一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應(yīng)用。所述載體為紗布，其固定化方法包括將紗布剪成邊長(zhǎng)0.9~1.1cm的碎片，用蒸餾水洗凈碎片后烘干，填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接紫外線滅菌；再加入9K培養(yǎng)基，并接入氧化亞鐵硫桿菌Z1菌液；采用吸附法，將接種過的反應(yīng)器于30℃恒溫條件下操作，同時(shí)對(duì)反應(yīng)器中的溶液進(jìn)行曝氣，氧化亞鐵硫桿菌Z1大量生長(zhǎng)并吸附在紗布表面；待反應(yīng)器成功運(yùn)行48h后，去除培養(yǎng)基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。同時(shí)，本發(fā)明公開了其在生物氧化中的應(yīng)用。本發(fā)明所提出的氧化亞鐵硫桿菌固定化方法及其應(yīng)用具有成本低、操作簡(jiǎn)單、無二次污染、利用大規(guī)模應(yīng)用及生物氧化速率快等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物固定領(lǐng)域，具體涉及一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans 簡(jiǎn)稱 A/)是由 Temple、Colmer等于20世紀(jì)50年代初發(fā)現(xiàn)并命名的。該菌系短桿狀，嗜酸性化能自養(yǎng)菌，專性好氧，最佳生長(zhǎng)PH值為2~2.5，最佳生長(zhǎng)溫度28~35，由于它能以氧化Fe2+、元素S和金屬硫化物等來獲得生命過程中所需的能量，并以O(shè)2作為最終電子受體，所以廣泛應(yīng)用于生物冶金、生物脫硫和含硫廢水的處理等領(lǐng)域。但是，該菌存在生長(zhǎng)緩慢，代謝周期長(zhǎng)，細(xì)胞得率低等缺陷，使其工業(yè)化應(yīng)用大大受到了限制。為實(shí)現(xiàn)快速、連續(xù)反應(yīng)，并增強(qiáng)反應(yīng)的穩(wěn)定性，細(xì)菌的固定化很重要。大多數(shù)生物反應(yīng)器如生物濾池、生物滴濾池等是以在載體表面形成的生物膜作為工作介質(zhì)的，因此固定化載體的選擇及載體掛膜是大規(guī)模應(yīng)用A /菌的重要環(huán)節(jié)之一。
[0003]在最近幾年，細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展迅速并成功應(yīng)用到實(shí)際工程領(lǐng)域。具體到固定化氧化亞鐵硫桿菌，不同的固定化方法和載體已經(jīng)被廣泛研究。例如，像利用吸附進(jìn)行固定化的材料有交換離子樹脂、沙粒、活性炭、殼聚糖粉末、玻璃粉、貧礦石和鎳合金纖維等；而利用包埋法進(jìn)行固定化的材料有聚乙烯醇凝膠、海藻酸鈣、聚亞安酯泡沫、瓊脂、卡拉膠和珍珠巖等。比較以上兩種固定化方法，吸附法有著表面積小和生物膜容易脫落等局限。同樣，包埋法有著氧擴(kuò)散慢、機(jī)械強(qiáng)度和耐受性較弱等缺點(diǎn)，而且大部分高分子聚合物對(duì)細(xì)菌有著一定的毒性。另外，目前研究的關(guān)于氧化亞鐵硫桿菌固定化方法中最高序批式氧化亞鐵速率僅僅為0.5g/(L.h)。低氧化亞鐵速率限制了 A /菌的實(shí)際工程應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服了上述缺陷，提供一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應(yīng)用。該方法便捷操作，實(shí)現(xiàn)了氧化亞鐵硫桿菌的連續(xù)化生產(chǎn)，以及可以用來研究氧化亞鐵固定化的生物氧化效果，為其他微生物固定化的規(guī)?；鸵?guī)范化應(yīng)用提供依據(jù)。
[0005]本發(fā)明中所使用的氧化亞鐵硫桿菌Zl為中國(guó)專利CN201310100105.X中記載的氧化亞鐵硫桿菌Z1，所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東云浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，該菌株是氧化亞鐵硫桿菌Zl (.AcicIi thiobacillus ferrooxi dans strain Z/),由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC NO: M 2013102，保藏日期為2013年3月25日，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。該菌在TSM I固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)單菌落。菌落為圓形、中部突起、紅棕色。光學(xué)顯微鏡下觀察該菌的形態(tài)為桿狀，寬度和長(zhǎng)度分別約為0.53 μ m和2.2 μ m，具有運(yùn)動(dòng)性，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為18~30h。生物學(xué)特征為:革蘭氏染色陰性，專性好氧，嗜酸性。
[0006]本發(fā)明采用網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的紗布作為固定化載體材料同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的反應(yīng)器保護(hù)細(xì)胞不受外界不利條件(如酸、堿、有害離子等)的影響，也不影響傳質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給和產(chǎn)物的導(dǎo)出，同時(shí)保持菌種高活性，且可反復(fù)利用。
[0007]本發(fā)明中氧化亞鐵在固定化過程中利用生物氧化來獲得生長(zhǎng)所需要的能量，從而實(shí)現(xiàn)在菌種持續(xù)生長(zhǎng)的過程中亞鐵離子的生物氧化。
[0008]一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體，所述載體為紗布，其經(jīng)線密度和緯線密度分別為11根/厘米和9根/厘米。
[0009]本發(fā)明所提供的氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，具體包括下述步驟:
(1)將紗布剪成邊長(zhǎng)為0.9^1.1cm的碎片，用蒸餾水洗凈碎片后烘干備用；所述紗布的經(jīng)線密度和緯線密度分別為11根/厘米和9根/厘米；
(2)將步驟(1)中所述紗布填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接紫外線滅菌；
(3)向反應(yīng)器內(nèi)加入40(T500mL的9K培養(yǎng)基，并按9%~11%的接種量接入45~55mL的氧化亞鐵硫桿菌Zl菌液，所述9K培養(yǎng)基的配比為=(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.lg/L, K2HPO4
0.5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4.7H20 44.3g/L, pH 值為 2 ；
(4)采用吸附法，將接種過的反應(yīng)器于30°C恒溫條件下進(jìn)行操作，同時(shí)對(duì)反應(yīng)器中的溶液進(jìn)行曝氣，曝氣量為0.5~2L/min，氧化亞鐵硫桿菌Zl大量生長(zhǎng)并吸附在紗布表面；
(5)待反應(yīng)器成功運(yùn)行48h后，去除培養(yǎng)基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。
[0010]優(yōu)選地，步驟(2)中的所述反應(yīng)器為自制的實(shí)驗(yàn)裝置系統(tǒng)，采用耐酸有機(jī)玻璃制成，反應(yīng)器呈圓柱體，直徑5c`m，高30cm，有效體積500mL，設(shè)有曝氣裝置，底部設(shè)有排水口。
[0011]優(yōu)選地，步驟(2)中的所述紗布投加質(zhì)量為l(T30g。
[0012]優(yōu)選地，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC M 2013102，保藏日期為2013年3月25日。
[0013]優(yōu)選地，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東云浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，接種菌液菌濃度為1.7 X IO7個(gè)/mL。
[0014]優(yōu)選地，步驟(5)中的所述去除培養(yǎng)基的方式為重力脫水，即為打開反應(yīng)器排水口直至無水滴流出。
[0015]本發(fā)明還提供了一種上述的固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體在生物氧化中的應(yīng)用。
[0016]上述應(yīng)用具體操作步驟為:將所述的固定化氧化亞鐵硫桿菌的紗布繼續(xù)放入反應(yīng)器中，再加入40(T500mL的9K培養(yǎng)基，在曝氣量為0.5~2L/min，恒溫30°C的條件下啟動(dòng)反應(yīng)器。
[0017]對(duì)于上述應(yīng)用的長(zhǎng)期效果，可以按以上步驟進(jìn)行:待反應(yīng)器運(yùn)行24h后，去除培養(yǎng)基，重新投加40(T500mL 9K培養(yǎng)基，以相同的條件繼續(xù)運(yùn)行反應(yīng)器。如此反復(fù)操作。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
(1)紗布為一種新型的固定化氧化亞鐵硫桿菌載體，采用吸附法成功固定化氧化亞鐵硫桿菌，該方法具有操作條件溫和，成本低，效果好，無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的實(shí)際工程應(yīng)用前景和商業(yè)前景；
(2)通過穩(wěn)定、連續(xù)的處理方式，固定化的氧化亞鐵硫桿菌成功應(yīng)用到生物氧化過程中，這種方式的優(yōu)勢(shì)在于，能夠保證氧化亞鐵硫桿菌足夠的數(shù)量和活性，解決了目前氧化亞鐵硫桿菌生物氧化速率低下的技術(shù)問題。[0019](3)在曝氣量lL/min、恒溫30°C下，反應(yīng)器中紗布固定化氧化亞鐵硫桿菌的平均亞鐵氧化速率和最快亞鐵氧化速率分別達(dá)到0.55 g/(L h)和0.92 g/(L h)。
[0020]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實(shí)施例1中反應(yīng)器的示意圖，其中I為生物反應(yīng)器，2為溶液儲(chǔ)罐，3為儲(chǔ)水池，4為空氣泵，5為恒溫水浴鍋，6為氣體流量計(jì)，7為閥門。
[0022]圖2為實(shí)施例1中投加不同載體的溶液中pH值與時(shí)間的變化曲線圖。
[0023]圖3為實(shí)施例1中投加不同載體的亞鐵離子濃度與時(shí)間的變化曲線圖。
[0024]圖4為實(shí)施例1中投加不同載體的總鐵濃度與時(shí)間的變化曲線圖。
[0025]圖5為實(shí)施例2中兩種不同脫水方式處理后溶液中亞鐵離子濃度的的變化曲線圖。
[0026]圖6表示實(shí)施例3中不同批次下反應(yīng)器內(nèi)溶液的亞鐵氧化率的對(duì)比圖。
[0027]圖7a~圖7c表示實(shí)施例3中固定化前的紗布載體的SEM圖，其中圖7a為100倍，圖7b為5000倍，圖7c為30000倍。
[0028]圖8a~圖8c表示實(shí)施例3中固定化后的紗布載體的SEM圖，其中圖8a為100倍，圖8b為5000倍，圖8c為30000倍。
[0029]圖9a~圖9c表示實(shí)施例3中一次生物氧化后的紗布載體的SEM圖，其中圖9a為100倍，圖9b為500 0倍，圖9c為30000倍。
[0030]圖1Oa~圖1Oc表示實(shí)施例3中十次生物氧化后的紗布載體的SEM圖，其中圖1Oa為100倍，圖1Ob為5000倍，圖1Oc為30000倍。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0032]實(shí)施例1
不同載體對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的影響:
將15g不同載體:紗布、活性炭、沸石分別投加到三個(gè)相同的反應(yīng)器(圖1)內(nèi)，反應(yīng)器內(nèi)已經(jīng)添加450mL 9K培養(yǎng)基同50mL活化好的氧化亞鐵硫桿菌Zl的菌液，在恒溫30°C和曝氣量lL/min的條件下啟動(dòng)反應(yīng)器，同時(shí)設(shè)置一組空白組(不添加載體，其他條件一致)，通過觀察反應(yīng)器內(nèi)溶液的顏色變化和測(cè)量溶液pH值、亞鐵離子同總鐵濃度、載體上的單位生物量等指標(biāo)來比較不同載體對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的影響。
[0033]結(jié)果如圖2、圖3、圖4和表1所示，從圖2、圖3和圖4中可以看出投加不同載體的溶液中PH值、亞鐵離子濃度和總鐵濃度的變化趨勢(shì)比較接近，圖2中pH值都是先經(jīng)歷一段緩慢上升的過程后快速的下降；圖3中亞鐵離子濃度在開始階段緩慢下降，24h后快速降低直至濃度接近于零；圖4中總鐵濃度變化趨勢(shì)同亞鐵離子濃度的相近，先經(jīng)歷一段緩慢下降后快速降低。具體比較不同載體的情況，以紗布作為載體的溶液亞鐵氧化速率最快，其亞鐵離子氧化率在48h時(shí)就接近達(dá)到100%。從表1中可以看出，在48h后沸石、活性炭、紗布三種載體都有很高的生物量，分別為6.0482 nmol P/g, 3.8753 nmol P/g和7.8063 nmolp/g,此外，只有紗布載體的溶液比較清澈。
[0034]本實(shí)例說明沸石、活性炭和紗布都能作為氧化亞鐵硫桿菌Zl的固定化載體，但是其中以紗布的效果最好，其在固定化菌種Zl的過程中達(dá)到最多的單位生物量和最快的亞鐵氧化速率。
[0035]表1實(shí)施例1中投加不同載體的溶液中顏色和單位生物量的情況
【權(quán)利要求】
1.一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體，其特征在于，所述載體為紗布，其經(jīng)線密度和緯線密度分別為11根/厘米和9根/厘米。
2.權(quán)利要求1所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將紗布剪成邊長(zhǎng)為0.9^1.1cm的碎片，用蒸餾水洗凈碎片后烘干備用； (2)將步驟(1)中所述紗布填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接紫外線滅菌； (3)向反應(yīng)器內(nèi)加入40(T500mL的9K培養(yǎng)基，并按9%~11%的接種量接入45~55mL的氧化亞鐵硫桿菌Zl菌液，所述9K培養(yǎng)基的配比為=(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.lg/L，K2HPO40.5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4.7H20 44.3g/L, pH 值為 2 ； (4)采用吸附法，將接種過的反應(yīng)器于30°C恒溫條件下進(jìn)行操作，同時(shí)對(duì)反應(yīng)器中的溶液進(jìn)行曝氣，曝氣量為0.5~2L/min，氧化亞鐵硫桿菌Zl大量生長(zhǎng)并吸附在紗布表面； (5)待反應(yīng)器成功運(yùn)行48h后，去除培養(yǎng)基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中的所述反應(yīng)器為自制的實(shí)驗(yàn)裝置系統(tǒng)，采用耐酸有機(jī)玻璃制成，反應(yīng)器呈圓柱體，直徑5cm，高30cm，有效體積500mL，設(shè)有曝氣裝置，底部設(shè)有排水口。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中的所述紗布投加質(zhì)量為l(T30g。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫`桿菌Zl由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC NO: M 2013102，保藏日期為2013年3月25日。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東云浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，接種菌液菌濃度為1.7 X IO7個(gè)/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特征在于，步驟(5)中的所述去除培養(yǎng)基的方式為重力脫水，即為打開反應(yīng)器排水口直至無水滴流出。
8.權(quán)利要求2所述固定化方法得到的固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體的應(yīng)用，其特征在于，所述固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體應(yīng)用于生物氧化，包括如下步驟:將步驟(5)所述的固定化氧化亞鐵硫桿菌的紗布繼續(xù)放入反應(yīng)器中，再加入40(T500mL的9K培養(yǎng)基，在曝氣量為0.5~2L/min，恒溫30°C的條件下啟動(dòng)反應(yīng)器，待反應(yīng)器運(yùn)行24h后，去除培養(yǎng)基，重新投加40(T500mL 9K培養(yǎng)基，以相同的條件繼續(xù)運(yùn)行反應(yīng)器，如此反復(fù)操作。
【文檔編號(hào)】C12N11/02GK103865915SQ201410061537
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】朱能武, 許治國(guó), 楊崇, 吳平霄 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)