氧化微桿菌Microbacterium oxydans YLX-2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種嗜硒微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一株氧化微桿菌Microbacterium oxydansYLX-2及其在微生物轉(zhuǎn)化合成有機(jī)硒、微生物合成納米硒、微生物活化硒礦石、富 硒微生物肥料制備及硒污染環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 極端微生物是指適合在極端環(huán)境中生活的微生物種屬，包括嗜熱菌、嗜鹽菌、嗜 堿菌、嗜酸菌、嗜壓菌、嗜冷菌以及抗輻射、耐干燥、抗高濃度金屬離子和極端厭氧的微生 物（Rothschild&Mancinelli，2001 ;陳駿等，2006)，目前極端微生物的研究主要在大洋中 脊、熱泉、鹽湖、礦坑排水等區(qū)域。在深海洋中脊的熱液環(huán)境中生活著大量嗜熱、嗜壓細(xì) 菌，其在洋中脊的Fe、S、Zn、Cu循環(huán)及成礦中扮演著重要的角色（Taylor&Wirsen, 1997 ; Labrenzetal.,2000 ；Kasama&Murakami,2001 ；Emerson&Mayer,2002；Kennedyet al.，2003;彭曉彤等，2007;陳順等，2010)。地質(zhì)微生物學(xué)家對美國黃石公園（Susanet al.，1994, 1996)、冰島（Marteinssonetal.，2001;Thomasetal.，2007)、意大利（Kvist etal.，2005)、中國云南（宋兆齊等，2008;黃秋媛等，2010)等地的眾多熱泉進(jìn)行研究， 揭示在這些高達(dá)70攝氏度以上，有些甚至超過100攝氏度的熱泉里面，活躍著大量嗜熱 微生物一一泉古菌，拓展了我們之前對微生物生存極限的想象。而美國猶他大鹽湖（鹽 度2. 2% )、死海（鹽度2. 5% )、里海（鹽度（1. 7% )等高鹽環(huán)境中生活著許多抗高滲透 壓微生物（Antonioetal.，1998;Vreelandetal.，1998 ;0renetal.，2001)。位于青 海省東北部的中國境內(nèi)最大的內(nèi)陸高原咸水湖泊，更由于其獨(dú)特的沉積環(huán)境，成為地質(zhì)微 生物學(xué)研究的天然實(shí)驗(yàn)室（妥進(jìn)才等，2005)。酸性礦坑排水中大量存在嗜酸鐵氧化菌， 如氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillusferrooxidans)，大量參與Fe、Mn、S等的循環(huán) (Baker&Banfield, 2003 ;Fortin&Langley, 2005 ;陸建軍等，2005 ;蔣嘉等，2006)，一方面造 成廣泛的生態(tài)問題，另一方面為礦坑排水的治理提供了新的思路（Johnson&Kevin, 2003)。 即使對于遙遠(yuǎn)南極的厚厚冰層下封存幾百萬年之久的冰下湖生命系統(tǒng)，我們依然保存著濃 厚的興趣（Bulatetal.，2009, 2011)。
[0003] 可是，很少有人關(guān)注富硒極端環(huán)境中的微生物組成。這主要是因?yàn)槲堑貧ぶ械?微量元素，難以成礦或形成極端富硒的環(huán)境，極大限制了對嗜硒微生物的研究。
[0004] 湖北恩施漁塘壩具有世界上唯一的硒礦床，是典型和獨(dú)特的極端富硒環(huán)境，在硒 礦區(qū)的滲濾水系統(tǒng)和硒礦尾礦的滲濾水系統(tǒng)中具有高濃度的硒含量，其中水體中的硒含量 高達(dá)40.0-94.1 1^/1，平均值為58.4±16.8 1^/1(21111&21161^，2001;211116七&1.，2008)，是 克山病區(qū)水體硒含量的330倍（Fordyceetal.，2000)，是世界衛(wèi)生組織（WHO)推薦飲用水 硒含量上限的10倍（Presser，1994);沉積物中的硒含量高達(dá)8. 28-82. 9mg/kgDW，平均值 為26.6±26.8mg/kgDW(Zhu&Zheng，2001;Zhuetal.，2008)，是美國西部沉積物硒含量上 限值（1. 4mg/kgDW)的19倍（Presser，1994)。目前，僅有朱建明小組對湖北恩施漁塘壩高 硒碳質(zhì)泥巖中的微生物多樣性特征進(jìn)行了初步研究（雷磊等，2009)，并分離了兩株具有亞 硒酸鹽還原能力的細(xì)菌（王明義等，2006)。在發(fā)明專利方面，僅有《一種利用微生物發(fā)酵生 產(chǎn)活化硒礦粉的方法》（ZL201210166664. 4)和《一種利用超耐硒微生物制備紅色單質(zhì)硒的 方法》（申請?zhí)?01210167650. 6)中利用湖北恩施硒礦物的硒礦渣、土壤進(jìn)行分離相關(guān)耐硒 微生物，進(jìn)而接種到硒礦粉或其他含硒介質(zhì)中，制備活化硒礦粉或紅色單質(zhì)硒。但發(fā)明專利 中并未分離純化相關(guān)耐硒微生物，也未鑒定微生物種屬和特征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種氧化微桿菌Microbacterium oxydans YLX-2及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供了一種氧化微桿菌Microbacterium oxydans YLX-2,該氧化微桿菌 是從中國湖北恩施硒礦區(qū)滲濾水系統(tǒng)的菌席沉積物中分離純化的、具有嗜硒微生物特征 的細(xì)菌新菌株，該氧化微桿菌的保藏名稱為氧化微桿菌YLX-2 (Microbacterium oxydans YLX-2)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)， 保藏日期為2013年12月18日，保藏編號為CCTCCN0:M2013672。
[0008] 該氧化微桿菌的菌種菌學(xué)特征描述如下：
[0009] 【形態(tài)特征】該氧化微桿菌在28攝氏度的TSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時觀察到的菌落 為紅色平滑的圓形，并具有全緣凸面（附圖1);對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯示為革蘭氏陽性 菌。該氧化微桿菌的菌株為短桿狀，大小為0.4~0.5X1.0~2.Oym(附圖2);;
[0010] 【嗜硒特征】將該氧化微桿菌依次分別接入到含硒（以亞硒酸鈉配置）0、3、5、10、 100、300、500、1000、5000mg/L的TSB培養(yǎng)液中，結(jié)果顯示：在硒濃度彡5mg/L情況下，細(xì)菌 生長不受抑制，培養(yǎng)液顏色不呈現(xiàn)明顯的紅色。在硒濃度多l(xiāng)〇mg/L情況下，培養(yǎng)液顏色開 始呈現(xiàn)明顯的紅色，在300mg/L條件下，培養(yǎng)液中的紅色依然明顯，表明該菌種代謝正常。 必須指出的是即使在硒含量高達(dá)l〇〇〇mg/L的極端條件下，菌種依然能生長，體現(xiàn)出了極端 耐硒能力，但是培養(yǎng)液紅色已經(jīng)明顯減弱。超過l〇〇〇mg/L濃度下，該菌種不能生長。
[0011] 【16SrRNA基因序列分析】從本發(fā)明所述菌株的純培養(yǎng)物中提取基因組DNA，利用 通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，進(jìn)一步通過CLUSTALX軟件和Mega4. 0軟 件以Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示菌 株屬于微桿菌屬（Microbacterium)，與氧化微桿菌（Microbacteriumoxydans)和黃桿菌 (Microbacteriummaritypicum)相似度達(dá)到100%，尚不能確定其確卻種屬。
[0012]【生理生化反應(yīng)特征】對甘油等49種碳源進(jìn)行產(chǎn)酸反應(yīng)檢測，結(jié)果顯示該菌株可 以很好地利用葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、熊果苷、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、蔗 糖、松叁糖、攏牛兒糖作為碳源產(chǎn)酸，但是利用甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、海藻糖作為碳 源產(chǎn)酸反應(yīng)較弱（表1)。該菌株運(yùn)動型及酶活檢測顯示，菌株的運(yùn)動型很好，菌株的堿性 磷酸鹽酶、酯酶（C4)、類脂酯酶（Cs)、白（亮）氨酸芳氨酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘 酚-AS-BI-磷酸水解酶、0 -半乳酸苷酶、0 -糖醛酸苷酶、a-葡萄糖苷酶、0 _葡萄糖苷 酶、a-甘露糖苷酶均具有較強(qiáng)的活性（表2)。菌株的碳源利用反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，該菌 株可以利用鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、蔗糖、麥芽糖、5-酮基-葡萄糖酸鹽、甘露醇、D-葡萄 糖、水楊素、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、丙酸鹽、2-酮葡萄糖酸鹽作為碳源（表3)。
[0013] 綜合以上數(shù)據(jù)，判定該菌株為氧化微桿菌（Microbacteriumoxydans)，命名為氧 化微桿菌YLX_2(MicrobacteriumoxydansYLX-2)，于2013年12月18日保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCN〇:M2013672。
[0014] 表1菌株利用碳源產(chǎn)酸反應(yīng)
[0015]

[0016] 注：" + "表示陽性，"一 "表示陰性，"v"表示弱陽性。
[0017] 表2菌株運(yùn)動型及酶活性檢測
[0018]

[0019] 注：" + "表示陽性，" "表示陰性。
[0020] 表3菌株碳源利用反應(yīng)檢測
[0021]
[0022] 注：" "表示陽性，" "表示陰性。
[0023] 本發(fā)明還