-D溶液。用1ml注射器按2ml/Kg鼠重抽取溶液，注入到大鼠左大腿肌肉內(nèi);(3)注射MMC組于5′、15′、30′取左側(cè)腹腔髂淋巴結(jié)，注射部位肌肉及心臟取血。血離心5000rpm10分鐘。淋巴結(jié)及肌肉以CPS-Ⅰ型超聲波粉碎機(jī)粉碎后離心，8，000rpm5分鐘，取上清測(cè)濃度;(4)MMC-D給藥組于5′、30′、1h、2h、4h、8h、24h取樣送檢同上。離心前90℃、5分鐘加熱，使MMC-D裂解為MMC;(5)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)菌種為沈陽(yáng)藥學(xué)院提供的大腸桿菌1093，把MMC制備成5、10、15、20、30、35、40ug/ml溶液，管碟法加入100微升，培養(yǎng)12小時(shí)，測(cè)抑菌圈大小，以濃度對(duì)抑菌圈直徑作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);(6)加樣測(cè)樣品抑菌圈直徑，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查樣品濃度，繪制樣品藥物濃度-時(shí)間變化曲線(xiàn)，將數(shù)值輸入到3p88程序的電子計(jì)算機(jī)系統(tǒng)得出并比較藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);(7)結(jié)果MMC-D注入大鼠左大腿肌肉內(nèi)，引流的腹腔淋巴結(jié)中藥物2小時(shí)達(dá)185.2mg/g，是MMC組淋巴結(jié)藥物濃度峰值的八倍，MMC-D組24小時(shí)濃度仍為55.6mg/g，MMC組30分鐘內(nèi)藥物消失，注射MMC-D局部24小時(shí)仍有33.5%以結(jié)合方式存在，血中未測(cè)出藥物濃度，MMC組注射局部藥物30分鐘內(nèi)消失，5分鐘時(shí)血漿濃度為3ug/g、淋巴結(jié)內(nèi)MMC-D的AuC為901.16ug/g.h，MMC為4.095ug/g.h，前者為后者的220倍。故MMC-D為預(yù)防和治療淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的理想藥物。
抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)定(1)胃癌細(xì)胞系MGC-803由山東師范大學(xué)建株，中國(guó)醫(yī)大腫瘤研究所提供;(2)將MMC-D及MMC配制成4、3、2、1、0.5、0.1、0.25ug當(dāng)量/ml的1640培養(yǎng)液為溶劑的溶液，加入MGC-803細(xì)胞，以105個(gè)細(xì)胞/ml孔加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)樣本加三個(gè)孔，另外，將細(xì)胞加入1640培養(yǎng)液中，為對(duì)照組。5%CO2，37℃下培養(yǎng)三天，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，算出抑制率，計(jì)算公式為抑制率＝(1- (T)/(C) )×100%T-代表藥物作用后的瘤細(xì)胞數(shù)C-代表對(duì)照組的瘤細(xì)胞數(shù)結(jié)果證實(shí)MMC-D的抗腫瘤細(xì)胞活性與MMC基本相等。這是因?yàn)镸MC-D帶陽(yáng)電荷，可吸附到帶陰電荷的腫瘤細(xì)胞表面，不斷釋放完整的MMC表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。MMC-D由化學(xué)水解作用水解，而不由細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酶降解，其分解速率是恒定的，半衰期為30小時(shí)。在72小時(shí)培養(yǎng)中，大部分MMC-D均裂解為MMC，故MMC-D的抗腫瘤活性與MMC相近。
MMC為乙撐亞胺抗生素混合物中的一種成分，其結(jié)構(gòu)包括醌環(huán)引哚、氮丙啶環(huán)及甲氧甲酰胺側(cè)鏈，作用機(jī)制是烷化作用，兩個(gè)活性的烷化基團(tuán)氮丙啶環(huán)及甲氧甲酰胺側(cè)鏈結(jié)合在DNA的復(fù)制。右旋糖酐分子量可以自由改變，常用的有T10、分子量1萬(wàn);T70，分子量7萬(wàn);T500，分子量50萬(wàn)。本實(shí)驗(yàn)是采用淋巴組織趨向性較好的T70大分子右旋糖酐，與MMC通過(guò)6-氨基己酸相連接。在MMC-D的合成過(guò)程中，使反映溶液始終保持要求的PH值。合成后及保存一年時(shí)的交聯(lián)率均為90%，其高度的穩(wěn)定性，提高了MMC-D的實(shí)用可靠性。
與已有技術(shù)比，MMC-D具有淋巴結(jié)內(nèi)濃度高、緩釋性、不降低MMC的抗腫瘤活性等優(yōu)點(diǎn)，是預(yù)防惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移的有效藥物。
權(quán)利要求
1.絲裂霉素C-右旋糖酐，其特征是由絲裂霉素C、氨基已酸、碳二亞胺鹽酸鹽及溴化氰配制而成，以大分子右旋糖酐作為載體，6-氨基已酸為連接劑，將絲裂霉素C交聯(lián)于右旋糖酐，使其共價(jià)結(jié)合。
2.絲裂霉素C-右旋糖酐的制備方法，其特征是將MMC除鹽，將容器放在磁力攪拌器上，內(nèi)加磁力攪拌子，通電，再向該容器中加入雙蒸餾水及右旋糖酐，待溶解后，分三次加入溴化氰，同時(shí)測(cè)定PH值，滴入1N NAOH保持PH值，加入6-氨基己酸，用1NHCL保持PH值，反應(yīng)24小時(shí);把反應(yīng)所得溶液倒入透析袋中，置于Na2CO3溶液，10分鐘換一次，Na2CO3溶液重復(fù)6次;將MMC加入透析后的溶液中，放入催化劑碳二亞胺鹽酸鹽，調(diào)定PH值，反映24小時(shí);加入丙酮，將沉淀物置于漏斗過(guò)濾，再行真空干燥，所得物冷藏保管。
全文摘要
絲裂霉素C-右旋糖酐及其制備方法，是一種預(yù)防和治療惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的藥物和制備方法，是改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量的一種藥物。通過(guò)本發(fā)明的方法制備出的MMC-D，減輕了MMC的副作用。如骨髓抑制、胃腸損害。不發(fā)生局部壞死。MMC-D有淋巴組織分布多，釋放緩慢維持作用時(shí)間長(zhǎng)，不降低抗腫瘤活性的特點(diǎn)，可消除淋巴組織中的微小轉(zhuǎn)移灶和淋巴管中的游離癌細(xì)胞，為預(yù)防和治療惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑。
文檔編號(hào)A61K31/40GK1097767SQ9311208
公開(kāi)日1995年1月25日 申請(qǐng)日期1993年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月21日
發(fā)明者齊春蓮 申請(qǐng)人:齊春蓮