專利名稱：氧化微桿菌及其制備手性雙三氟甲基苯乙醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物催化技術領域，涉及一種氧化微桿菌以及利用該菌制備光學純(R) -1-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol 的方法。
背景技術：
光學活性(R)-l-[3, 5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (中文名稱為(R)-1-3，5-雙三氟甲基苯乙醇，CAS號為127852-28-2，以下簡寫為P)是Merck公司研發(fā)生產(chǎn)的手性藥物Aprepitant (阿瑞批坦，商品名Emend)、fosapr印itant dimeglumine的關鍵手性中間體，其中fosapr印itantdimeglumine是Apr印itant的注射劑形式。手性藥物Aprepitant屬于人P物質/神經(jīng)激肽1 (NK-I)選擇性高親和性受體阻斷劑，具有全新的藥理作用機制，主要通過阻斷大腦惡心和嘔吐信號的新穎機理發(fā)揮作用，用于預防放化療引起的急性或延遲性嘔吐等具有很好的療效。分子結構式如下圖所示
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F
(R)-1 -(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)ethanolAprepitant手性藥物中間體P可通過生物催化法和化學合成法制備。目前已經(jīng)發(fā)展了多種化學合成方法(如 Noyori R et al. ACC. Chem. Res. , 1997, 30,97-102 ；Hansen etal. Tetrahedron =Asymmetry, 2003，14，3581-3587)，但是這些方法往往存在一些不足，如對映體過量值不高，合成過程需要重金屬催化劑和許多有毒、腐蝕性試劑，或者產(chǎn)率低分離提純困難，因此較難應用到工業(yè)原料藥生產(chǎn)中。化學合成方法中，Merck公司開發(fā)的以(S，R)-l-amino-2-indanol手性配體與[Ru (p-cymene) C12] 2作用生成上述手性中間體的工藝具有很高的產(chǎn)率和ee值，已被Merck公司申請專利而受到保護，從而壟斷了該領域的醫(yī)藥市場。生物催化具有高選擇性、反應條件溫和、對環(huán)境友好等優(yōu)勢，作為化學催化過程的重要補充受到廣泛關注。發(fā)展高效的生物催化方法生產(chǎn)上述中間體也是避開專利保護的重要途徑之一。該中間體可通過消旋體醇或酯的動力學拆分和潛手性酮的不對稱還原獲得。其中，消旋體醇或酯的動力學拆分是利用酯酶或脂肪酶對外消旋仲醇進行對映選擇性酯化或轉酯化拆分，或者對外消旋酯進行對映選擇性水解拆分(如Vankawala P J，etal. Synthetic Commun.，2007，37，3439_；3446)，這種方法的主要優(yōu)點在于商品化的脂肪酶種類多，酶源廣，容易篩選。但該方法目標對映體產(chǎn)物的最高收率不超過50%，而且需事先合成外消旋的底物醇和酯，對于工業(yè)化生產(chǎn)而言，既增加了操作步驟，也提高了生產(chǎn)成本。近年來，研究者開始篩選商品化的氧化還原酶或者表達這類酶的微生物全細胞催化 3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物 S)還原成(R)-I-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (產(chǎn)物P)。但由于絕大部分微生物所產(chǎn)生的氧化還原酶都遵守I^relog規(guī)則、催化酮生成(S)-構型醇，而遵守anti-Prelog規(guī)則生成相應的㈨-構型醇的較少，因此目前該生物催化過程相關報道也較少。該生物催化過程中，商品化純酶具有高活力，高對映體選擇性(> 99% ee)，反應體系較為簡單，副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易分離純化，已可以實現(xiàn)輔酶原位再生等優(yōu)點(Pollard D，et al. Tetrahedron =Asymmetry,2006,17，5M-559)，但酶的穩(wěn)定性和使用壽命有限，商品化酶本身價格昂貴，還需要添加較為昂貴的輔酶循環(huán)底物(NAD+或NADP+)，從而導致最終產(chǎn)品價格較高，后續(xù)工藝改造空間也較小。同時購買商品化酶用于商業(yè)化生產(chǎn)還涉及知識產(chǎn)權問題，對于想研發(fā)自主知識產(chǎn)權的新工藝必將會有局限。與之不同，全細胞催化具有酶穩(wěn)定性較高、操作簡單、成本低廉，并且能夠利用自身的輔酶和輔酶再生體系催化反應等優(yōu)點，使之易于規(guī)?；凸I(yè)化。然而，目前利用全細胞生物催化獲得該手性醇存在一些問題如生產(chǎn)能力較低，且微生物體內(nèi)往往含有多種酮還原酶，導致最終酶選擇性較低、副產(chǎn)物較多(Homarm篩選的4株產(chǎn)物R-型微生物，ee 值最高 92%。Homann M J, et al. Tetrahedron，2004，60，789-797)。Gelo-Pujic等(Gelo-Pujic M, et al. Tetrahedron :Asymmetry,2006，17,2000-2005)通過篩選乙醇脫氫酶轉化底物S，得到來源于Lactobacillus kefir的乙醇脫氫酶可以得到P (ee > 99% )，但需要添加NAD (P)H用于輔酶循環(huán)且產(chǎn)率僅有15%。以該菌原始菌株作全細胞生物轉化，底物濃度為4. 8g/L時，16h也僅能轉化 31%。Kurbanoglu 等(Kurbanoglu et al. Tetrahedron =Asymmetry, 2009, 20,2759-2763)報道了以Penicilliumexpansum全細胞轉化底物S，經(jīng)5 轉化終產(chǎn)物濃度也僅有3. 35g/L，轉化率僅為76%，離實際應用還有很大的距離。因此，篩選新型高效微生物酶源是發(fā)展底物S轉化生成產(chǎn)物P的生物催化過程的重要突破口之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新篩選的氧化微桿菌，該菌株是從果園土壤中富集、分離并經(jīng)過多輪篩選后獲得的，于2010年7月16日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCM 2010179，并利用該菌具有生產(chǎn)高活力、對映選擇性強的羰基還原酶特性，還原底物 3，5-bis-trifluoromethyl acetophenone (底物 S)制備光學純(R)_l_[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (產(chǎn)物P)，從而以生物催化的方法制備高光學純度的手性藥物阿瑞吡坦的中間體P。本發(fā)明所采取的技術方案氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans C3, CCTCC M 2010179)。篩選方法于果園采集土樣，以苯乙酮為唯一碳源并添加無機鹽經(jīng)2輪富集樣品，涂布于平板上，經(jīng)分離單菌落初步篩選產(chǎn)羰基還原酶菌株；再將這些菌株轉接于含有營養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基的M孔板中，培養(yǎng)Mh，而后加入底物S進行生物轉化，轉化3 后，測定產(chǎn)物生成情況和產(chǎn)物對映體過量值，篩選得到可轉化底物S生成目的產(chǎn)物P的菌株；并將產(chǎn)物對映體過量值高的菌株進行進一步的鑒定和轉化條件優(yōu)化。經(jīng)篩選得到本發(fā)明涉及的氧化微桿菌C3。具體方案見實施例1和2。采用上述氧化微桿菌作催化劑制備光學純P的方法包括下列步驟
1、菌株培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，牛肉膏1. 5g/L，酵母粉4g/L，NaCl1. 2g/L, K2HPO4O. 6g/L, KH2PO4O. 4g/L, MgSO4O. 6g/L。培養(yǎng)方法挑取少許斜面種子接種于上述組分培養(yǎng)基中，30°C，200 250rpm培養(yǎng)16 Mh，制備種子液。將此種子液以0. 5% 2%的接種量轉接至上述相同組分培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件27 33°C，200 ^Orpm，24 48h。2、生長細胞轉化經(jīng)上述培養(yǎng)過程，可以獲得的菌體濃度以濕重計為5 7g/L。在上述菌體培養(yǎng)體系中加入底物S，并加入輔酶循環(huán)底物。本發(fā)明的輔酶底物為體積百分比濃度為4% 20%的異丙醇和質量分數(shù)為2% 6%的葡萄糖。繼續(xù)培養(yǎng)菌體并同時進行生物轉化，時間M 88h。培養(yǎng)條件27 33°C，200 ^Orpm，培養(yǎng)的溫度、轉速可以與第1步的菌體生長階段相同，也可以不同。底物S直接加入轉化體系中或者先以助溶劑溶解后，配成質量濃度為30 % 60 %的母液后再加入到反應體系，助溶劑為二甲亞砜或者二甲基甲酰胺或者異丙醇中的一種或一種以上的混合物。加入到轉化體系中的底物終濃度為1 30g/L。3、休止細胞轉化將第1步培養(yǎng)的菌體以10，OOOrpm離心收集，用pH值為6 8、0. IM濃度的磷酸鉀緩沖溶液或者磷酸鈉緩沖液或者Tris-HCl緩沖液洗滌2次，而后以上述緩沖液配制成以菌體濕重計為50 300g/L濃度的菌懸液，加入底物和輔酶循環(huán)底物(方法同第2步)。加入到轉化體系中的底物終濃度為1 30g/L，轉化溫度為20 40°C，轉速為200 280rpm，轉化時間為5 48h。4、產(chǎn)物萃取和測定向第2和第3步的轉化結束體系中加入1 3倍體積的乙酸乙酯萃取，用普通氣相色譜柱(SGE，澳大利亞，AC-5,30mX0. 22)測定轉化率，手性氣相柱(CHIRASIL-DEX CB,瓦里安，25mX0. 25)測定產(chǎn)物對映體過量值。本發(fā)明采用篩選的氧化微桿菌作為催化劑對底物S進行對映選擇性不對稱還原反應制備得到高光學純度的手性藥物阿瑞吡坦的中間體P，此方法為該手性中間體生物催化合成提供了新的可供選擇的路徑。同時，該生物催化過程利用微生物全細胞自身的酶系，添加廉價的輔酶循環(huán)底物即可實現(xiàn)輔酶循環(huán)。該生物催化劑易于制備，反應條件溫和，副產(chǎn)物少，成本低，且可獲得的產(chǎn)物濃度較高，易于提取分離，具有潛在的工業(yè)應用開發(fā)價值。
具體實施例方式實施例1菌株篩選產(chǎn)羰基還原酶菌株篩選于果園采集土壤樣品，富集于含有苯乙酮(濃度為ImM)的MSM培養(yǎng)基中，30°C，220rpm培養(yǎng)7天。從富集液中取出加入到含有苯乙酮(濃度為ImM)的MSM培養(yǎng)基中進行再次富集，30°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)7天。MSM培養(yǎng)基配方為Na2HP042g/L，KH2P041g/L，NH4C1 0. 4g/L，MgC120. 4g/L。將第二次富集培養(yǎng)液稀釋至合適濃度，并涂布至篩選平板上(MSM+苯乙酮ImM+酵母粉0. lg/L+瓊脂粉15g/L)，30°C培養(yǎng)1 3天，每支平板上可見許多微生物單菌落，這些菌株可能為產(chǎn)羰基還原酶菌株。進一步進行底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物幻生物催化篩選，以期獲得高對映選擇性轉化該底物的微生物菌株。以底物S進行生物催化篩選將富集平板中的單菌落用無菌牙簽逐一接入M孔篩選板各孔(Costar，美國)進行培養(yǎng)(每孔裝有培養(yǎng)基lml)，3(TC，240rpm培養(yǎng)Mh。培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉1.5g/L，NaCl 5g/L。6000rpm離心收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(pH 7.0,0. 1M)洗滌2次，再加入Iml緩沖液重懸菌體，而后加入底物5mg，3(TC，270rpm進行生物催化篩選試驗。轉化3 后，以200 μ 1乙酸乙酯萃取。以氣相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安，25mX 0. 25)分析產(chǎn)物的對映體過量值，得到產(chǎn)00-仲醇菌株8株。其中1株為本發(fā)明涉及的氧化微桿菌菌株C3，產(chǎn)物對映體過量值大于99%。實施例2篩選菌株的鑒定為確定該菌株分類地位并詳細了解其性能，對該菌株進行了初步鑒定。該菌株具有以下特征菌落淺黃色或黃色菌落，表面光滑，邊緣整齊，不透明。生理生化特征革蘭氏陽性細菌，桿狀，好氧，產(chǎn)羰基還原酶。16S rRNA鑒定基因組DNA為模板，以細菌通用引物27f和1492r擴增16S rRNA序列。其序列如下(1486bp)AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAACACGGAGCTTGCTCTGTGGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATATGCGACGTGATCGCATGGTCTGCGTCTGGAAAGAATTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGGCATGCGGATTAATTCGATGTAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGTAATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCC經(jīng)NCBI的blast比對，該菌與氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)同源性為99%。結合菌落和生理生化特征，初步可確定為氧化微桿菌，實驗室自編號為Microbacterium oxydansC3。2010年7月16日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2010179。實施例3 5CCTCC M 2010179生長細胞轉化底物S生成產(chǎn)物P。實施例3培養(yǎng)基配方和種子液制備方法如前所述。將種子液以的接種量轉接至50ml培養(yǎng)基中O50ml培養(yǎng)搖瓶裝液50ml)。培養(yǎng)條件30°C，240rpm，Mh。此時菌體濃度以濕菌體計約為5 7g/L(每批次培養(yǎng)菌生長狀況會略有差異)。加入底物S (底物S溶解于DMS0，預先配置成50%的母液)至培養(yǎng)體系中，終濃度為lg/L，并加入異丙醇2. 5ml (5% )和葡萄糖IgO ，再次置于搖床上轉化(30°C，220rpm)48h。以IOOml乙酸乙酯萃取，取有機相氣相色譜(SGE，澳大利亞，AC_5，30mX 0. 22)測定轉化率為94%，氣相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安25mX0. 25)測定產(chǎn)物ee值大于 99%。
權利要求
1.氧化微桿菌Microbacterium oxydans C3，保藏號為 CCTCC M 2010179。
2.以權利要求1所述氧化微桿菌制備光學純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征在于27 33 °C培養(yǎng)氧化微桿菌C3M 48h，加入底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone進行生長細胞轉化；或者收集該培養(yǎng)菌，重懸于緩沖液中，再加入底物進行休止細胞轉化，生成目的產(chǎn)物光學純(R)-l_[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。
3.權利要求2所述的氧化微桿菌制備光學純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol 白勺方法，其特征是所述底物 3，5_bis_trifluoromethyl acetophenone ^t反應體系中的終濃度為1 30g/L，底物直接加入轉化體系中，或者先以助溶劑溶解后，配成質量濃度為30 % 60 %的母液后再加入到反應體系，助溶劑為二甲亞砜或/和二甲基甲酰胺或/和異丙醇。
4.權利要求2所述的氧化微桿菌制備光學純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法，其特征是生長細胞轉化時細胞濃度以菌體濕重計是5 7g/L，轉化溫度為27 33°C，轉速200 ^Orpm，轉化時間為M 88h。
5.權利要求2所述的氧化微桿菌制備光學純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是休止細胞轉化時細胞濃度以菌體濕重計是50 300g/L,轉化溫度為20 40°C，轉速200 280rpm，轉化時間為5 48h，緩沖液為pH值為6 8且濃度為0. IM的磷酸鉀緩沖溶液或者磷酸鈉緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。
6.權利要求2 5所述的氧化微桿菌制備光學純(R)-I-[3，5-bis(trif luoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是轉化體系中加入體積百分比濃度為4% 20%的異丙醇和質量分數(shù)為2% 6%的葡萄糖以提高反應效率。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物催化技術領域，涉及一種氧化微桿菌以及利用該菌制備光學純(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法。本發(fā)明氧化微桿菌MicrobacteriumoxydansC3，保藏號為CCTCC M2010179。本發(fā)明氧化微桿菌在27~33°C培養(yǎng)24~48h，加入底物3,5-bis-trifluoromethylacetophenone進行生長細胞轉化；或者收集該培養(yǎng)菌，重懸于緩沖液中，再加入底物進行休止細胞轉化，生成目的產(chǎn)物光學純(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。本發(fā)明易于工業(yè)化，其催化劑易于制備、反應條件溫和、轉化效率高。
文檔編號C12P41/00GK102382780SQ201010271579
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權日2010年9月3日
發(fā)明者劉艷, 吳中柳, 張超, 湯傳根, 田小亮, 裴小瓊 申請人:中國科學院成都生物研究所