專利名稱：一種濕地嗜油產堿桿菌的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種濕地嗜油產堿桿菌的基因及其應用。
背景技術：
在油污染環(huán)境中存在著一定數量的微生物，這些微生物對受油污染環(huán)境有較好的 適應能力。初篩選出的嗜油微生物經過馴化后，即可作為嗜油微生物菌株應用到油污染廢 水與污泥的處理實踐中。黃浦江作為上海市水上運輸的主干道，過往船只突發(fā)性污染泄漏 事故的風險較高，溢油事件時有發(fā)生，使黃浦江-長江口附近濕地生態(tài)系統(tǒng)受到了 一定程 度的污染。濕地的微生物修復技術相比于土壤的微生物修復技術起步較晚，許多修復措施 主要是借鑒土壤微生物修復措施。而濕地環(huán)境與土壤環(huán)境的風化過程、溫度、可利用的氧濃 度、可利用的營養(yǎng)基質濃度、PH以及鹽度等環(huán)境因素的特點有所不同，因此探索適合于濕地 環(huán)境的微生物修復技術就變得非常重要。從黃浦江-長江口岸邊濕地油污土壤中篩選出嗜 油微生物，結合這些微生物的最宜生長條件與特性，將其應用于柴油的降解并研究其降解 特性。微生物的分類方法常用的有經典分類方法和分子生物學方法。經典分類方法主要 指依據形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征等分類方法。分子生物學分類法，又稱分子分類 方法，是指在分子水平上對生物個體的核酸及蛋白質進行研究，并據此對生物個體進行分 類的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分類方法采用。目前，16S rDNA序列分析的方法主要有兩種一種是16S rDNA提純后用反轉錄酶 和保守引物進行測序，另一種是擴增16S rDNA基因對應的DNA序列，然后將PCR產物回收 后直接測序。更進一步的可靠方法是擴增16S rDNA基因對應的DNA序列，將該序列做成感 受態(tài)細胞，質粒擴增，然后對質粒進行測序。這是一種研究rDNA同源性最直接可靠的方法。目前已發(fā)現自然界中能夠降解石油污染物的微生物有100多個屬，200多 個種，分別屬于細菌、真菌和藻類等。其中降解石油污染物的細菌主要包括假單胞菌 屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Archrobacter)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、棒狀桿菌 屬(Coryneforms)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)無色桿菌屬 (Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)微球菌屬(Micrococcus)、微桿菌屬 (Microbacterium)諾卡氏菌屬(Nocardia)和分支桿菌屬(Mycobacterium)。常見的石油 降解真菌主要有木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicilium)、曲霉屬(Aspergillus)、毛 霉屬(Mucor)和鐮刀霉屬(Fusarium)中的一些菌株。細菌和真菌是土壤石油生物降解 的最基本的作用者。能夠降解石油烴類物質的酵母主要有假絲酵母屬(Candida)、紅酵母 屬(Iihodotorula)、球擬酵母屬(Torulopsis)、酵母菌屬(Saccharomyces)和擲孢酵母屬 (Sporobolomyces)等中的菌株，以假絲酵母最為廣泛。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種濕地嗜油產堿桿菌的基因。
本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因在降解廢水、污泥中的油污中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種濕地嗜油產堿桿菌的基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列；2)與SEQ ID NO 1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同生物學 功能蛋白質的DNA序列。一種上述的濕地嗜油產堿桿菌的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨 基酸序列之一1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過將SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而產生的衍生蛋白質的氨基酸序列，該衍生蛋白質與SEQ ID NO :2的蛋白具有相 同的生物學功能。一種重組載體，其特征在于該重組載體含有上述的濕地嗜油產堿桿菌的基因。一種宿主細胞，其特征在于該宿主細胞含有上述的重組載體。上述的一種濕地嗜油產堿桿菌的基因在降解廢水、污泥中的油污中的應用。一種克隆上述的濕地嗜油產堿桿菌的基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟 為i.從油污濕地篩選的濕地產堿桿菌菌株的菌落中提取該細菌的核16S rDNA基 因；ii.對上述提取的16S rDNA基因進行PCR擴增，采用了如下的擴增條件和擴增的 引物PCR 擴增條件為98°C預變性 5min，95°C變性 35s，55°C退火 35s，72°C延伸 Imin 30s, 35 個循環(huán)，72°C延伸 8min ；PCR擴增的引物是Pl 正向引物為5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，；P2 反向引物為5，GGTTACCTTGTTACGACTT ；PCR產物的回收；iii.采用SK2211-T-載體PCR產物克隆目的片斷TA克隆。iv.連接產物轉化；v.藍白斑篩選；vi.質粒提取，最終得到濕地嗜油產堿桿菌的基因全序列。本發(fā)明的濕地嗜油產堿桿菌的基因的序列全長為1178個核苷酸。采用BLAST分析法，將嗜油產堿桿菌M4的16S rDNA全序列與GenBank數據庫比 較，該菌株與產堿桿菌有很高的同源性。將其應用于柴油污水的處理中，考察其對油污的降 解率特征。油污降解率計算公式如下菌株對油污降解率=(空白含油率-接菌含油率)/空白含油率X 100%菌株一周內對柴油的去除率為56. 38%，降解率為15. 21%。經氣相色譜測定各組 分特征，可見其對于Cw C24范圍內的正構烷烴均具有較好的降解效果。本發(fā)明的濕地嗜油產堿桿菌的基因對柴油污染具有較好的降解效果。


圖1本發(fā)明嗜油產堿桿菌(alCaligeneS)M4的生長曲線圖2本發(fā)明嗜油產堿桿菌(alCaligeneS)M4的適宜生長溫度圖3本發(fā)明嗜油產堿桿菌(alcaligenes)菌M4的適宜生長pH值圖4本發(fā)明嗜油產堿桿菌(alcaligenes)M4的適宜生長鹽度圖5本發(fā)明嗜油產堿桿菌(alcaligenes)M4降解柴油各組分特征
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。一、嗜油菌的基因全序列測定采用BLAST分析法，將該嗜油菌的16S rDNA全序列與GenBank數據庫比較，該菌 株與假單胞菌有很高的同源性。由此可以從分子水平確定該菌株是假單胞菌。同明，結合 經典分類方法所獲得的形態(tài)及生理生化特征，最終確定該菌株是產堿桿菌(alcaligenes)。 本發(fā)明從油污濕地篩選的濕地產堿桿菌菌株的菌落中提取該細菌的核16S rDNA基因、16S rDNA基因PCR擴增、PCR產物的回收，將DNA片斷進行TA克隆，制備感受態(tài)細胞，提取質粒 進行16S rDNA的全序列測定和分析，來獲取菌株的16S rDNA基因全序列。本發(fā)明提供的 嗜油產堿桿菌(alcaligenes)M4的16S rDNA全序列。上述步驟具體如下1)基因組提取采用生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，從油污 濕地篩選的濕地產堿桿菌菌株的菌落中提取該細菌的核16S rDNA基因。2)在16S rDNA基因的PCR擴增過程中，采用了如下的擴增條件和擴增的引物PCR 擴增條件為98°C預變性 5min，95°C變性 35s，55°C退火 35s，72°C延伸 Imin 30s, 35 個循環(huán)，72°C延伸 8min ；PCR擴增的引物是:P1正向引物為5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，20bp, P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3， 19bp ；
3) PCR產物的回收采用SK1131-UNIQ-10DNA膠回收試劑盒純化回收DNA片斷；
4)采用SK2211-T-載體PCR產物克隆試劑盒目的片斷TA克隆。
①連接反應
1 μ 110 X Ligation Buffer
1 μ 150% PEG
50ngpUCm-T Vector
0. 2pmolPCR Product
χ μ 1H2O
2. 5UT4 DNA Ligase
Final Volume10 μ 1
注意一般最后加入jM DNA Ligase, 16 23°C連接1 2小時。
②連接產物轉化
使用生工SSCS快速一步法試劑制備感受態(tài)細胞，產品編號SK2301。轉化步驟如 下將100 μ 1感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮；加入10 μ 1連接 液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘；42 °C水浴熱激90秒。冰上放置15 20分鐘；加400 μ 1 SOC培養(yǎng)基，370C 200 250rpm振蕩培養(yǎng)1小時；室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉 400 μ 1上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸??；將細菌涂布在預先用20 μ 1 IOOmM IPTG和 100 μ 1 20mg/mlX-gal涂布的氨芐青霉素平板上；平板在37°C下正向放置1小時以吸收過 多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。③藍白斑篩選當外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了 LacZ基 因的編碼，從而影響了其產物β -半乳糖苷酶α -片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG 平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色，選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用 牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過夜。5)質粒提取使用生工質粒提取試劑盒SK1191的UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒提取 DNA(附件5)。6)在Applied Biosystem 3730測序儀上測序，然后用BLAST軟件，將測得的 16S rDNA全序列與(ienBank數據庫比較分析，最終確定其為假單胞菌的基因全序列。二、嗜油菌株篩選方法及其應用(一 )材料與方法1、菌源和菌采集環(huán)境(1)菌源黃浦江-長江口濕地(Ν3Γ 23，5.4”Ε12Γ 30，28.3")受石油類污 染沉積物；(2)沉積物基本理化性質見表1所列。表1黃浦江-長江口濕地沉積物性質分析
權利要求
1.一種濕地嗜油產堿桿菌的基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQID NO 1所示的堿基序列；2)與SEQID NO :1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同生物學功能 蛋白質的DNA序列。
2.一種根據權利要求1所述的濕地嗜油產堿桿菌的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋 白具有下列氨基酸序列之一1)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過將SEQID NO :2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而產生的衍生蛋白質的氨基酸序列，該衍生蛋白質與SEQ ID NO :2的蛋白具有相同的 生物學功能。
3.—種重組載體，其特征在于該重組載體含有權利要求1所述的濕地嗜油產堿桿菌的基因。
4.一種宿主細胞，其特征在于該宿主細胞含有權利要求3所述的重組載體。
5.權利要求1所述的一種濕地嗜油產堿桿菌的基因在降解廢水、污泥中的油污中的應用。
6.一種克隆根據權利要求1所述的一種濕地產堿桿菌的基因的方法，其特征在于該方 法的具體步驟為a.從油污濕地篩選的濕地產堿桿菌菌株的菌落中提取該細菌的核16SrDNA基因；b.對上述提取的16SrDNA基因進行PCR擴增，采用了如下的擴增條件和擴增的引物 PCR擴增條件為98°C預變性5min，95°C變性35s，55°C退火35s，72°C延伸Imin 30s，35個循環(huán)，72 °C延伸8min ； PCR擴增的引物是Pl 正向引物為5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，； P2 反向引物為5，GGTTACCTTGTTACGACTT ；c.PCR產物的回收；d.采用SK2211-T-載體PCR產物克隆目的片斷TA克隆。e.連接產物轉化；f.藍白斑篩選；g.質粒提取，最終得到濕地產堿桿菌的基因全序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種濕地嗜油產堿桿菌的基因及其應用。本發(fā)明分離、篩選出的嗜油菌的基因表明其為產堿桿菌，具有較好降解高濃度柴油污水的功能。這就拓寬了人們對產堿桿菌屬在其功能方面應用研究思路，并為降解高濃度柴油污水提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。可再進一步研究其應用于石油類污染的處理中。
文檔編號C07K14/225GK102086456SQ20101028957
公開日2011年6月8日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權日2010年9月21日
發(fā)明者劉曉艷, 張新穎, 徐子倩, 曹正楠, 王君, 王珍珍, 蔡倩, 趙月, 鐘成林 申請人:上海大學