專利名稱：生產(chǎn)維生素b12的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株產(chǎn)生維生素B12的方法，并且本發(fā)明涉及用于制備芽孢桿菌屬經(jīng)遺傳修飾的細菌的載體。
因為維生素B12對人體的效果，維生素B12早在本世紀二十年代就由George Minot和William Murphy間接發(fā)現(xiàn)(Stryer，L.，1988，Biochemie，第四版，pp.528-531，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，海德爾堡，柏林，紐約)。維生素B12最初于1948年得到純化和分離，短至八年后的1956年，Dorothy Hodgkin成功地闡明了其復(fù)合體的三維晶體結(jié)構(gòu)(Hodgkin，D.C.等，1956，維生素B12的結(jié)構(gòu)，Nature 176，325-328和Nature 178，64-70)。維生素B12生物合成的天然存在的終產(chǎn)物是5`-脫氧腺苷鈷胺素(輔酶B12)和甲基鈷胺素(MeCbl)，而構(gòu)成工業(yè)上最頻繁生產(chǎn)和處理形式的維生素B12定義為氰基鈷胺素(CNCbl)。在本發(fā)明中，除非特別限定，維生素B12都表示所有三種類似分子的名稱。
早至100多年以前(1884年)，De Bary首先描述了巨大芽孢桿菌物種。雖然普遍描述為以土壤為住處的細菌，但是巨大芽孢桿菌也可在多種其它生境中檢測到，如鹽水、沉積物、水稻、干肉、牛奶或蜂蜜。細菌經(jīng)常伴隨有假單胞菌和放線菌。如同和其緊密相關(guān)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus)一樣，巨大芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，并且尤其是通過其相對明確的大小2×5μm、約38％的G+C含量和高度明確的形成孢子的能力，可對其進行辨別，其中從所述的相對明確的大小獲得其名稱。甚至生長培養(yǎng)基中非常少量的錳，足夠該物種進行完整的孢子形成，這種能力僅可與一些嗜熱芽孢桿菌物種形成孢子的效率相比較。由于其大小和其高效形成孢子和萌芽，在巨大芽孢桿菌上對這些方法的分子基礎(chǔ)進行了廣泛的研究，所以至現(xiàn)在，與巨大芽孢桿菌孢子形成和萌芽相關(guān)的150多個基因得到了描述。對巨大芽孢桿菌的生理學(xué)研究(Priest，F(xiàn).G.等，1988，芽孢桿菌屬的數(shù)值分類(A Numerical Classification of the Genus Bacillus)，J.Gen.Microbiol.134，1847-1882)，將該物種歸類為專性需氧、脲酶陽性和Voges-Proskauer陰性、并且不能還原硝酸鹽的形成孢子的細菌。巨大芽孢桿菌一個最為顯著的特征是其利用多種碳源的能力。因此，它可利用多種糖，并且已經(jīng)在，例如玉米糖漿、肉類加工業(yè)的廢棄物，并且甚至在石油化學(xué)廢物中得到發(fā)現(xiàn)?？紤]到代謝非常廣譜的碳源的能力，巨大芽孢桿菌完全可與假單胞菌等同(Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime time for Bacillus megaterium))。
在工業(yè)生產(chǎn)多種酶、維生素等中廣泛使用巨大芽孢桿菌，具有多種優(yōu)勢。一個優(yōu)勢無疑是在芽孢桿菌屬中僅被枯草芽孢桿菌所超過的相對高度發(fā)展的遺傳學(xué)。第二，巨大芽孢桿菌無堿性蛋白酶，所以在生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)中實際上未觀察到降解。而且，巨大芽孢桿菌可高效分泌商業(yè)目標產(chǎn)物是公知的，如同例如在產(chǎn)生α-和β-淀粉酶的情況下所使用的一樣。而且，由于其大小，巨大芽孢桿菌可積聚高生物量，直至過度的高群體密度導(dǎo)致其死亡。在通過巨大芽孢桿菌的工業(yè)生產(chǎn)中，最為重要的是進一步有利的事實，其中所述的事實是該物種可從廢物和次等物質(zhì)中產(chǎn)生高價值和非常高質(zhì)量的產(chǎn)物。代謝非常廣泛的底物譜的可能性也在使用巨大芽孢桿菌作為土壤解毒生物中得到反映，其甚至可降解氰化物、除草劑和殘留性農(nóng)藥。最后，巨大芽孢桿菌完全是非病原體，并且不產(chǎn)生任何毒素的事實是非常重要的，特別是在生產(chǎn)食物和化妝品中。因為這些多種的優(yōu)勢，巨大芽孢桿菌已經(jīng)應(yīng)用于多種工業(yè)應(yīng)用，如生產(chǎn)α-和β-淀粉酶、青霉素酰胺酶、有毒廢物的處理或需氧生產(chǎn)維生素B12(綜述參見Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime time forBacillus megaterium))。
因為其在生物技術(shù)生產(chǎn)多種工業(yè)目標產(chǎn)物的使用中的許多優(yōu)勢，使用巨大芽孢桿菌具有巨大的經(jīng)濟目的。遺傳優(yōu)化的細菌菌株日益得到應(yīng)用，以增加經(jīng)濟目標產(chǎn)物的生產(chǎn)率。然而，經(jīng)遺傳修飾的細菌菌株通常存在關(guān)于它們所包含的游離復(fù)制質(zhì)粒穩(wěn)定性的問題。而且，細菌發(fā)酵期間，在代謝物流向維生素B12和染色體編碼的基因表達的直接控制方面的進一步改進有利于優(yōu)化控制產(chǎn)物量。
本發(fā)明的目的是提供允許產(chǎn)生進一步提高的維生素B12的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株。
這進一步需要提供合適的載體，其中所述的載體可使自谷氨酰tRNA形成尿卟啉原-III的酶過量表達，并且有利的是，抑制hem生物合成途徑和增加流向維生素B12的代謝物。同時，根據(jù)本發(fā)明的載體應(yīng)可將目的遺傳修飾穩(wěn)定地整合進細菌菌株的染色體。而且，在發(fā)酵期間，染色體編碼的hemAXCDBL操縱子基因表達的誘導(dǎo)和/或hem生物合成途徑的抑制應(yīng)以靶向的方式進行控制。
通過提供經(jīng)遺傳修飾的包含如SEQ ID No.4所示hemA[KK]基因和/或如SEQ ID No.1(hemZ)所示的部分核苷酸序列作為反義RNA(ashemZ)的巨大芽孢桿菌菌株，可實現(xiàn)本目的，其中所述的SEQ ID No.4編碼反饋抗性的谷氨酰-tRNA還原酶。
本發(fā)明進一步的實施方案包含這樣的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其中所述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株包含如SEQ ID No.4所示的編碼反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶的hemA[KK]基因和/或如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)，其中所述hemA[KK]基因組織于hemA[KK]XCDBL操縱子中。
本發(fā)明也包含如編碼糞卟啉原-III氧化酶的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的這種核苷酸序列具有的特征在于，它包含在編碼糞卟啉原-III氧化酶的hemZ基因區(qū)域之前(5‘-或上游序列)和/或之后(3‘-或下游序列)具有調(diào)控功能的序列。
為了本發(fā)明的目的，具有調(diào)控功能的序列理解為可影響轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定性或RNA加工和翻譯的序列。調(diào)控序列的實例尤其是啟動子、增強子、操縱子、終止子或翻譯增強子。然而，這種列舉不用于限制本發(fā)明。
如SEQ ID No.1所示的根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選地來源于巨大芽孢桿菌。在本文中，本發(fā)明也涉及所稱的分離核酸。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸或分離的核酸片段理解為是單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物，并且其可任選地包含天然的、化學(xué)合成的、經(jīng)修飾的或人工核苷酸。在本文中，術(shù)語“DNA聚合物”也包括基因組DNA、cDNA或它們的混合物。
另外，如SEQ ID No.2所示的糞卟啉原-III氧化酶也是本發(fā)明的主題。如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列優(yōu)選地由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列編碼。然而，也包括于本發(fā)明的是如編碼糞卟啉原-III氧化酶的SEQID No.1所示核苷酸序列的等位基因。根據(jù)本發(fā)明，等位基因理解為功能上等同的核苷酸序列，即基本上以相同意義發(fā)揮作用的核苷酸序列。功能上等同的序列是那些盡管存在偏離的核苷酸序列，例如因為遺傳密碼的簡并性，但仍然保留目的功能的序列。因此，功能等同物包含天然存在的此處所述序列的變體，而且也包含人工核苷酸序列，例如通過化學(xué)合成獲得的和任選地經(jīng)改編以匹配宿主生物的密碼子選擇的那些序列。而且，功能等同的序列包含具有經(jīng)修飾的例如賦予對酶的抑制劑脫敏或抗性的核苷酸序列。
原則上，所有適合于維生素B12生產(chǎn)的常見巨大芽孢桿菌菌株可用于本發(fā)明的目的，即用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株。
為本發(fā)明的目的，維生素B12生產(chǎn)菌株理解為巨大芽孢桿菌菌株或已經(jīng)經(jīng)常規(guī)和/或分子遺傳方法修飾的同源微生物，其中所述的方法以這樣的方式進行，即朝向維生素B12或其衍生物的生物合成的代謝物流量增加(代謝工程)。在這些生產(chǎn)菌株中，例如一個或多個基因和/或代謝途徑中決定性關(guān)鍵位置(瓶頸)的相應(yīng)酶在其調(diào)控或真正的解除調(diào)控方面受到改變，其中所述的代謝途徑因此受到復(fù)雜的調(diào)控。在本文中，本發(fā)明包含所有公知的芽孢桿菌屬維生素B12生產(chǎn)菌株或其同源生物。根據(jù)本發(fā)明具有優(yōu)勢的菌株尤其包括巨大芽孢桿菌DSMZ32、DSMZ 509和DSMZ 2894的菌株。
通過傳統(tǒng)誘變和優(yōu)選地通過定向分子生物學(xué)技術(shù)和合適的篩選方法可產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的已經(jīng)經(jīng)遺傳修飾的細菌菌株。感興趣的定向重組操作方法尤其是導(dǎo)致維生素B12的生物合成途徑的分支位點，通過所述方法可以以靶向的方式控制代謝物流向最大的維生素B12產(chǎn)生。與代謝物流量調(diào)控相關(guān)基因的特定修飾也包括對結(jié)構(gòu)基因之前和之后的調(diào)控區(qū)域的研究和修飾，例如優(yōu)化和/或替換啟動子、增強子、終止子、核糖體結(jié)合位點等。根據(jù)本發(fā)明也包含的是提高DNA、mRNA或所編碼蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，例如分別通過減少或阻止核酸酶或蛋白酶的降解。
在本發(fā)明的改變形式中，如SEQ ID No.4所示的hemA[KK]基因整合入經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的細菌染色體中。
經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的另一變體的特征在于部分hemZ基因作為胞質(zhì)編碼的反義RNA(ashemZ)在該細菌中以增加的拷貝數(shù)而存在。為本發(fā)明的目的，部分hemZ基因理解為從如SEQ ID No.1所示的hemZ基因的核苷酸序列開始，可制備多種反義RNA。制備反義RNA的方法，例如通過PCR，是技術(shù)人員和現(xiàn)在實驗室實踐所公知的。這種差異例如是由已產(chǎn)生的反義RNA的長度或?qū)Ψ戳xRNA所來源的hemZ核苷酸序列的區(qū)域選擇而導(dǎo)致的。在本文中，反義RNA序列可在它們的長度方面有變化，例如長度在幾個核苷酸和編碼區(qū)完整序列片段之間。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)。
拷貝數(shù)的增加可以是合適載體復(fù)制增強的結(jié)果，其導(dǎo)致拷貝數(shù)增加。原則上，拷貝數(shù)增加也可通過多次將基因或其部分整合入細菌染色體而實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明也包含的是這樣的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其中hemA[KK]基因整合入所述巨大芽孢桿菌的細菌染色體中，并且部分hemZ基因作為反義RNA(ashemZ)以增加的拷貝數(shù)存在。
本發(fā)明的另一個主題是經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，在所述巨大芽孢桿菌中，位于hemA[KK]XCDBL操縱子中的hemA[KK]基因和/或編碼反義RNA(ashemZ)的部分hemZ基因在誘導(dǎo)型啟動子的控制下。誘導(dǎo)型啟動子的實例是木糖誘導(dǎo)的XylA啟動子或β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)的啟動子(Miller，J.H.，1972，Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的木糖誘導(dǎo)型啟動子是來自于pWH1520的木糖操縱子的XylA啟動子(Rygus，T等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35594-599)。通過向培養(yǎng)基中加入木糖，在XylA啟動子控制下的基因的轉(zhuǎn)錄啟動，即在本文中，可增加hemA[KK]XCDBL和/或ashemZ的基因表達。
為制備上述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，根據(jù)本發(fā)明合適的載體同樣是本發(fā)明的主題并得到構(gòu)建。
因此，本發(fā)明包含含有如SEQ ID No.4所示編碼反饋抗性的谷氨酰-tRNA還原酶的hemA[KK]基因和與其有效連接用于誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列的整合型載體。
整合型載體理解為通過位點特異重組而在特定位點整合入宿主細胞染色體的載體，在宿主細胞中，載體和染色體一起復(fù)制。在根據(jù)本發(fā)明的一個改變形式中，位點特異重組通過hemA基因的同源序列而進行。
根據(jù)本發(fā)明，同源序列理解為與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列互補和/或與其雜交的那些序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“雜交序列”包括在本身公知的嚴謹條件下，與上述核苷酸序列特異地發(fā)生相互作用(結(jié)合)的基本上類似的DNA或RNA核苷酸序列。
從SEQ ID NO4所述的DNA序列或這些序列的一部分開始，這類同源序列可從其它生物中分離，例如使用常規(guī)雜交方法或PCR技術(shù)。這些DNA序列在標準條件下與上述序列雜交。使用例如來自保守區(qū)的短寡核苷酸是有利的，通過與其它hemA基因比較，以技術(shù)人員所熟悉的方式確定所述的短寡核苷酸以實施雜交。然而，也可使用根據(jù)本發(fā)明用于雜交的較長核酸片段或完整序列。根據(jù)用于雜交所使用的核酸即寡核苷酸、較長的片段或完整序列、或根據(jù)核酸類型是DNA或RNA，這些標準條件發(fā)生變化。因此，例如DNADNA雜交體的熔點約比相同長度的DNARNA雜交體低10℃。
根據(jù)核酸的不同，標準條件理解為，例如具有濃度0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM枸櫞酸鈉，pH 7.2)或又存在50％甲酰胺的緩沖水溶液，溫度42℃-58℃(如在5×SSC、50％甲酰胺中于42℃)。DNADNA雜交體的雜交條件有利的是0.1×SSC和溫度約20℃-45℃，優(yōu)選地約30℃-45℃。對于DNARNA雜交體，雜交條件有利的是0.1×SSC和溫度約30℃-55℃，優(yōu)選的約45℃-55℃。上述雜交溫度是在不存在甲酰胺時，對具有長度約100個核苷酸且G+C含量50％的核酸的計算熔點值的例子。DNA雜交的實驗條件在相關(guān)的遺傳學(xué)教科書中得到了描述，如Sambrook等，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，并且可使用技術(shù)人員所熟悉的公式，例如根據(jù)核酸長度、雜交體類型或G+C含量的不同進行計算。從下述教科書Ausubel等(編著)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins(編著)，1985，Nucleic Acids HybridizationA PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(編著)，1991，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，Oxford中，技術(shù)人員可獲得關(guān)于雜交的進一步的信息。
此外，SEQ ID NO14中所提及序列的同源序列理解為，例如在衍生的氨基酸水平，具有至少95％同源性，優(yōu)選地至少96％的同源性，特別優(yōu)選地至少97％或98％的同源性，非常特別優(yōu)選地至少99％或99.9％同源性的變體。在全部的氨基酸區(qū)域計算其同源性。使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989151-153)。為了本發(fā)明的目的，同源性理解為同一性。這兩個術(shù)語是同義的。
有效的連接是指諸如啟動子、編碼序列、終止子和適當時進一步的調(diào)節(jié)元件的按序排列，這種排列使得在編碼序列的表達過程中這些調(diào)節(jié)元件中的每一個都可以發(fā)揮其適當?shù)墓δ?。這些調(diào)節(jié)性核苷酸序列可以是天然來源的，或是通過化學(xué)合成獲得的。
合適的啟動子原則上是指能在適宜的宿主生物中控制基因表達的任何啟動子。根據(jù)本發(fā)明，啟動子也可能是化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子，該啟動子能夠控制受其調(diào)控的基因在宿主細胞特定時期表達。β-半乳糖苷酶-、阿拉伯糖-或木糖-誘導(dǎo)系統(tǒng)在此作為實例被提到。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是木糖-誘導(dǎo)系統(tǒng)，并且在該系統(tǒng)中是來源于pWH1520的xylA啟動子(Rygus，T.等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35594-599)。因此，本發(fā)明也包含上述類型的基因表達在xylA啟動子控制之下的整合型載體。
用于篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列的大量實例在文獻中得到了描述。因此，例如賦予氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素或紅霉素抗性的基因的多種篩選標志是公知的。然而，這種列舉不是最終的或限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明有利的篩選序列是用于在大腸桿菌中篩選載體的氨芐青霉素抗性基因，或用于在巨大芽孢桿菌中篩選載體的紅霉素抗性基因。
大腸桿菌中復(fù)制起點的有利變體是pBR322(Sutcliffe，J.G.，1979，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，43，Pt 177-90或巨大芽孢桿菌中的pE194ts或repF。巨大芽孢桿菌的溫度敏感起點pE194ts僅允許在40℃以下復(fù)制，由此在該“允許”溫度之上建立選擇壓力用于整合入染色體(Rygus等，1992)。repF基因產(chǎn)物描述為以反式發(fā)揮作用并且為質(zhì)粒在革蘭氏陽性細菌中復(fù)制所需的元件(Villafane等，1987)。本發(fā)明的其它整合型載體的變體的特點在于具有至少一個溫度敏感的復(fù)制起點。包含溫度敏感的復(fù)制起點pE194ts的整合型載體是優(yōu)選的。
本發(fā)明的其它變體包含這樣的獨特整合型載體，該載體包含經(jīng)遺傳修飾的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])，其編碼氨基酸序列包含至少兩個帶正電荷氨基酸插入的反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶。存在于整合型載體中的經(jīng)遺傳修飾的核苷酸序列優(yōu)選地編碼包含2-6個，優(yōu)選地2-4個以及特別優(yōu)選地2個額外的氨基酸的反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶。通過插入兩個或相應(yīng)地多達6個三聯(lián)體密碼，使用技術(shù)人員所熟悉的方法，例如通過PCR，將這些額外的氨基酸在編碼它們的核苷酸序列水平導(dǎo)入編碼的核苷酸序列。
整合型載體的優(yōu)選變體包含編碼反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶的經(jīng)遺傳修飾的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])，其中所述酶的氨基酸序列在N末端的第3和4位包含兩個帶正電荷氨基酸的插入。帶正電荷氨基酸優(yōu)選地是賴氨酸殘基。
酶的反饋抗性形式理解為活性不再被代謝途徑(或代謝途徑的支路)的終產(chǎn)物所抑制的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，這也包含具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的反饋抗性谷氨酰-tRNA還原酶，其中所述的SEQ ID No.5由巨大芽孢桿菌的hemA[KK]基因編碼。
在本文中，經(jīng)遺傳修飾的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])不但包含此處所述hemA序列的天然存在變體，而且包含人工核苷酸序列，例如通過化學(xué)合成獲得的核苷酸序列，如果適當，將所述化學(xué)合成的核苷酸序列采用以匹配宿主生物的密碼子選擇。遺傳修飾包含替換、添加、缺失、交換或插入一個或多個核苷酸殘基。
此處也包括的是公知的有義突變(sense mutation)，在蛋白質(zhì)水平，所述的有義突變，例如導(dǎo)致保守氨基酸的替換，但是所述的有義突變不導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的任何根本變化，并且因此對其功能是中性的。此處，例如某些氨基酸可被具有類似物理-化學(xué)特征(空間分布、堿性、疏水性等)的氨基酸所替換。例如，用賴氨酸殘基替換精氨酸殘基、用異亮氨酸殘基替換纈氨酸殘基、或用谷氨酸殘基替換天冬氨酸殘基。這也包含在蛋白質(zhì)水平上影響蛋白質(zhì)N或C末端，并且在對蛋白質(zhì)的催化功能沒有明顯不良影響的同時確實對其活性調(diào)控具有明顯不良影響的核苷酸序列的修飾。當然，這些修飾對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定效果。優(yōu)選地，在編碼核苷酸序列中導(dǎo)入編碼賴氨酸的6個核苷酸，同時根據(jù)巨大芽孢桿菌的密碼子選擇。這些修飾可通過本身公知的方法進行實施。
此外，本發(fā)明包含含有如SEQ ID No.1(hemZ)所示的作為反義RNA(ashemZ)的部分核苷酸序列以及與其有效連接的為誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列的載體。
本發(fā)明載體的優(yōu)選實施方案包含如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)以及與其有效連接的為誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列。
優(yōu)選的是載體增強的復(fù)制導(dǎo)致hemZ基因作為反義RNA(ashemZ)部分的拷貝數(shù)增加，優(yōu)選地如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)的拷貝數(shù)增加。
為獲得增強的基因表達(過量表達)，可增加所探討基因的拷貝數(shù)。此外，位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和/或調(diào)控區(qū)和/或核糖體結(jié)合位點相應(yīng)地以表達速率增加的方式得到修飾。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒可類似地發(fā)揮作用。通過使用誘導(dǎo)型啟動子，可在產(chǎn)生維生素B12期間增加表達。延長mRNA壽命的方法同樣提高表達?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中或在染色體中整合和擴增。此外，也可提高酶活性自身，例如通過提高催化活性或解除抑制劑的調(diào)控或產(chǎn)生反饋脫敏(反饋抗性)活性，或通過酶蛋白質(zhì)的降解得到阻止的事實而得到增加。然而，所探討基因的過量表達此外可通過改變培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)過程而得以實現(xiàn)。在包含部分hemZ基因作為反義RNA(ashemZ)的宿主細胞中，得到的(表達的)反義RNA與相應(yīng)的(互補)編碼糞卟啉原-III氧化酶的mRNA區(qū)退火。優(yōu)選地，它因此阻斷hemZ基因的核糖體結(jié)合位點，因此抑制與hem生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶的翻譯和表達。這依次導(dǎo)致hem生物合成的下降，其優(yōu)勢是導(dǎo)致朝向維生素B12產(chǎn)生的代謝作用的代謝物的量增加。
本發(fā)明還涉及包含SEQ ID No.1中所示的部分核苷酸序列(hemZ)作為反義RNA(ashemZ)的載體，優(yōu)選地是SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)，其中基因表達在xylA啟動子的控制之下。原則上，該載體此外也可整合入宿主細胞的染色體，例如當配備有溫度敏感的復(fù)制起點時。該載體的一種變體包含至少一個溫度敏感的復(fù)制起點。優(yōu)選地，這種載體變體包含溫度敏感的復(fù)制起點pE194ts。
使用例如Sambrook，J.等，1989，In Molecular cloning；a laboratorymanual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York所述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的載體通過融合上述組件如啟動子、編碼基因片段、復(fù)制起點、篩選基因等而得到制備。連接物或接頭可加入片段，以將DNA片段互相連接。
本發(fā)明還涉及包含上述類型的hemA[KK]基因的整合型載體的用途，用于制備根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株。同樣，本發(fā)明包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的用途，用于制備如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)，此外，本發(fā)明包含如SEQ ID No.3所示反義RNA(ashemZ)的用途，用于制備包含如SEQ ID No.1所示部分hemZ基因作為如SEQ ID No.3所示反義RNA(ashemZ)的上述類型的載體。本發(fā)明還涉及包含如SEQ ID No.1所示的部分hemZ基因作為SEQ ID No.3所示反義RNA(ashemZ)的載體的用途，用于制備本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，根據(jù)本發(fā)明，可將包含hemA[KK]基因的整合型載體和包含反義RNA(ashemZ)的載體轉(zhuǎn)移至合適的巨大芽孢桿菌菌株，并使用所得到的經(jīng)遺傳修飾的菌株生產(chǎn)維生素B12。
因此本發(fā)明也涉及所述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于生產(chǎn)維生素B12。
本發(fā)明還涉及通過對包含所述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)，以及在需氧條件下實施發(fā)酵而生產(chǎn)維生素B12的方法。
在根據(jù)本發(fā)明方法的一種改變形式中，在需氧發(fā)酵細胞的指數(shù)生長期，進行從需氧至厭氧發(fā)酵條件的轉(zhuǎn)換。通過稱為轉(zhuǎn)換的步驟，或通過兩步發(fā)酵方法，維生素B12的產(chǎn)生甚至可得到進一步的增加。
本文中本發(fā)明的優(yōu)勢是，一旦需氧培養(yǎng)物達到最大的光密度就進行從需氧至厭氧發(fā)酵的轉(zhuǎn)換的方法，但光密度至少要達到約2-3。通常，吸光度在570-600nm下測定。
為本發(fā)明的目的，厭氧條件理解為是指細菌首先在有氧下生長，然后轉(zhuǎn)移至厭氧瓶中進行發(fā)酵的種種條件。轉(zhuǎn)移進厭氧瓶內(nèi)的時間，特別是在兩階段方法中，發(fā)生在需氧培養(yǎng)的細菌剛剛達到指數(shù)生長期。這表明，轉(zhuǎn)移到厭氧瓶后，細菌只消耗瓶中存在的氧而不再額外供氧。這些條件也可以說成是半?yún)捬?。相?yīng)的步驟是常規(guī)的實驗室操作并且為技術(shù)人員所熟知。
起初將細菌在發(fā)酵罐里進行需氧發(fā)酵然后將氧的供應(yīng)逐漸減少并最終建立起半?yún)捬鯒l件也是一種流行的相似方法。作為備選，通過通入惰性氣體如氮氣也可積極地排出氧氣。在本發(fā)明的一個特定改變形式中，例如通過向培養(yǎng)基中加入還原劑建立嚴格的厭氧條件也是可能的。
對于本發(fā)明在厭氧條件下(無論是半?yún)捬趸驀栏竦膮捬鯒l件)的發(fā)酵，細菌一般不是絕對需要需氧培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng))。這意味著細菌也可在厭氧條件下培養(yǎng)，隨后進一步在半?yún)捬趸驀栏駞捬鯒l件下發(fā)酵。也可以想象到保存的菌株可以直接用于接種并用來在厭氧條件下制備維生素B12。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株也可以分批培養(yǎng)發(fā)酵。本發(fā)明也包括補料分批培養(yǎng)發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵的形式。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)勢是這樣的方法，所述的方法是hemA[KK]XCDBL操縱子的表達和/或編碼hemZ基因的反義RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表達是通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入木糖而得到誘導(dǎo)的。
本發(fā)明也涉及上述生產(chǎn)維生素B12的方法的改變形式，其中如SEQ IDNo.4所示的hemA[KK]XCDBL操縱子的表達和/或編碼hemZ基因的反義RNA的SEQ ID No.3所示核苷酸序列(ashemZ)的表達是通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入木糖而得到誘導(dǎo)的。
在本發(fā)明生產(chǎn)維生素B12的方法中，證明木糖濃度約0.1-1％是有利的。向培養(yǎng)基中加入約0.2-0.5％木糖是優(yōu)選的。在需氧發(fā)酵條件下，特別優(yōu)選的是加入約0.20-0.25％，尤其是0.23％木糖，以及在厭氧發(fā)酵條件下加入0.4-0.5％，尤其是0.5％木糖。
本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株中hemA[KK]XCDBL操縱子的過量表達導(dǎo)致維生素B12含量的增加，其中所述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株(“整合型菌株”)包含整合入染色體的在xylA啟動子誘導(dǎo)控制之下的hemA[KK]XCDBL操縱子，比較巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509和“整合型”菌株的維生素B12含量(μg/l×OD)，后者增加了至少15-40倍，優(yōu)選的20-35倍，特別優(yōu)選的22倍。當以μg/l計算維生素B12產(chǎn)量的增加時，增加了至少15-40倍，優(yōu)選的20-35倍，特別優(yōu)選的30倍。
本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株如DSMZ509中的ashemZ基因的過量表達是基于例如細胞中拷貝數(shù)的增加，并且可通過向培養(yǎng)基中加入木糖而額外得到誘導(dǎo)。在木糖誘導(dǎo)后約3小時的時間點導(dǎo)致維生素B12含量比比較菌株增加約15-40％倍，優(yōu)選的20-35％倍，特別優(yōu)選的22％倍，在用木糖誘導(dǎo)后約6小時的時間點，例如會出現(xiàn)維生素B12含量增加約16％(見上文，請指出上限和下限)。
比較菌株理解為是指同樣含有載體但無ashemZ插入物的巨大芽孢桿菌菌株。
在根據(jù)本發(fā)明方法的一種改變形式中，至少向培養(yǎng)基中加入鈷和/或5-氨基乙酰丙酸。
在需氧條件下，加入約250μM鈷可有利地實施發(fā)酵；在厭氧條件下，加入不超過500μM鈷是有利的。當加入5-氨基乙酰丙酸時，在需氧和厭氧條件下不超過300μM是有利的。在本發(fā)明方法的一種改變形式中，通過向每升培養(yǎng)基中加入約200-750μM、優(yōu)選的250-500μM鈷，可提高維生素B12的含量。
在含有鈷和ALA的情況下，用木糖誘導(dǎo)后6小時，經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ比比較菌株形成至少1-25％、優(yōu)選的5-18％和特別優(yōu)選的10％的更多維生素B12。這顯示反義hemZ RNA的轉(zhuǎn)錄不但抑制hem的合成，而且同時導(dǎo)致維生素B12形成的增加。Hem合成的抑制漸增地指導(dǎo)四吡咯合成的代謝產(chǎn)物流向維生素B12的合成途徑。
發(fā)酵后，已形成的維生素B12可從發(fā)酵培養(yǎng)基中處理。這種方法是常規(guī)的實驗室工作，并且此處不再進一步詳述。
通過下述構(gòu)建的非限制性實施例較詳細地闡述本發(fā)明。
菌株和質(zhì)粒使用下文表1和表2中所示的菌株和質(zhì)粒。
表1使用的菌株
*DSMZ德意志微生物保藏中心[German Collection of Microorganisms]，Brunswick表2使用的質(zhì)粒
緩沖液和溶液基本培養(yǎng)基Mopso基本培養(yǎng)基Mopso(pH 7.0)50.0mMN-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH 7.0) 5.0mM
MgCl2520.0μMK2SO4276.0μMFeSO450.0μMCaCl21.0mMMnCl2100.0μMNaCl 50.0mMKCl 10.0mMK2HPO41.3mM(NH4)6Mo7O2430.0pMH3BO34.0nMCoCl2300.0pMCuSO4100.0pMZnSO4100.0pMD-葡萄糖 20.2mMNH4Cl 37.4mM滴定試劑是KOH溶液。
對于固相培養(yǎng)基，加入15g/l瓊脂。
用于巨大芽孢桿菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的溶液SMMP緩沖液3號抗生素培養(yǎng)基(Difco) 17.5g/l蔗糖 500.0mM馬來酸鈉(pH 6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定試劑是NaOH溶液。
PEG-P溶液PEG 6000 40.0％(w/v)蔗糖 500.0mM馬來酸鈉(pH 6.5) 20.0mM
MgCl220.0mM滴定試劑為NaOH溶液。
cR5上層瓊脂蔗糖 300.0mMMops(pH 7.3) 31.1mMNaOH 15.0mML-脯氨酸 52.1mMD-葡萄糖 50.5mMK2SO41.3mMMgCl2×6H2O 45.3mMKH2PO4313.0μMCaCl213.8mM瓊脂 4.0g/l酪蛋白氨基酸 0.2g/l酵母提取物 10.0g/l滴定試劑為NaOH溶液。
培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑除非特別聲明，均使用Sambrook J.等人(1989，分子克??；實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)所述的Luria-Bertani肉湯(LB)完全培養(yǎng)基。對于固體培養(yǎng)基，另外加入15g瓊脂。
添加劑添加劑，諸如碳源、氨基酸、抗生素或鹽，可以加入到培養(yǎng)基中一起高壓滅菌，或者用水配成濃縮貯液滅菌，適當時通過過濾除菌。將這些物質(zhì)加入到已高壓滅菌并冷卻到50℃以下的培養(yǎng)基中。若含有對光敏感的物質(zhì)如四環(huán)素，要注意在暗處培養(yǎng)。通常使用的終濃度如下，但這并不意味著濃度變化是不可能的ALA 298μM氨芐青霉素(對大腸桿菌) 296μM
CoCl2(在需氧培養(yǎng)基中) 250μM紅霉素(對巨大芽孢桿菌) 0.55μM102μM葡萄糖 22mM溶菌酶 1mg/ml四環(huán)素(在固體培養(yǎng)基中) 23μM四環(huán)素(在液體培養(yǎng)基中) 68μM木糖33mM微生物學(xué)技術(shù)滅菌除非特別說明，所有的培養(yǎng)基和緩沖液均在120℃，1巴壓力下，蒸汽滅菌20分鐘。對熱敏感物質(zhì)需通過過濾除菌，玻璃器具在180℃高熱滅菌至少3小時。
液體細菌培養(yǎng)物的一般生長條件使用無菌環(huán)，將細菌從LB瓊脂平板或甘油培養(yǎng)物中移出，并接種入根據(jù)需要包含抗生素的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
在37℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，于帶擋板的搖瓶中對需氧細菌培養(yǎng)物進行孵育。根據(jù)細菌培養(yǎng)物的目的光密度改變孵育時間。
巨大芽孢桿菌的生長條件為了盡可能給需氧培養(yǎng)物通氣，巨大芽孢桿菌應(yīng)培養(yǎng)于轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度均為37℃的帶擋板搖瓶中。厭氧培養(yǎng)在150毫升厭氧瓶中，以150毫升體積，37℃和100轉(zhuǎn)/分進行生長。在這兩種情況下，小心地從過夜培養(yǎng)物中按1∶100比例進行接種，并使用恒定的條件過夜培養(yǎng)。為在厭氧條件下獲得更高細胞生物量的產(chǎn)量，將巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物在需氧條件下預(yù)孵育，并且當其密度達到目的值時，轉(zhuǎn)到厭氧生長條件下。為此，將巨大芽孢桿菌首先在帶擋板的搖瓶中于250轉(zhuǎn)/分和37℃孵育。在指數(shù)生長中期，或在穩(wěn)定期之初，將所有培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至150毫升的厭氧瓶中，并在37℃和100轉(zhuǎn)/分進行生長。
細菌平板培養(yǎng)使用無菌環(huán)，將細菌從甘油培養(yǎng)物中移出，并極小地在根據(jù)需要經(jīng)合適的抗生素處理的LB瓊脂平板上劃線，以便在37℃過夜孵育后，單克隆可在平板上辨別出來。如果使用來自液體培養(yǎng)物的細菌，使用Drygalski鏟在LB瓊脂平板上劃線，然后在37℃過夜孵育。
細胞密度的測定通過測定578nm波長下的光密度來測定細菌培養(yǎng)物的細胞密度，假定1OD578相當于1×109個細胞。
細菌的貯藏細菌的長期貯藏涉及公知的甘油培養(yǎng)物。為此，將850μl細菌的過夜培養(yǎng)物與150μl無菌的85％甘油充分混合，并且將混合物隨后存儲于-80℃。
分子生物學(xué)方法用于上述分子生物學(xué)方法的標準操作是Sambrook等(1989)。
感受態(tài)細胞的制備為制備感受態(tài)大腸桿菌細胞，將500毫升液體培養(yǎng)物用LB培養(yǎng)基生長至OD578為0.5-1。將培養(yǎng)物在冰上冷卻，然后離心(4000×g；15分鐘；4℃)。將細胞沉淀充分重懸于無菌去離子水中、離心(4000×g、8分鐘、4℃)、再次用無菌去離子水洗滌，并再次離心(4000×g、8分鐘、4℃)。沉淀用10％(v/v)甘油溶液洗滌后，將混合物離心(4000×g、8分鐘、4℃)，并將沉淀重懸于盡可能少的10％(v/v)甘油溶液中。將感受態(tài)大腸桿菌細胞立即用于轉(zhuǎn)化，或冷凍于-80℃。
通過電穿孔轉(zhuǎn)化細菌通過配備有Pulse Controller的Gene Pulser(BioRad)進行電穿孔，實施轉(zhuǎn)化。為此，在每種情況下，將40μl感受態(tài)大腸桿菌細胞和lμg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)化杯，并且在Gene Pulser中暴露于25uF，12kV/cm場強和200Ω并聯(lián)阻抗。在已加入2μl以上質(zhì)粒DNA的情況下，實施透析。
為隨后的再生，轉(zhuǎn)化后，將經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞立即在1毫升LB培養(yǎng)基中于調(diào)溫度搖床上在37℃孵育半小時。此后，將這些批次的不同體積涂布在含有合適抗生素添加物的LB平板上，并在37℃過夜孵育。
巨大芽孢桿菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體制備用1毫升巨大芽孢桿菌的過夜培養(yǎng)物接種50毫升LB培養(yǎng)基，并于37℃孵育。在OD578為1時，將細胞離心(10000×g、15分鐘、4℃)，并重懸于5毫升新鮮制備的SMMP緩沖液中。在SMMP緩沖液中加入溶菌酶后，將懸液于37℃孵育60分鐘，并在顯微鏡下檢測原生質(zhì)體的形成。通過離心(3000×g、8分鐘、室溫)收獲細胞，然后將細胞沉淀小心地重懸于5毫升SMMP緩沖液中、離心，并實施第二次洗滌步驟。然后，在加入10％(v/v)甘油后，將原生質(zhì)體懸液分成小份，并冷凍于-80℃。
轉(zhuǎn)化在SMMP緩沖液中，將500μl原生質(zhì)體懸液用0.5-1μg DNA處理，并加入1.5毫升PEG-P溶液。在室溫孵育2分鐘后，加入5毫升SMMP緩沖液、小心地混合，并離心(3000×g、5分鐘、室溫)懸液。此后立即移去上清，并將勉強可見的沉淀重懸于500μl SMMP緩沖液中。將懸液于37℃輕微振蕩孵育90分鐘。此后，將50-200μl轉(zhuǎn)化細胞與2.5毫升cR5Top瓊脂混合，并置于包含適于篩選的抗生素的LB-瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化克隆于37℃孵育一天后可辨別出來。
對巨大芽孢桿菌hemZ基因的克隆和測序為對巨大芽孢桿菌DSMZ509的hemZ基因測序，分離基因組DNA作為PCR反應(yīng)中的模板，并使用下述引物PCR引物15‘-TTTATATTCATATTCCATTTTG-3‘PCR引物25‘-GGTAATCCAAAAATAAAATC-3‘擴增與枯草芽孢桿菌hemZ基因具有65.1％同一性的480bp PCR片段，其中所述的PCR片段構(gòu)成了巨大芽孢桿菌hemZ基因的部分序列。為完備hemZ的部分序列，使用Sigma Geneosys的載體盒系統(tǒng)，實施單向PCR，即稱為的載體盒PCR。載體盒PCR允許擴增毗連已知序列片段的未知DNA區(qū)。此處，第一引物以已知DNA序列為基礎(chǔ)進行設(shè)計。為建立與所需要的第二PCR引物雜交的已知DNA序列，使用限制內(nèi)切酶對基因組進行切割，并將所有得到的末端與已知的短DNA序列連接。合成主鏈后，將短序列(小載體)作為第二引物的靶序列。
所有與載體盒單元融合的限制性消化產(chǎn)物可作為一種基因庫，即小載體庫，借助于所述的庫可擴增任何目的序列。由于小載體由部分沒有配對的寡核苷酸雙鏈組成，當?shù)诙€擴增循環(huán)的互補PCR引物特異于已知序列區(qū)時可進行雜交，并延伸產(chǎn)生互補序列。這確保僅目的DNA得到擴增。
成功的載體盒PCR需要可得到擴增的目的基因組DNA的片段大小。此處，片段大小不應(yīng)超過6-7kb，以便特異的DNA聚合酶(Taq)可沒有中斷地合成該片段，直至其末端。通過初步的Southern印跡分析，確定消化基因組DNA的足夠限制酶。為此目的，選擇ClaI限制酶。已通過Southern印跡分析確定的片段大小允許計算預(yù)期PCR片段的大小，并因此便于其鑒定。
載體盒PCR導(dǎo)致分離巨大芽孢桿菌完整hemZ基因的的一條鏈。從該序列開始，使用反向PCR，對所有hemZ基因進行擴增和測序是可能的。序列如SEQ ID No.1所示。
載體構(gòu)建構(gòu)建pHBintE使用的起始質(zhì)粒是pWH1967E(Schmiedel，D.等，1997，Appl.Microbiol.Biotechnol.，47(5)543-546)和pMM1520(Malten，Marco，2002，Produktion und Sekretion einer Dextransucrase in Bacillus megaterium[Production and Secretion of a Dextran Sucrase in Bacillus megaterium]，博士論文，Institute of Microbiology(Prof.Dr D.Jahn)，TechnicalUniversity Brunswick)。首先，在每種情況下用PstI和HindIII切割這兩種質(zhì)粒。此后，將全部混合物各自應(yīng)用于一個瓊脂糖凝膠，并洗脫目的片段。pWH1967E(4198bp)的洗脫片段包含紅霉素抗性、repF基因、溫度敏感起點pE194ts和一半氨芐青霉素抗性。pMM1520片段(1485bp)包含巨大芽孢桿菌的xylA‘啟動子和直接位于啟動子上游的多克隆位點、pBR322的起點和補充氨芐青霉素抗性的第二部分的氨芐青霉素抗性基因。然后，將兩個片段的粘端連接。將得到的質(zhì)粒命名為pHBintE?？寺〔呗栽?br>
圖1中圖示。
因此，經(jīng)克隆質(zhì)粒pHBintE(圖1)具有下述特征。它具有篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的氨芐青霉素抗性和篩選巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的紅霉素抗性。存在在大腸桿菌中復(fù)制的重要元件(pBR322)和巨大芽孢桿菌中復(fù)制的重要元件(pE194ts和repF)。巨大芽孢桿菌的溫度敏感起點pE194 ts僅允許在40℃以下復(fù)制，由此在該“允許”溫度之上建立整合入染色體的篩選壓力(Rygus等，1992)。將repF基因產(chǎn)物描述為以反式發(fā)揮作用和革蘭氏陽性細菌中質(zhì)粒復(fù)制所需要的元件(Villafane等，1987)。而且，質(zhì)粒包含具有直接位于上游的多克隆位點的xylA‘啟動子。通過木糖，該啟動子使得誘導(dǎo)插入多克隆位點的基因成為可能。
構(gòu)建pHBiHemA[KK]圖2顯示具有“KK-去調(diào)控的HemA”的巨大芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌野生型以及鼠傷寒沙門氏菌的HemA前27個氨基酸的比對報告。該圖再次清楚地顯示實施插入的位點。
通過PCR克隆HemA[KK]突變體。使用的模板是巨大芽孢桿菌的染色體DNA。由于巨大芽孢桿菌的hemA基因序列是公知的，獲得引物是可能的。引物序列如下
獲得的引物缺少與巨大芽孢桿菌序列的完全同源性。首先，為得到SpeI切割位點(斜體)，在正向引物中交換了6個堿基。第二，為克隆hemA[KK]突變體，通過長度為6個堿基并編碼兩個賴氨酸(下劃線)的DNA序列替換另外的6個堿基。以“KK插入”位于氨基酸序列N末端的第三和第四位置的方式，選擇插入位點。由于遺傳密碼子是簡并性的，為確定最可能的序列，使用巨大芽孢桿菌的密碼子選擇。密碼子選擇表明了編碼生物基因組的氨基酸的某些堿基三聯(lián)體的概率。在巨大芽孢桿菌的情況下，選擇百分比為76％的“AAA”是賴氨酸最頻繁的三聯(lián)體。將KpnI切割位點導(dǎo)入反向引物。通過MWG，Ebersbach合成引物。
使用Quiagen的PCR純化試劑盒純化通過PCR擴增的hemA[KK]突變體，用SpeI和KpnI切割，然后再次純化。質(zhì)粒pHBintE同樣用SpeI和KpnI切割，并使用Quiagen的PCR純化試劑盒純化。測定其濃度后，將這兩個片段以載體/插入物比為1∶4進行連接，以產(chǎn)生命名為pHBiHemAKK的整合型載體。質(zhì)粒pHBiHemAKK的克隆策略圖示于圖3中。
因為pHBiHemAKK與pHBintE僅在hemA[KK]突變體的插入不同，它保留了pHBintE的特性。此外存在的分別是在大腸桿菌和巨大芽孢桿菌中用于篩選的氨芐青霉素抗性和紅霉素抗性。起點pBR322用于在大腸桿菌中的復(fù)制，溫度敏感起點pE194ts和repF用于在巨大芽孢桿菌中的復(fù)制，將Xyl A‘和hemA[KK]突變體連接以產(chǎn)生翻譯融合，并在xyl啟動子的控制之下。由于hemA[KK]插入，pHBiHemAKK具有與巨大芽孢桿菌染色體同源的片段，并因此另外具有通過單互換重組整合入染色體的可能性。
溫度敏感起點pE194ts對于篩選這種整合情況非常重要。因為質(zhì)粒在30℃復(fù)制，巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子可在該溫度用紅霉素篩選。當溫度增至42℃，質(zhì)粒不再復(fù)制。這意味著僅那些已將質(zhì)粒整合入染色體，并因此具有紅霉素抗性的轉(zhuǎn)化子可以生長。
pHBiHemA[KK]整合入巨大芽孢桿菌染色體因此可使木糖誘導(dǎo)所有hemAXCDBL操縱子過量表達。而且，由于HemA蛋白質(zhì)的反饋去調(diào)控突變體，質(zhì)粒包含改進的過量生產(chǎn)維生素B12的可能。具有整合型質(zhì)粒pHBiHemA[KK]的巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509在下文中稱其為HBBm1。
構(gòu)建pHBasHemZ從分離自巨大芽孢桿菌DSMZ509的基因組DNA開始，PCR和下文中所描述的引物通過常規(guī)實驗室實驗，用于擴增反義RNA形式的hemZ基因mRNA 5’區(qū)的129bp BamHI/SpeI片段。
上游引物(ashemZ)包含BamHI切割位點5‘-GCGGGATCCCTTGAACTGAGCACCTTGACCGG-3‘反向引物(ashemZ)包含SpeI切割位點5‘-TCGACTAGTCGGACGTAAAAAACGTTCATCTTCTATACC-3‘PCR條件7分鐘/95℃30個循環(huán)1分鐘/95℃1分鐘/64℃1分鐘/72℃7分鐘/72℃此后，純化擴增的BamHI/SpeI反義RNA片段，并克隆入之前已用限制內(nèi)切酶SpeI和BamHI線性化的pWH1520載體(Rygus，T等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35594-599)。所得到的包含在xylA啟動子控制之下的反義hemZ RNA的質(zhì)粒pHBasHemZ顯示在圖4中。
如SEQ ID No.3所示插入的反義hemZ RNA長度為129bp，并起始于實際hemZ基因的起始密碼子之前的82個核苷酸。反義hemZ RNA位置的概況如下
因此，反義RNA和hemZ mRNA的轉(zhuǎn)錄形成了雙鏈RNA，并因此阻斷了hemZ基因用于核糖體的核糖體結(jié)合位點。
轉(zhuǎn)化和pHBiHemAKK整合入巨大芽孢桿菌為可將本整合型載體整合入染色體，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，首先用pHBiHemAKK轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌DSMZ509。轉(zhuǎn)化菌株在添加紅霉素(1μg/ml和75μg/ml)的瓊脂平板上生長。培養(yǎng)溫度選擇30℃，因為質(zhì)?？稍谠摐囟认聫?fù)制。
生長24小時后，用所述的紅霉素濃度鑒定克隆。同樣，將一些克隆轉(zhuǎn)移至添加紅霉素(75μg/ml)的瓊脂平板上，利用上述盛行的條件生長24小時。由此成功地將pHBiHemAKK轉(zhuǎn)化進入巨大芽孢桿菌。
用這些轉(zhuǎn)化子接種添加5μg/ml紅霉素和0.23％木糖的110毫升LB培養(yǎng)基，并在需氧條件下(于250轉(zhuǎn)/份振蕩)于30℃孵育。約12小時后，將溫度提高至42℃，以便質(zhì)粒不再進一步復(fù)制，并建立整合壓力。另外的12小時后，將每種情況下的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮的LB培養(yǎng)基，總共3天，并繼續(xù)在42℃孵育。在這一時間之后，觀察到LB培養(yǎng)基的良好克隆，這表明質(zhì)粒已整合入染色體，因為具有游離可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子不可能在這些條件下通過復(fù)制傳遞質(zhì)粒。
經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌DSMZ509的生長行為在需氧條件下具有整合的pHBiHemA(KK]的巨大芽孢桿菌DSMZ509為驗證新菌株的生長能力，記錄在添加5μg/ml紅霉素和0.23％木糖的LB培養(yǎng)基中，在需氧條件下于42℃的生長曲線。當少量木糖存在于培養(yǎng)基中時，pHBiHemAKK整合轉(zhuǎn)化體的良好需氧生長得到顯示。
轉(zhuǎn)換實驗(shift experiment)中具有pHBasHemZ的巨大芽孢桿菌DSMZ509在稱為“轉(zhuǎn)換實驗”的實驗中，為取得高細胞密度，巨大芽孢桿菌最初在需氧條件下生長。此后，在指數(shù)期的末期，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至厭氧條件下，因為細菌在厭氧條件下達到相當高的維生素B12含量(Barg，H.，2000，Vitamin B12-Produktion durch Bacillus megaterium [巨大芽孢桿菌生產(chǎn)的維生素B12]，畢業(yè)論文，Albert Ludwig University，F(xiàn)reiburg)。
當在以葡萄糖為碳源的Mopso基本培養(yǎng)基中生長時，對未轉(zhuǎn)化的菌株巨大芽孢桿菌DSMZ509和轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ進行比較。再次，將30μg/ml四環(huán)素加入轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物中。生長9小時后，用0.5％(w/v)木糖誘導(dǎo)，這意味著從需氧轉(zhuǎn)移至厭氧條件之前的1小時。
因為在形成反義hemZ RNA的轉(zhuǎn)化體和比較轉(zhuǎn)化體的生長中未發(fā)現(xiàn)顯著的差別，實施添加CoCl2和ALA的生長比較。添加ALA也導(dǎo)致增加的代謝產(chǎn)物流向hem合成途徑。因此，反義hemZ RNA的抑制揭示了關(guān)于比較轉(zhuǎn)化體生長中的顯著差別。在該轉(zhuǎn)換實驗中，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物再次接受添加30μg/ml四環(huán)素和另外添加250μM CoCl2和298μM ALA。生長10小時后，用0.5％(w/v)木糖誘導(dǎo)(對應(yīng)于轉(zhuǎn)移前1小時)。
圖5顯示，隨著添加298μM ALA和250μM CoCl2，巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ(-！-)在其整個過程中的生長顯著地弱于在比較轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pWH1520(-+-)的情況下。這表示通過反義RNA減少hem形成已發(fā)生。添加ALA(所有四吡咯的前體分子)顯然刺激四吡咯合成，達到通過反義hemZ RNA抑制糞卟啉原-III氧化酶(HemZ)而影響生長的程度。
添加ALA和CoCl2而獲得的細胞密度低于在沒有這些添加物的生長的情況。在為轉(zhuǎn)化體的情況下，對反義轉(zhuǎn)化體，細胞密度的OD578達到3.9，并且對比較轉(zhuǎn)化體(無添加物8.7和8.8)達到5.2。未轉(zhuǎn)化菌株DSMZ509(-▲-)在其整個進程中顯示最好的生長，并且在轉(zhuǎn)移的時間點具有最高的細胞密度，OD578為7.8(無添加物10.8)。
與未轉(zhuǎn)化菌株比較，轉(zhuǎn)化體生長的不足之處是由質(zhì)粒的額外復(fù)制和向培養(yǎng)基中添加抗生素而導(dǎo)致的。
在需氧條件下添加鈷和ALA的巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ在上述轉(zhuǎn)換實驗中，在需氧條件下，僅發(fā)生1小時的誘導(dǎo)后生長。因為主要在需氧條件下需要hem，在以葡萄糖為碳源，并添加250μM CoCl2和298μM ALA的Mopso基本培養(yǎng)基中，在需氧條件下實施兩種巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的生長比較。在OD578為2時用0.5％木糖(w/v)實施誘導(dǎo)。
圖6證實形成的反義hemZ RNA是抑制生長的。此外，DSMZ509-pHBasHemZ (-！-)在每一時間點的生長弱于比較轉(zhuǎn)化體(-+-)。因此，形成反義hemZ RNA的轉(zhuǎn)化體的最大OD578達到8.3，而比較轉(zhuǎn)化體的最大OD578是10.0。這表示糞卟啉原-III氧化酶的抑制已發(fā)生。
定量的維生素B12分析使用兩種不同的方法用于維生素B12的定量測定。首先，測定基于鼠傷寒沙門氏菌metE cysG雙突變體的生長，第二，使用來自r-biopharm的RIDASCREENFAST維生素B12 ELISA試驗，并結(jié)合Packard的Fusion Plate Reader。
使用鼠傷寒沙門氏菌metE cysG雙突變體測定維生素B12在不同的生長期，從巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物中取樣。測定其OD578后，通過離心(4000×g、15分鐘、4℃)從培養(yǎng)基分離細胞。隨后將獲得的細胞沉淀和移出的培養(yǎng)基冷凍干燥。鼠傷寒沙門氏菌metE cysG雙突變體在包含甲硫氨酸和半胱氨酸的基本培養(yǎng)基上于37℃過夜孵育，從平板上刮去，并使用40毫升等滲NaCl溶液洗滌。離心后，將細胞沉淀重懸于等滲鹽水中。將洗滌的細菌培養(yǎng)物仔細地與溫度為47-48℃的400毫升包含半胱氨酸的基本培養(yǎng)基瓊脂混合。
將10μl已重懸于去離子無菌水，并在水浴中煮沸15分鐘的巨大芽孢桿菌樣品放置于冷平板上，并在37℃孵育18小時。已生長的沙門氏菌克隆的直徑與使用的巨大芽孢桿菌樣品的維生素B12含量成比例。與以添加0.01、0.1、1、10和40pmol維生素B12而建立的校準曲線比較，獲得試驗樣品中關(guān)于維生素B12含量的結(jié)論。使用該標準方法，可迅速地和高重復(fù)性地檢測生物材料中少量的維生素B12。
用ELISA試驗測定維生素B12試驗原理該試驗是基于抗原/抗體反應(yīng)，其中微孔滴定板的孔用針對維生素B12的特異性抗體包被。加入酶標記的維生素B12(酶交聯(lián)物)和樣品溶液、或維生素B12標準溶液后，游離的和酶標記的維生素B12競爭維生素B12的抗體結(jié)合位點(競爭性酶免疫試驗)。
隨后在洗滌步驟中除去未結(jié)合的酶標記維生素B12。通過加入底物/色原溶液(四甲基聯(lián)苯胺/尿素過氧化物)而進行檢測。結(jié)合的酶交聯(lián)物將色原轉(zhuǎn)變成藍色的終產(chǎn)物。加入終止試劑導(dǎo)致顏色從藍色變成黃色。利用光度計在450nm進行測量。因此，溶液的吸光度與樣品中的維生素B12濃度成反比。
步驟在欲測量的巨大芽孢桿菌液體培養(yǎng)物的不同生長時間移去2毫升樣品，并測定其OD578。通過隨后的離心(4000×g、5分鐘、4℃)，從培養(yǎng)基中分離細胞，棄上清，并將沉淀冷凍干燥。然后，將試劑盒中所需要的試劑(標準品、酶交聯(lián)物和濃縮的洗滌緩沖液)放置于室溫，并按所附帶的方法進行制備和稀釋。在實施試驗之前，立即制備樣品。為此，將冷凍干燥的細胞重懸于0.5毫升無菌去離子水中。通過加入50μl溶菌酶溶液(1mg/ml)、接著孵育(30分鐘、37℃、在300轉(zhuǎn)/分振蕩)、超聲(5分鐘)和煮沸(3分鐘、100℃)，實現(xiàn)定量的細胞破裂。然后將樣品冰冷至室溫，并離心(4000×g、5分鐘、15℃)。將上清移去，并用樣品稀釋緩沖液按1∶5稀釋。然后，在每種情況下，將50μl稀釋樣品和稀釋的維生素B12標準品移入微孔滴定板的孔中。加入50μl稀釋的酶交聯(lián)物后，將樣品混合(融合設(shè)備中的振蕩器功能)，并孵育(15分鐘，室溫)。孵育后，通過輕敲微孔滴定板使孔倒空，并每孔用250μl洗滌緩沖液洗滌。此外，通過輕敲使孔倒空，并重復(fù)洗滌步驟2次。然后每孔加入兩滴終止試劑，混合，并在室溫于暗處孵育10分鐘。每孔加入兩滴終止試劑后，在Packard的融合設(shè)備中測量450nm的吸光度。為了評價，按下述計算吸光度的百分比標準品或樣品的吸光度/空白標準的吸光度×100＝吸光度％然后，通過按吸光度％對log(ppb)作圖而建立校準線。此后，通過線性方程、稀釋系數(shù)和已知的細胞密度(OD578)，可以μg/(1×OD)顯示樣品中維生素B12含量。
測定具有pHBiHemAKK的巨大芽孢桿菌DSMZ509的維生素B12含量的ELISA試驗為驗證具有木糖誘導(dǎo)的hemA[KK]XCDBL操縱子的培養(yǎng)物的維生素B12含量，將整合型菌株和作為比較菌株的DSMZ509和DSMZ509-pWH1520-cobA在需氧下生長。生長10小時和誘導(dǎo)5小時后(t＝5)，根據(jù)建立的ELISA維生素B12試驗消化樣品，并測量維生素B12含量。由于它們與微黃色的DSMZ509比較培養(yǎng)物相比顯紅褐色，離心的細胞沉淀已經(jīng)表明四吡咯含量增加。
如圖7和8中所示，這通過ELISA試驗得到證實。
所察覺的hemA[KK]XCDBL操縱子的過量表達導(dǎo)致維生素B12含量從0.07(野生型菌株(DSMZ509)的OD578，g/l)增加至1.59(整合型菌株的OD578，g/l)。這相當于增加倍數(shù)為22。如果以g/l計算其增加，結(jié)果不少于增加倍數(shù)為30(從在DSMZ509情況下的0.26g/l至具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509的情況下的8.51μg/l)。
巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ的ELISA維生素B12試驗在轉(zhuǎn)移試驗中，巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的樣品在用木糖誘導(dǎo)后3小時(T＝3)和6小時(T＝6)取出。借助R-Biopharm的ELISA試驗分析這些樣品的維生素B12，其在材料和方法部分有詳細的描述。
在轉(zhuǎn)換實驗中，從需氧至厭氧條件的轉(zhuǎn)移發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。
圖9和圖10顯示，利用葡萄糖生長(1、2、5、6)和利用葡萄糖并加入298μM ALA和250μM CoCl2(3、4、7、8)生長所測定維生素B12的結(jié)果。
圖9顯示基于所討論的培養(yǎng)物細胞密度的維生素B12的濃度?？梢钥闯?，在四種情況下有三種情況(2、6和8號)，DSMZ509-pHBasHemZ比比較轉(zhuǎn)化體形成更多維生素B12(1、5和7號)。因此，在無添加物在時間T＝3(2號)的生長情況下，形成反義hemZ RNA的轉(zhuǎn)化體的維生素B12含量高21％，在T＝6(6號)的情況下比比較轉(zhuǎn)化體的情況下高16％。在利用鈷和ALA生長的情況下，在誘導(dǎo)后6小時(8號)，DSMZ509-pHBasHemZ比DSMZ509-pWH1520多形成10％維生素B12。在圖10中，在未加入鈷和ALA的培養(yǎng)物和有添加物的培養(yǎng)物之間，維生素B12濃度的差別更為顯著。其原因是無添加物的生長可取得更高的細胞密度。
巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ的維生素B12的生物測定為測定維生素B12含量，在轉(zhuǎn)換實驗中通過生物測定，在三個不同時間點取樣。取樣發(fā)生在1)誘導(dǎo)時的時間點(T＝0)，2)誘導(dǎo)后3小時(T＝3)和在誘導(dǎo)后6小時的穩(wěn)定期(T＝穩(wěn)定期)。此處，從需氧轉(zhuǎn)移至厭氧條件發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。測量巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509、DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的維生素B12含量。首先，對于利用葡萄糖的生長，其次對于利用葡萄糖和加入250μM CoCl2和298μM ALA的生長。使用鼠傷寒沙門氏菌metE cysG雙突變體AR3612實施測定。維生素B12含量以pmol/OD578和μg/l顯示(圖11-12)。
圖11顯示，在利用葡萄糖生長的情況下，對于DSMZ509-pHBasHemZ(3、6和9號)，在任一時間點基于細胞密度的維生素B12含量是最高的。此外，這顯示hem合成的抑制導(dǎo)致增加的代謝產(chǎn)物流向維生素B12的合成。
再一次地，以μg/升細菌培養(yǎng)物所示的圖(圖12)顯示轉(zhuǎn)錄的反義hemZ RNA轉(zhuǎn)化體(3、6和9號)已產(chǎn)生總體上最高量的維生素B12，雖然用這種轉(zhuǎn)化體獲得低的細胞密度。
圖13顯示，隨著向培養(yǎng)基中加入CoCl2和ALA，在短至誘導(dǎo)后3小時，轉(zhuǎn)錄的反義hemZ RNA轉(zhuǎn)化體取得最高的維生素B12含量(6號)。在最初嘗試解釋這種現(xiàn)象中，似乎誘導(dǎo)沒有立即導(dǎo)致最大的質(zhì)粒復(fù)制，而是需要啟動期。考慮到每升細菌培養(yǎng)物的維生素B12含量，可以看到，由于其較好的生長，未轉(zhuǎn)化菌株DSMZ509比其它兩種轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)生更多維生素B12(圖14)。
相關(guān)糞卟啉原III測定方法熒光光譜在生長的不同時間，從待測量的巨大芽孢桿菌液體培養(yǎng)物中移出2毫升樣品，并測定其OD578。通過隨后的離心(4000×g、5分鐘、4℃)從培養(yǎng)基中分離細胞，棄上清，并將沉淀冷凍干燥。在測量前，立即將樣品重懸于1毫升無菌去離子水中，并接著通過用水稀釋來調(diào)節(jié)光密度。然后，將1毫升這些調(diào)節(jié)的樣品用50μl溶菌酶(1mg/m1)處理，并在振蕩器中于37℃和300轉(zhuǎn)/分孵育30分鐘。然后，將樣品在超聲浴中放置10分鐘，并此后于4000×g離心3分鐘。利用下述設(shè)置，對上清進行熒光測量起始430nm終止680nm激發(fā)409nmEx Slit 12nmEm Slit 12nm掃描速度200nm/分鐘加入CoCl2和ALA的生長曲線給出第一個信號，反義hemZ RNA抑制了hem的合成。木糖誘導(dǎo)的反義hemZ RNA通過占據(jù)hemZ mRNA而抑制核糖體結(jié)合位點，并因此阻止翻譯成hemZ。這導(dǎo)致催化從糞卟啉原III至原卟啉原IX這一反應(yīng)的hemZ蛋白質(zhì)形成的減少。因為實際的代謝產(chǎn)物流向在該點中斷，糞卟啉原III得到積聚。直接檢測樣品中的糞卟啉原III證明是困難的，因為糞卟啉原III在空氣中氧化產(chǎn)生糞卟啉III。預(yù)實驗顯示糞卟啉III的熒光光譜在約579nm和約620nm處的發(fā)射峰。因此，間接借助于熒光光譜測量氧化型(糞卟啉III)可檢測糞卟啉原III的相對量。
為了證明DSMZ509-pHBasHemZ和比較轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pWH1520中糞卟啉原III的不同相對量，實施熒光測量。在用0.5％(w/v)木糖誘導(dǎo)后3小時，從以葡萄糖為碳源，并加入298μM ALA和250μM CoCl2的Mopso基本培養(yǎng)基的生長實驗中對轉(zhuǎn)化體DSMZ509-pHBasHemZ和DSMZ509-pWH1520取樣。首先，通過用水稀釋調(diào)節(jié)樣品的光密度。此后，破裂細胞，并測量細胞抽提物。這些樣品的各個光譜顯示類似的進程，具有反義hemZ RNA的轉(zhuǎn)化體的光譜總是顯示較高的熒光水平。兩個光譜的差別似乎在其峰處變得更寬(在579nm和612nm)。
為證明這種差別，圖15顯示兩個樣品的示差光譜(DSMZ509-pHBasHemZ減DSMZ509-pWH1520)。在579.83nm和617.86的峰顯示，與比較轉(zhuǎn)化體相比，形成反義RNA的轉(zhuǎn)化體積聚糞卟啉原IⅡ。這是下述事實的明確證據(jù)，即借助于反義RNA已實現(xiàn)對hem生物合成的抑制。使用DSMZ509-pHBasHemZ，通過利用木糖的靶向誘導(dǎo)因此可阻止hem生物合成途徑，這接下來允許連續(xù)的代謝產(chǎn)物流向維生素B12的合成途徑。
附圖簡述通過下圖更詳細地解釋本發(fā)明。
圖1顯示用于巨大芽孢桿菌的整合型質(zhì)粒pHBintE的克隆圖示。起始質(zhì)粒pWH1967E和pMM1520用核酸內(nèi)切酶PstI和HindIII切割。洗脫pWH1967E的4198bp片段(PstI-2786和HindIII-6984之間)和pMM1520的1485bp片段(HindIII-7212和PstI-1307之間)，并連接。
圖2顯示1)鼠傷寒沙門氏菌的HemA，2)巨大芽孢桿菌的HemA和3)巨大芽孢桿菌的HemAKK的最初27個氨基酸比對的圖示。
加下劃線在N末端的位置3和4插入兩個帶正電的賴氨酸殘基(KK)。
圖3顯示質(zhì)粒pHBiHemAKK的克隆策略的圖示。將PCR擴增的hemA[KK]突變體和載體pHBintE各自用SpeI和KpnI切割，并將得到的粘端連接以產(chǎn)生整合型載體pHBiHemAKK。
圖4顯示質(zhì)粒pHBasHemZ的圖示。圖示中所示的切割位點SpeI和BamHI用于插入反義RNA。
圖5顯示巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509和該菌株的轉(zhuǎn)化體在以葡萄糖為碳源并加入298μM ALA和250μM CoCl2的Mopso基本培養(yǎng)基中于37℃的生長行為。從需氧轉(zhuǎn)移至厭氧生長發(fā)生在指數(shù)期的末期(11小時后)。未轉(zhuǎn)化的DSMZ509(-▲-)、DSMZ509pWH1520(-+-)和DSMZ509 pHBasHemZ(-！-)的生長。通過生長10小時后加入0.5％(w/v)木糖，pHBasHemZ和pWH1520上xylA啟動子的基因表達得到誘導(dǎo)。在所示時間取樣并測定578nm的光密度。
圖6顯示巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509-pWH1520(-+-)和DSMZ509-pHBasHemZ(-！-)在以葡萄糖為碳源并加入298μM ALA和250μM CoCl2的Mopso基本培養(yǎng)基中于需氧生長條件下的生長行為。通過在OD578為2時加入0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。在所示時間取樣并測定578nm的光密度。
圖7顯示在需氧生長條件下，在LB培養(yǎng)基中巨大芽孢桿菌DSMZ509(1)、DSMZ509-pWH1520-cobA(2)和具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509以ELISA試驗測量，以μg/l*OD表示的維生素B12含量。生長5小時后，利用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)，在生長10小時后收獲細胞。
1＝DSMZ5092＝DSMZ509-pWH1520-cobA3＝具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509圖8顯示在需氧生長條件下，在LB培養(yǎng)基中巨大芽孢桿菌DSMZ509(1)、DSMZ509-pWH1520-cobA(2)和具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509以ELISA試驗測量，以μg/l表示的維生素B12含量。生長5小時后，利用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)，在生長10小時后收獲細胞。
1＝DSMZ5092＝DSMZ509-pWH1520-cobA3＝具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509圖9顯示在以葡萄糖為碳源的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中，以ELISA試驗測量的維生素B12產(chǎn)量。生長9小時和10小時后(分別是1、2、5、6和3、4、7、8)，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。以μg/升細菌培養(yǎng)物和OD578表示維生素B12含量。
1＝無添加物的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時2＝無添加物的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時3＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時4＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時5＝無添加物的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時6＝無添加物的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時7＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時8＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖10顯示以葡萄糖為碳源的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中，以ELISA試驗測量的維生素B12產(chǎn)量。生長9小時和10小時后(分別是1、2、5、6和3、4、7、8)，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。以μg/升細菌培養(yǎng)物表示維生素B12含量。
1＝無添加物的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時2＝無添加物的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時3＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時4＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時5＝無添加物的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時6＝無添加物的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時7＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時8＝加入250μM CoCl2和298μM ALA的DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖11顯示以葡萄糖為碳源的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509、DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中的維生素B12產(chǎn)量。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。生長9小時后，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。以pmol/OD578表示每細胞生物量的維生素B12含量。
1＝DSMZ509，在誘導(dǎo)時2＝DSMZ509-pWH1520，在誘導(dǎo)時3＝DSMZ509-pHBasHemZ，在誘導(dǎo)時4＝DSMZ509，誘導(dǎo)后3小時5＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時6＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時7＝DSMZ509，誘導(dǎo)后6小時8＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時9＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖12顯示以葡萄糖為碳源的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509、DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中的維生素B12產(chǎn)量。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。生長9小時后，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。以μg/升細菌培養(yǎng)物表示維生素B12含量。
1＝DSMZ509，在誘導(dǎo)時2＝DSMZ509-pWH1520，在誘導(dǎo)時3＝DSMZ509-pHBasHemZ，在誘導(dǎo)時4＝DSMZ509，誘導(dǎo)后3小時5＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時6＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時7＝DSMZ509，誘導(dǎo)后6小時8＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時9＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖13顯示以葡萄糖為碳源，并加入298μM ALA和250μM CoCl2的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509、DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中的維生素B12產(chǎn)量。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。生長10小時后，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。以pmol/OD578表示每細胞生物量的維生素B12含量。
1＝DSMZ509，在誘導(dǎo)時2＝DSMZ509-pWH1520，在誘導(dǎo)時3＝DSMZ509-pHBasHemZ，在誘導(dǎo)時4＝DSMZ509，誘導(dǎo)后3小時5＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時6＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時7＝DSMZ509，誘導(dǎo)后6小時8＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時9＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖14顯示以葡萄糖為碳源，并加入298μM ALA和250μM CoCl2的Mopso基本培養(yǎng)基中，巨大芽孢桿菌DSMZ509、DSMZ509-pwH1520和DSMZ509-pHBasHemZ在轉(zhuǎn)換實驗中的維生素B12產(chǎn)量。從需氧轉(zhuǎn)換為厭氧發(fā)生在誘導(dǎo)后1小時。生長9小時后，用0.5％(w/v)木糖實施誘導(dǎo)。以μg/升細菌培養(yǎng)物表示維生素B12含量。
1＝DSMZ509，在誘導(dǎo)時2＝DSMZ509-pWH1520，在誘導(dǎo)時3＝DSMZ509-pHBasHemZ，在誘導(dǎo)時4＝DSMZ509，誘導(dǎo)后3小時5＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后3小時6＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后3小時7＝DSMZ509，誘導(dǎo)后6小時8＝DSMZ509-pWH1520，誘導(dǎo)后6小時9＝DSMZ509-pHBasHemZ，誘導(dǎo)后6小時圖15顯示在409nm激發(fā)時，巨大芽孢桿菌DSMZ509-pHBasHemZ減去DSMZ509-pWH1520的熒光光譜的差示熒光光譜。在579nm和618nm的發(fā)射峰顯示糞卟啉III，并且因此與DSMZ509-pWH1520相比，在DSMZ509-pHBasHemZ中積聚代謝產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其包含編碼反饋抗性谷氨酰-tRNA還原酶的如SEQ ID No.4所示的基因hemA[KK]和/或包含作為反義RNA(ashemZ)的如SEQ ID No.1(hemZ)所示hemZ基因的部分核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其包含組織在hemA[KK]XCDBL操縱子中的如SEQ ID No.4所示的基因hemA[KK]和/或包含如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其中hemA[KK]基因整合入該細菌的染色體中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其中部分hemZ基因以質(zhì)粒編碼的拷貝數(shù)增加的反義RNA(ashemZ)存在。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其中組織在hemA[KK]XCDBL操縱子中的hemA[KK]基因和/或作為反義RNA(ashemZ)的部分hemZ基因在誘導(dǎo)型啟動子的控制之下。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，其包含作為誘導(dǎo)型啟動子的xylA啟動子。
7.整合型載體，其包含編碼反饋抗性谷氨酰-tRNA還原酶的如SEQ IDNo.4所示的基因hemA[KK]以及與其有效連接的用于誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的整合型載體，其包含hemA基因的經(jīng)遺傳修飾的核苷酸序列(hemA[KK])，所述核苷酸序列編碼氨基酸序列包含至少兩個帶正電荷氨基酸插入的反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的整合型載體，其包含hemA基因的經(jīng)遺傳修飾的核苷酸序列(hemA[KK])，所述核苷酸序列編碼氨基酸序列在其N末端的位置3和4包含兩個帶正電荷氨基酸插入的反饋抗性谷氨酰-tRNA合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的整合型載體，其中插入的帶正電荷氨基酸是賴氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任意一項所述的整合型載體，其中基因表達在xylA啟動子的控制之下。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11中任意一項所述的整合型載體，其包含至少一個溫度敏感的復(fù)制起點。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12中任意一項所述的整合型載體，其包含溫度敏感的復(fù)制起點pE194ts。
14.如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其編碼糞卟啉原III氧化酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸序列，其包含位于編碼糞卟啉原III氧化酶的hemZ基因區(qū)域上游和/或下游的具有調(diào)控功能的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的核苷酸序列，其來源于巨大芽孢桿菌。
17.具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的糞卟啉原III氧化酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的糞卟啉原III氧化酶，其由權(quán)利要求14-16中任意一項所述的核苷酸序列編碼。
19.載體，其包含作為反義RNA(ashemZ)的如SEQ ID No.1(hemZ)所示hemZ基因的部分核苷酸序列以及與其有效連接的用于誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的載體，其包含如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)以及與其有效連接的用于誘導(dǎo)基因表達、篩選、復(fù)制和/或整合入宿主細胞染色體的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的載體，其中基因表達在xylA啟動子的控制之下。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任意一項所述的載體，其包含至少一個溫度敏感的復(fù)制起點。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任意一項所述的載體，其包含溫度敏感的復(fù)制起點pE194ts。
24.通過包含根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)物而產(chǎn)生維生素B12的方法，其中發(fā)酵在需氧條件下實施。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中hemA[KK]XCDBL操縱子的基因表達和/或編碼hemZ基因的反義RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表達通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入木糖而誘導(dǎo)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中如SEQ ID No.4所示的hemA[KK]XCDBL操縱子的表達和/或編碼如SEQ ID No.3所示的hemZ基因反義RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表達是通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入木糖而誘導(dǎo)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-26中任意一項所述的方法，其中在需氧發(fā)酵細胞的指數(shù)生長期，實施從需氧向厭氧發(fā)酵條件的轉(zhuǎn)換。
28.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任意一項所述的方法，其中向培養(yǎng)基中至少加入鈷和/或5-氨基乙酰丙酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任意一項所述核苷酸序列的用途，用于制備如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)。
30.如SEQ ID No.3所示的反義RNA(ashemZ)的用途，用于制備根據(jù)權(quán)利要求19-23中任意一項所述的載體。
31.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任意一項所述的載體的用途，用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株。
32.根據(jù)權(quán)利要求7-13中任意一項所述的整合型載體的用途，用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于產(chǎn)生維生素B12。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過包含經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)物產(chǎn)生維生素B12的方法，并涉及經(jīng)遺傳修飾的巨大芽孢桿菌菌株，以及用于產(chǎn)生其的載體。
文檔編號C12N15/53GK1759175SQ200380110144
公開日2006年4月12日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月11日
發(fā)明者H·巴爾格, D·耶恩 申請人:巴斯福股份公司