專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)維生素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)維生素B12的方法。維生素B12已廣泛用作藥劑來(lái)治療惡性貧血、神經(jīng)疾病、甲基丙二酸尿等以及用作家禽和/或家畜的飼料添加劑。
由于維生素B12的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以通過(guò)化學(xué)合成法來(lái)進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)是很困難的。微生物發(fā)酵法已經(jīng)用于其生產(chǎn)中。
據(jù)報(bào)道，維生素B12通過(guò)屬于下列各屬的微生物來(lái)生產(chǎn)，所述的微生物屬是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、小單孢菌屬、氣桿菌屬、土壤桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、固氮菌屬、桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏桿菌屬、黃桿菌屬、分枝桿菌屬、假單孢菌屬、丙酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、鏈球菌屬、黃單孢菌屬、精蛋白桿菌屬、甲烷桿菌屬(E.J.Vandamme，Biotechnology of Vitamins，Pigments and Growth Factors，Elsevier Science Publisher LTD，1989，261-263)、節(jié)細(xì)菌屬(JP-A 52-94498)、克雷伯氏菌屬(JP-A 50-132186)、紅極毛桿菌屬(JP-A 60-16597)、丁酸桿菌屬(JP-A 62-44197)、假諾卡氏菌屬(JP-A 55-96091)、Methanosarcina(JP-A 1-257490)、真細(xì)菌(JP-A 62-44172)、醋桿菌屬(JP-A62-122593)等。此外，據(jù)報(bào)道，維生素B12由屬于下列各屬的微生物累積，所述微生物屬是苜蓿根瘤細(xì)菌、菜豆根瘤細(xì)菌、大豆根瘤細(xì)菌、三葉草根瘤細(xì)菌和豌豆根瘤細(xì)菌(Plant Physiology，38，99-104(1963))。
上述屬于根瘤菌屬的微生物中，菜豆根瘤細(xì)菌和三葉草根瘤細(xì)菌已被重新命名為豌豆根瘤細(xì)菌(參見(jiàn)Institute for Fermentation Osaka，Japan，List of Cultures 1992Microorganisms，9th edition，p.169)。大豆根瘤細(xì)菌中的一部分已被重新命名為豌豆根瘤細(xì)菌，而其余部分已被重新分類(lèi)到Bradyrhizobium japonicum中(參見(jiàn)Iustitute for Fermentation，Osaka，Japan，List of Cultures 1992 Micro-organisms，9th edition，P.169)。
然而，通常，微生物方法生產(chǎn)維生素B12的產(chǎn)率很低。此外，一些微生物可利用的碳源有限(同化甲醇的細(xì)菌等)，需要特殊的培養(yǎng)條件如無(wú)氧條件(丙酸桿菌、屬于醋桿菌屬的微生物、產(chǎn)甲烷細(xì)菌等)，由于其生長(zhǎng)速度低而需要長(zhǎng)期培養(yǎng)(產(chǎn)甲烷細(xì)菌、丙酸桿菌等)，因此，只可在有限的條件下用于工業(yè)生產(chǎn)。這樣，就需要改進(jìn)的生產(chǎn)維生素B12的工業(yè)方法。
本發(fā)明的主要目的是提供工業(yè)上可用的、經(jīng)濟(jì)的和有效的生產(chǎn)維生素B12的方法。
本發(fā)明的該目的以及其它目的和優(yōu)點(diǎn)從下面的描述對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。
為了發(fā)展用已經(jīng)普遍并廣泛地用于發(fā)酵方法中的葡萄糖、蔗糖等作為碳源并用普遍并廣泛地使用的發(fā)酵條件即通氣和攪拌培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)維生素B12的有效發(fā)酵方法，本發(fā)明人已從日本兵庫(kù)縣的土壤中分離出一種新的具有高維生素B12生產(chǎn)能力的菌株產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌(Rhizobium cobalaminogenum)27B74。進(jìn)一步研究后，基于這樣獲得的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)維生素B12的方法，其中包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生維生素B12的屬于產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌的微生物來(lái)產(chǎn)生維生素B12，并回收所產(chǎn)生的維生素B12。
本發(fā)明還提供了能產(chǎn)生維生素B12的屬于產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌的微生物。
本發(fā)明還提供了微生物產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74(FERM BP-4429)。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“維生素B12”包括所有類(lèi)型的維生素B12如輔酶型維生素B12(腺苷鈷胺、甲基鈷胺(甲基型鈷胺))、氰基型維生素B12(氰鈷胺)和羥基型維生素B12(羥鈷胺)。
從土壤中分離的、具有優(yōu)良的產(chǎn)生維生素B12的能力的產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74(IFO 15543，F(xiàn)ERM BP-4429)的形態(tài)特征、在各種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)以及生理特征如下。
(A)形態(tài)特征(在肉湯瓊脂培養(yǎng)基中于28℃生長(zhǎng)24小時(shí)的情況下)1.細(xì)胞形狀桿狀2.細(xì)胞大小0.5-0.8μm×1-2.8μm3.孢子無(wú)4.游動(dòng)性可觀察到(在肉湯液體培養(yǎng)基中于28℃生長(zhǎng)16小時(shí)后觀察)5.革蘭氏染色陰性6.抗酸性無(wú)(B)在各種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)1.肉湯瓊脂平皿培養(yǎng)基(在28℃生長(zhǎng)48小時(shí)的情況下)形狀環(huán)狀突起中部隆起光澤無(wú)邊緣完整色調(diào)米色粘性無(wú)分散性色素?zé)o
2.肉湯液體培養(yǎng)基(在28℃生長(zhǎng)24小時(shí)的情況下)生長(zhǎng)伴隨著渾濁化液體表面膜狀的，無(wú)環(huán)形成沉淀可觀察到色調(diào)米色3.肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)基生長(zhǎng)粘性色調(diào)米色光澤可觀察到分散性色素?zé)o4.石蕊牛乳培養(yǎng)基(在28℃生長(zhǎng)24-96小時(shí)的情況下)反應(yīng)不變化產(chǎn)氣 無(wú)(C)生理特征硝酸鹽的還原+脫氮作用-VP試驗(yàn)-吲哚形成-MR試驗(yàn)-脲酶+氧化酶+過(guò)氧化氫酶+檸檬酸的利用(Koser-Christensen培養(yǎng)基)+水解淀粉-酪蛋白-
DNA-Tween 80-色素的形成-脫羧試驗(yàn)賴(lài)氨酸-精氨酸-鳥(niǎo)氨酸-無(wú)機(jī)氮的利用銨鹽+硝酸鹽+3-酮乳酸的形成-對(duì)氧的反應(yīng)需氧O-F試驗(yàn)氧化生長(zhǎng)pH值最佳 6.0-8.0最大 11.0最小 3.5生長(zhǎng)溫度最佳28-35℃最大41.0℃最小10.0℃(D)各種糖的利用L-阿拉伯糖-D-木糖-D-葡萄糖+D-甘露糖+D-果糖-
D-半乳糖+麥芽糖+蔗糖+乳糖+海藻糖+D-山梨糖醇+D-甘露糖醇+肌醇+甘油+淀粉-阿東糖醇+纖維二糖+L-鼠李糖+衛(wèi)矛醇+L-山梨糖-氯化膽堿+D-甘露糖醇+D-甘露糖+在培養(yǎng)14天后沒(méi)有觀察到由上述糖產(chǎn)氣或產(chǎn)酸。
上述特征是基于Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，1st ed.(1984)中的描述分類(lèi)的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌屬于根瘤菌屬細(xì)菌。測(cè)定細(xì)菌DNA中GC含量，發(fā)現(xiàn)為63.4%。醌化合物的提取和分析表明，所有這些細(xì)菌具有輔酶Q-10。脂肪酸組成的分析表明，細(xì)菌細(xì)胞作為羥基脂肪酸含有3-羥基脂肪酸14∶0、16∶0和18∶0(碳原子數(shù)目∶雙鍵數(shù)目)，其比率為66∶17∶7。此外，所述細(xì)胞含有直鏈脂肪酸16∶0、18∶0和18∶1，其中18∶1含量最多。已經(jīng)知道，許多屬于根瘤菌屬的微生物具有上述的細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸組成。然而，上述經(jīng)過(guò)特征鑒定的菌株具有與屬于根瘤菌屬的已知微生物的特征不同的特征，即該經(jīng)過(guò)特征鑒定的菌株不含有直鏈脂肪酸21∶1或19∶0，觀察不到從L-阿拉伯糖產(chǎn)酸。按照Ezaki等人的方法(Ezaki et al.，International Journal of Systematic Bacteriology，39，224-229(1989))，分析DNA同源性，并與根瘤菌屬的已知原種菌株進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)下面表。
表4菌株與27B74菌株的同源性Rhizobium fredii IFO 147806.7Rhizobium galegae IFO 1496517.8Rhizobium huakuii IFO 152437.9豌豆根瘤細(xì)菌 IFO 1478427.7Rhizobium loti IFO 133365.9苜蓿根瘤細(xì)菌 IFO 1478216.4Rhizobium tropici IFO 1524711.827B74菌株與這些菌株中的任何菌株都沒(méi)有相同物種間的同源性。因此，結(jié)論是，該菌株是一種屬于根瘤菌屬的新菌株，該物種被命名為cobalaminogenum。IFO編號(hào)是Institute for Fermentation，Osaka(IFO，2-17-8，Juso-honmach，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Osaka-fu，Japan)的保藏號(hào)，而FERMBP編號(hào)是National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology(FRI，1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)的按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定給出的保藏號(hào)。
產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74以保藏IFO 15543于1993年9月2日保藏在IFO，并以保藏號(hào)FERMBP 4429于1993年9月29日保藏在FRI。
這樣得到的產(chǎn)生維生素B12的細(xì)菌可以按照與培養(yǎng)普通微生物的方式相似的方式進(jìn)行培養(yǎng)。即，所用的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)物、金屬鹽、酵母提取物、酵母細(xì)胞、核糖核酸，必要時(shí)還含有營(yíng)養(yǎng)源如各種氨基酸和各種維生素。碳源的實(shí)例包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、淀粉、糖化的淀粉溶液和糖漿;各種有機(jī)酸如丙酮酸、富馬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸;醇類(lèi)如乙醇和甲醇;以及胺類(lèi)如三甲銨內(nèi)酯類(lèi)、膽堿類(lèi)和單乙醇胺。氮源的實(shí)例包括有機(jī)氮源如胨、玉米浸液、大豆粉和脲;以及無(wú)機(jī)氮源如硫酸、硝酸、碳酸等的銨鹽，氨氣和氨水。這些碳源和氮源可以單獨(dú)使用或作為混合物使用。從下列物質(zhì)中可以適當(dāng)?shù)剡x擇其它營(yíng)養(yǎng)源，所述物質(zhì)是酵母提取物、酵母細(xì)胞、核糖核酸、無(wú)機(jī)鹽(如鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽等)、氨基酸和維生素，它們可以單獨(dú)使用或結(jié)合使用。此外，如果必要，可以加入防沫劑如硅油、表面活性劑如聚二醇醚等。此外，培養(yǎng)基優(yōu)選含有鈷化合物或5，6-二甲基苯并咪唑類(lèi)化合物。這些化合物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生高產(chǎn)量的維生素B12?？梢允褂萌魏吴捇衔?，只要它們是鈷源或鈷前體。鈷化合物的實(shí)例包括鹵化鈷類(lèi)(如氯化鈷、溴化鈷等)、硝酸鈷、硫化鈷、乙酸鈷、硫酸鈷銨、碳酸鈷、4-環(huán)已基丁酸鈷、2-乙基已酸鈷、氫氧化鈷、磷酸鈷、氧化鈷和硫氰酸鈷?？梢允褂萌魏?，6-二甲基苯并咪唑類(lèi)化合物，只要它們是5，6-二甲基苯并咪唑源或其前體。5，6-二甲基苯并咪唑類(lèi)化合物的實(shí)例包括5，6-二甲基苯并咪唑、煙酰胺、煙酸腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NaAD)、煙酸單核苷酸(NaMN)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和煙酸。
培養(yǎng)通常在通氣條件下進(jìn)行，例如通過(guò)振蕩培養(yǎng)、通氣和攪拌深層培養(yǎng)等來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選在大約4-9的范圍內(nèi)。當(dāng)在培養(yǎng)期間觀察到pH值變化時(shí)，可以適當(dāng)?shù)丶尤胨?如硫酸、鹽酸、乙酸等)、堿(如碳酸鈣、氫氧化鈉、氨氣、氨水等)以維持優(yōu)選的pH值范圍。適合于所用微生物生長(zhǎng)和維生素B12累積的培養(yǎng)溫度通常選自大約20-45℃。培養(yǎng)繼續(xù)到累積了基本上最大量的維生素B12。通常，培養(yǎng)大約2-10天足以達(dá)到此目的。
像其它細(xì)菌一樣，屬于產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌的產(chǎn)維生素B12細(xì)菌可以通過(guò)紫外光、輻射等的照射、單細(xì)胞分離、各種誘變處理等以常規(guī)方式進(jìn)行誘變。鑒于其分類(lèi)性狀與原始細(xì)菌的性狀比較的結(jié)果，這樣得到的突變株和天然存在的突變株不需要分類(lèi)成不同的群體。能產(chǎn)生維生素B12的任何這些微生物都可用于本發(fā)明中。
這樣得到的維生素B12及其各組分可以通過(guò)已知的常規(guī)分離和純化手段，如用苯酚、丁醇等的溶劑萃取、沉淀法、用離子交換樹(shù)脂、硅膠、活性炭等的層析方法，從培養(yǎng)液中分離并收集(J.Florent and L.Ninet，Vitamin B12Microbial Technology，edited by H.J.Peppler and D.Perlman，Academic Press，N.Y.，p.497-519(1979))。
例如，將培養(yǎng)液離心，得到細(xì)菌細(xì)胞。用無(wú)機(jī)酸(如鹽酸、硫酸等)或有機(jī)酸(如乙酸、酒石酸等)將pH值調(diào)至大約5.0。然后，加入氰離子。接著加熱，得到氰型維生素B12，然后提取到水相中。為了得到甲基型或輔酶型維生素B12，在暗處通過(guò)常規(guī)方法用醇類(lèi)(如乙醇、丙醇等)、酮類(lèi)(如丙酮、甲乙酮等)從細(xì)菌細(xì)胞中提取。從細(xì)菌細(xì)胞中提取維生素B12最好是通過(guò)按常規(guī)方法任意地將細(xì)菌細(xì)胞破碎來(lái)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，可以經(jīng)濟(jì)有效地生產(chǎn)維生素B12。
下列實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地具體說(shuō)明本發(fā)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例中的所有百分率(%)和比率都是按體積計(jì)的，除非另有說(shuō)明。
實(shí)施例1將含1%(重量)蔗糖的肉湯液體培養(yǎng)基(5ml)分裝到帶棉塞的各試管中，加熱滅菌。用一鉑環(huán)量的在肉湯瓊脂培養(yǎng)基中預(yù)先于30℃生長(zhǎng)了3天的產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74(IFO15543，F(xiàn)ERM BP-4429)接種后，于30℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將具有表5中的組成的培養(yǎng)基(20ml)置于200ml培養(yǎng)瓶中，加熱滅菌，用上述培養(yǎng)物(1.0ml)接種，在轉(zhuǎn)速為230rpm的旋轉(zhuǎn)震蕩器上于30℃培養(yǎng)6天。
將按與上述相似的方法得到的培養(yǎng)液(1升)離心，收集細(xì)菌細(xì)胞，將所得細(xì)胞懸浮在乙酸緩沖液中，將懸浮液的pH值調(diào)至5.0。向其中加入KCN至最終KCN濃度為100μg/ml，然后將混合物在100℃加熱15分鐘。冷卻后，離心除去產(chǎn)生的沉淀，得到維生素B12提取液。通過(guò)高效液相色譜(HPLC)測(cè)定溶液中的維生素B12，高效液相色譜是以O(shè)DP-50，4.6×150mm(由Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.，Japan制造)作為柱，用40mM乙酸銨∶乙腈＝88∶12從柱上洗脫維生素B12，通過(guò)測(cè)定361nm處的吸光度來(lái)測(cè)定流出液中的維生素B12含量。結(jié)果表明在上述培養(yǎng)液中形成了22μg/ml維生素B12。
然后，將上述維生素B12提取液用活性炭柱處理，吸附維生素B12。用蒸餾水洗柱后，用40%丙酮洗脫被吸附的物質(zhì)。收集含維生素B12的各部分流出液，減壓濃縮，用Dowex(商品名)50柱層析。用水洗柱后，用50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.5)洗脫被吸附的物質(zhì)，收集含維生素B12的各部分，中和，然后再次進(jìn)行活性碳柱層析。用蒸餾水洗柱后，用40%丙酮洗脫被吸附的物質(zhì)，收集含維生素B12的各部分，減壓濃縮。向殘留物中加入丙酮對(duì)維生素B12進(jìn)行結(jié)晶，得到維生素B12(氰型)的晶體(16.5mg)。
表5蔗糖30.0gKH2PO40.2g玉米浸液30.0gMgSO4·7H2O 0.2g氯化膽堿10.0g5,6-二甲基苯并咪唑0.025gCoCl2·6H2O 0.1g自來(lái)水1升pH7.0實(shí)施例2為了獲得各輔酶型維生素B12，將實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)液(1升)離心，得到細(xì)菌細(xì)胞，在暗處將乙醇(不含氰根離子)的濃度調(diào)至80%，并在80℃加熱下提取細(xì)胞20分鐘。減壓下蒸發(fā)提取物中的乙醇，得到含水溶液。用Sep-Pack C 18(由Waters制造)將溶液脫鹽，然后通過(guò)用Lichrospher RP 18(5×250mm)(由Merck生產(chǎn))作為柱的高效液相色譜鑒定輔酶型維生素B12。用85mM磷酸(pH3.0)和乙腈通過(guò)梯度方法進(jìn)行洗脫。乙腈的濃度變化范圍為0%(洗脫開(kāi)始時(shí))～50%(洗脫開(kāi)始后25分鐘)。通過(guò)測(cè)量361nm處的吸光度來(lái)測(cè)定流出液中輔酶型維生素B12的含量。結(jié)果表明，在上述培養(yǎng)液中形成了腺苷鈷胺(Ado-B12)(18μg/ml)、甲基鈷胺(CH3-B12)(2.5μg/ml)和羥鈷胺(OH-B12)(1.0μg/ml)。
比較例用屬于根瘤菌屬的典型細(xì)菌菌株生產(chǎn)維生素B12按照與實(shí)施例1所述相似的方法，將下列菌株在30℃培養(yǎng)6天。所述菌株是苜蓿根瘤細(xì)菌IFO 14782、Rhizobium galegae IFO 14965、Rhizobium huakuii IFO 15243、豌豆根瘤細(xì)菌IFO 13337、豌豆根瘤細(xì)菌IFO 14784、Rhizobium loti IFO 13336和Rhizobium tropici IFO15247。用實(shí)施例1中所述方法測(cè)定所得培養(yǎng)物的提取物中維生素B12的含量。結(jié)果列在表6中。
表6菌株 IFO號(hào)維生素B12(μg/ml)Rhizobium galegaeIFO 149650.03Rhizobium huakuiiIFO 152430.06豌豆根瘤細(xì)菌IFO 133370.7豌豆根瘤細(xì)菌IFO 147840.7Rhizobium lotiIFO 133360苜蓿根瘤細(xì)菌IFO 147820.01Rhizobium tropiciIFO 152470
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)維生素B12的方法，該方法包括，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生維生素B12的屬于產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌的微生物來(lái)產(chǎn)生維生素B12，并回收產(chǎn)生的維生素B12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，基中培養(yǎng)基含有鈷化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中鈷化合物是鹵化鈷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中含有5，6-二甲基苯并咪唑類(lèi)化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌是產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74(FERM BP-4429)。
6.能產(chǎn)生維生素B12的屬于產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌的微生物。
7.微生物產(chǎn)鈷胺根瘤細(xì)菌27B74(FERM BP-4429)。
全文摘要
提供了一種經(jīng)濟(jì)的、有效的并且工業(yè)上有用的生產(chǎn)維生素B
文檔編號(hào)C12P19/42GK1106018SQ9411621
公開(kāi)日1995年8月2日 申請(qǐng)日期1994年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月6日
發(fā)明者朝日知, 矢野孝彥, 土居宗晴 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社