本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體說，是一種大腸桿菌菌影載體pPBA1100-DLS-ES及其制備方法。

背景技術(shù)：

禽大腸桿菌是引起禽類大腸桿菌病的重要病原，引起復(fù)雜多樣的臨床癥狀，常呈混合感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的影響。由于抗生素的長期使用，大腸桿菌的耐藥性和耐藥譜不斷擴(kuò)展，隨著耐藥菌株和超級(jí)菌的出現(xiàn)，使藥物防治的效果已大不如前?？股匾踩菀讓?dǎo)致藥物殘留，現(xiàn)在很多地方已經(jīng)禁止使用抗生素類藥物。目前對(duì)于大腸桿菌病的控制，主要采取綜合防治措施，比如說加強(qiáng)管理，合理給藥，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖呓臃N。由于大腸桿菌血清型眾多，各血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)力，必須做好血清型監(jiān)測(cè)，以便有針對(duì)性的進(jìn)行免疫接種。國內(nèi)外常用的大腸桿菌疫苗有滅活苗，弱毒活菌苗，亞單位疫苗。它們都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)：滅活苗成本低，操作簡單但缺乏交叉保護(hù)力，而且滅活過程會(huì)破壞免疫原性；弱毒活菌苗有良好的免疫原性，制備簡單但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；亞單位疫苗免疫效果好但存在血清特異性沒有交叉保護(hù)效果等缺點(diǎn)。因此，研制一種高效，安全的規(guī)?；a(chǎn)的新型疫苗十分必要。

目前，菌影疫苗被成功應(yīng)用到各種不同類型的革蘭氏陰性細(xì)菌中，包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、胸膜肺炎放線桿菌、霍亂弧菌等，但都處于實(shí)驗(yàn)室階段，滅活效率是菌影疫苗能否成功應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種大腸桿菌菌影載體pPBA1100-DLS-ES及其制備方法，以卡那抗性的E.coli-Pm穿梭載體pPBA1100為表達(dá)載體骨架，在溫控單裂解表達(dá)系統(tǒng)中引入編碼金黃色葡萄球菌核酸酶A的SN基因，提高了裂解效率，制備了大腸桿菌菌影。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種大腸桿菌菌影載體pPBA1100-DLS-ES，由E基因，SN基因，PBV2200載體的溫控表達(dá)原件DLS和E.coli-Pm穿梭載體pPBA1100組成；所得E-15L-SN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

借助15個(gè)柔性氨基酸linker采用融合PCR方法實(shí)現(xiàn)噬菌體PhiX174的E基因與金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN的串聯(lián)，并構(gòu)建溫控表達(dá)載體PBV-ES；以PBV-ES質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒DLS-ES，將其插入到E.coli-Pm穿梭載體pPBA1100，構(gòu)建溫控雙基因裂解載體pPBA1100-DLS-ES。

進(jìn)一步的，所述菌影載體為雙基因表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，PBV220-ES載體的溫控雙裂解表達(dá)盒DLS-ES為PBV220-ES載體基因序列中從阻遏蛋白到終止子的全部基因序列。

進(jìn)一步的，所述的pPBA1100為載體E.coli-Pm穿梭載體，可同時(shí)制備大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌菌影。

一種大腸桿菌菌影載體pPBA1100-DLS-ES的構(gòu)建方法包括如下步驟:

1)、以噬菌體PhiX174RF1質(zhì)粒和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923的基因組為模板，分別擴(kuò)增裂解基因E和核酸酶A基因SN，通過15個(gè)柔性氨基酸linker采用融合PCR方法實(shí)現(xiàn)E與SN基因的串聯(lián)E-15L-SN，將融合片段E-15L-SN與T載體相連，篩選陽性質(zhì)粒；

2)、將步驟1)得到的陽性質(zhì)粒，亞克隆到質(zhì)粒pBV220中，得到重組質(zhì)粒pBV220-ES；

3)、以步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-ES為模板，PCR擴(kuò)增DLS-ES基因；將DLS-ES片段與T載體相連，篩選陽性質(zhì)粒；

4)、將步驟3)得到的陽性質(zhì)粒，亞克隆到E.coli-Pm質(zhì)粒pPBA1100中，得到重組質(zhì)粒pPBA1100-DLS-ES；

5)、將步驟4)得到的重組質(zhì)粒pPBA1100-DLS-ES電轉(zhuǎn)入大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，通過升溫誘導(dǎo)制備大腸桿菌菌影，菌影凍干保存。

進(jìn)一步的，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表基因序列：E，9626372；SN，685631213，設(shè)計(jì)引物，通過linker3：G4S將雙基因串聯(lián)，引物序列如下表：

2)E，SN和E-15L-SN基因的PCR擴(kuò)增

以噬菌體Φ174RFI DNA為模板，以E1,E2為上、下游引物，擴(kuò)增E基因；以E1,E2’為上、下游引物，擴(kuò)增E-15aalinker。反應(yīng)條件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存；反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

以金黃色葡萄球菌基因組為模板，以SN1’,SN2為上、下游引物，擴(kuò)增15aalinker-SN；反應(yīng)條件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存；反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

以E-15aalinker和15aalinker-SN為模板，以E1,SN2為上、下游引物，采用降落PCR擴(kuò)增E-15L-SN基因，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s,60℃退火90s，每循環(huán)降0.5℃，72℃延伸1min，20個(gè)循環(huán)；再94℃變性45s，55℃退火90s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的片段；

3)目的基因的鑒定

回收E,SN和E-15L-SN基因，與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化篩選陽性重組子提質(zhì)粒酶切鑒定；陽性重組子送上海生工測(cè)序；

4)重組溫控表達(dá)載體構(gòu)建

EcoR I和Sal I分別雙酶切片段E-15L-SN及PBV220載體，回收目的片段，T4連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化篩選陽性重組子，構(gòu)建重組表達(dá)載體PBV-ES；

5)溫控裂解盒的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上λpL/pR-cI857溫控啟動(dòng)子序列及pBV220質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)溫控裂解盒上游引物，下游引物即為SN基因下游引物，引物序列如下：

WK-BamHI：5’-CCG GGATCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(BamHI)

SN2：5'-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3'(SalI)

以pBV-ES質(zhì)粒為模板，以WK-BamHI和SN2為上、下游引物，擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒DLS-ES；反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存；反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)后回收目的片段；

6)重組穿梭載體pPBA1100-DLS-ES的構(gòu)建

BamHI和SalI分別雙酶切片段DLS-ES和質(zhì)粒pPBA1100，回收目的片段，T4連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化篩選陽性重組子，獲得重組穿梭載體pPBA1100-DLS-ES；

7)大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

取一80℃保存的大腸桿菌菌株涂布于LB平板37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，在5mL LB培養(yǎng)基中37℃,225rpm過夜振蕩培養(yǎng)，將此培養(yǎng)液取1mL再接種在100mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，1:100，37℃振蕩培養(yǎng)至OD介于0.3-0.4之間約2h取出，冰浴30min，10％的滅菌甘油同時(shí)置于冰上；

4℃，2500rpm/min離心15min，用30mL冰浴的10％的甘油充分重懸沉淀；

4℃，2500rpm/min離心15min，10％甘油洗滌三次棄上清；最后用1mL冰浴的10％甘油充分重懸沉淀，保持冰浴狀態(tài)下分裝成200ul/份。注意制備的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)盡量在當(dāng)天使用，不宜保存；

8)大腸桿菌菌影的制備

采用電轉(zhuǎn)法將重組穿梭載體pPBA1100-DLS-ES電轉(zhuǎn)入大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，通過升溫誘導(dǎo)制備大腸桿菌菌影，并以pPBA100，pPBA1100-DLS-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌作對(duì)照，對(duì)其裂解效率做了初步研究和比較，透射電鏡觀察裂解前后菌體的變化。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明在溫控單裂解表達(dá)系統(tǒng)中引入編碼金黃色葡萄球菌核酸酶A的SN基因，提高了裂解率，裂解率可達(dá)99.99999％，同時(shí)也降低了僅通過裂解基因E來制作菌影存在的功能基因在菌體間轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，以卡那抗性的E.coli-Pm穿梭載體pPBA1100為表達(dá)載體骨架，使耐青霉素類大腸桿菌也能通過溫控載體制備菌影，制備了大腸桿菌菌影。本發(fā)明構(gòu)建好的載體可以同時(shí)在大腸和巴氏桿菌中表達(dá)。

附圖說明

圖1為42℃誘導(dǎo)后各組菌液生長曲線；

圖2為42℃誘導(dǎo)后各組菌菌落計(jì)數(shù)；

圖3為致病大腸桿菌菌影電鏡照片；

圖4為E基因的核苷酸序列；

圖5為SN基因的核苷酸序列；

圖6為E-15L-SN基因的核苷酸序列；

其中，框體為上游引物；灰色框體為為Linker；

黑粗體為下游引物；黑粗體：為上下游引物重復(fù)部分

酶切位點(diǎn)：開頭為EcoR I(GAATTC)，結(jié)尾為SalI(GTCGAC)設(shè)保護(hù)堿基。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

試驗(yàn)例：致腎性大腸桿菌菌影的制備

1材料與方法

1.1材料

致腎性大腸桿菌為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈(zèng)，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株TACC25923購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；pPBA1100質(zhì)粒由澳大利亞莫納什大學(xué)微生物學(xué)系的BenAdler教授惠贈(zèng)；PBV220質(zhì)粒購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI，SalI和BamHI，T4連接酶，pMD18-T和E.coli DH5a，噬菌體Φ174RFI DNA購自大連Takara公司。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表基因序列(E，9626372；SN，685631213)設(shè)計(jì)引物，通過linker(G4S)3將雙基因串聯(lián)，引物序列見下表，所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1引物序列

1.2.2E,SN和E-15L-SN基因的PCR擴(kuò)增

以噬菌體Φ174RFI DNA為模板，以E1,E2為上、下游引物，擴(kuò)增E基因；以E1,E2’為上、下游引物，擴(kuò)增E-15aalinker。反應(yīng)條件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以金黃色葡萄球菌基因組為模板，以SN1，SN2為上下游引物，擴(kuò)增SN基因；以SN1’,SN2為上、下游引物，擴(kuò)增15aalinker-SN。反應(yīng)條件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以E-15aalinker和15aalinker-SN為模板，以E1,SN2為上、下游引物，采用降落PCR擴(kuò)增E-15L-SN基因，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s,60℃退火90s，每循環(huán)降0.5℃，72℃延伸1min，20個(gè)循環(huán)；再94℃變性45s，55℃退火90s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的片段。

1.2.3目的基因的鑒定

如圖4-6所示，回收E,SN和E-15L-SN基因，所得E-15L-SN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化篩選陽性重組子提質(zhì)粒酶切鑒定。陽性重組子送上海生工測(cè)序。

1.2.4重組溫控表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoR I和Sal I分別雙酶切片段E和片段E-15aalinker-SN及PBV220載體，回收目的片段，T4連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化篩選陽性重組子，構(gòu)建重組表達(dá)載體PBV-E和PBV-ES。

1.2.5溫控裂解盒的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上λpL/pR-cI857溫控啟動(dòng)子序列及pBV220質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)溫控裂解盒上游引物，下游引物為E基因或者SN基因下游引物，引物序列如下：

WK-BamHI：5’-CCG GGATCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(BamHI)

E2：5'-GGC GTCGAC TTA CTCCTTCCGCACGTAAT-3'(SalI)

SN2：5'-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3'(SalI)

以PBV-E質(zhì)粒為模板，WK-BamHI和E2為上、下游引物，擴(kuò)增溫控單基因裂解盒(DLS-E)；以pBV-ES質(zhì)粒為模板，以WK-BamHI和SN2為上、下游引物，擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒(DLS-ES)。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)后回收目的片段。

1.2.6重組穿梭載體pPBA1100-DLS-ES的構(gòu)建

用BamHI和SalI分別雙酶切片段DLS-ES和DLS-E，質(zhì)粒pPBA1100，回收目的片段，構(gòu)建重組穿梭載體pPBA1100-DLS-E和pPBA1100-DLS-ES。陽性菌落提質(zhì)粒做PCR和雙酶切鑒定。

1.2.7致腎性大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

取一80℃保存的致腎性大腸桿菌菌株涂布于LB平板37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，在5mL LB培養(yǎng)基中37℃,225rpm過夜振蕩培養(yǎng)，將此培養(yǎng)液取1mL再接種在100mL新鮮的LB培養(yǎng)基中(1:100)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD介于0.3-0.4之間約2h取出，冰浴30min，10％的滅菌甘油同時(shí)置于冰上；

4℃，2500rpm/min離心15min，用30mL冰浴的10％的甘油充分重懸沉淀；

4℃，2500rpm/min離心15min，棄上清(10％甘油洗滌三次)；最后用1mL冰浴的10％甘油充分重懸沉淀，保持冰浴狀態(tài)下分裝成200ul/份。注意制備的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)盡量在當(dāng)天使用，不宜保存。

1.2.8致腎性大腸桿菌菌影的制備

采用電轉(zhuǎn)法將pPBA1100-DLS-ES質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入致腎性大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)中。通過升溫誘導(dǎo)制備致腎性大腸桿菌菌影，并以pPBA100,pPBA1100-DLS-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌作對(duì)照，對(duì)其裂解效率做了初步研究和比較。

1.2.9致腎性大腸桿菌菌影裂解率的檢測(cè)

將含有pPBA1100,pPBA1100-DLS-E和pPBA1100-DLS-ES質(zhì)粒的致腎性大腸桿菌28℃225rpm搖床過夜培養(yǎng)。次日，再1：100轉(zhuǎn)接種于含卡那抗性(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)，直至OD600值達(dá)到0.4-0.6(約2h)。含有三種不同質(zhì)粒的菌液各取出1mL菌液用于菌落計(jì)數(shù)。然后各分2組，一組作為對(duì)照組，仍然在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)5h，另一組立即升溫到42℃熱誘導(dǎo)培養(yǎng)5h；從熱誘導(dǎo)開始，每間隔0.5h分別取樣測(cè)定各組的OD600值見圖1，誘導(dǎo)組每隔1h各取1mL菌液用于菌落計(jì)數(shù)見圖2。裂解率＝(1-裂解后菌落數(shù)/裂解前菌落數(shù))*100％。在裂解率最高時(shí)，pPBA1100-DLS-E組的裂解率達(dá)99.99992％，pPBA100-DLS-ES組的裂解率達(dá)99.99999％，裂解后活菌數(shù)下降了將近6個(gè)指數(shù)。

1.2.8透射電鏡觀察

選擇裂解率最高時(shí)收集菌影做透射電鏡觀察。將誘導(dǎo)4h的菌液4000g X 10min離心生理鹽水洗滌3次，置入2.5％的戊二醛溶液中進(jìn)行固定，置4℃下2h，乙醇逐級(jí)脫水，包埋劑包埋等步驟處理，在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

由圖1和圖2可以看出pPBA100-DLS-ES組的裂解率比pPBA1100-DLS-E組的高；從圖3的電鏡圖可以看出菌體發(fā)生不同程度的裂解，菌影呈空泡狀，細(xì)菌由于胞內(nèi)物質(zhì)排出，表明致腎性大腸桿菌菌影制備成功。這些可以證明利用穿梭溫控雙表達(dá)載體pPBA1100-DLS-ES制備菌影不僅提高了裂解效率而且可以用于耐青霉素類大腸桿菌菌影的制備。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種大腸桿菌菌影載體pPBA1100-DLS-ES及其制備方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggaattca tggtacgctg gactttgtgg gataccctcg ctttcctgct cctgttgagt 60

ttattgctgc cgtcattgct tattatgttc atcccgtcaa cattcaaacg gcctgtctca 120

tcatggaagg cgctgaattt acggaaaaca ttattaatgg cgtcgagcgt ccggttaaag 180

ccgctgaatt gttcgcgttt accttgcgtg tacgcgcagg aaacactgac gttcttactg 240

acgcagaaga aaacgtgcgt caaaaattac gtgcggaagg agggtggtgg tggttctggt 300

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgca acttcaacta aaaaattaca taaagaacct 360

gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat actgttaaat taatgtacaa aggtcaacca 420

atgacattca gactattatt ggttgataca cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta 480

gagaaatatg gtcctgaagc aagtgcattt acgaaaaaga tggtagaaaa tgcaaagaaa 540

attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga actgataaat atggacgtgg cttagcgtat 600

atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt 660

gcttatgttt ataaacctaa caatacacat gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa 720

gcgaaaaaag agaaattaaa tatttggagc gaagacaacg ctgattcagg tcaataagtc 780

gacgcc 786