專利名稱：：一種嗜堿芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種嗜堿芽孢桿菌，具體涉及一種嗜堿芽孢桿菌(S""7/ma/c"/opM^)SD7903及其及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當(dāng)微生物處于高滲環(huán)境時(shí)，多數(shù)中度嗜鹽菌可以在體內(nèi)積累小分子有機(jī)溶質(zhì)，如糖、多元醇、甜菜堿及氨基酸等，以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，這類物質(zhì)被稱為"相容性溶質(zhì)"。其中，氨基酸的衍生物四氫嘧啶(ectoine)，幾乎為所有中度嗜鹽菌的主要累積。如應(yīng)用13C-NMR、HPLC等技術(shù)，已在ifo/owo"osspp.、Sa"7/^spp.等多種嗜鹽菌中發(fā)現(xiàn)了四氫嘧啶，由此可見它對耐鹽細(xì)菌調(diào)滲功能的重要性。四氫嘧啶(1,4,5，6-tetrahydro畫2-methyl-4畫pyrimidinecarboxylicacid)，又名1，4，5，6，-四氨-2-甲基-4-嘧啶羧酸，一種環(huán)狀氨基酸，首先是在光合紫細(xì)菌的鹽生綠色外硫紅螺菌(Ectothiorhodospirahalochloris)中發(fā)現(xiàn)并得名，具有高度的可溶性和生理pH條件下的非離子特性，所以成為嗜鹽光合細(xì)菌主要的滲透壓調(diào)節(jié)劑。不僅可以維持內(nèi)外滲透壓平衡，保護(hù)細(xì)胞免受高鹽傷害，還有廣泛的抗逆保護(hù)效果，能穩(wěn)定酶蛋白、DNA和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，幫助細(xì)胞抵抗冷凍、干旱、高溫、高滲、輻射等各種逆境。目前已經(jīng)開發(fā)出許多商業(yè)用途，酶的穩(wěn)定劑、微生物的保護(hù)劑、護(hù)膚品中的保濕劑和醫(yī)學(xué)上保護(hù)化療健康細(xì)胞的保護(hù)劑等。由于四氫嘧啶很難用化學(xué)方法合成，目前國外利用一種稱為細(xì)菌泌乳的工藝(Bacterialmilking)來生產(chǎn)四氫嘧啶。其原理是利用高滲和低滲環(huán)境的反復(fù)交替來刺激菌體產(chǎn)生大量四氫嘧啶，釋放到細(xì)胞外(泌乳)。目前該工藝可應(yīng)用的菌株大多為革蘭氏陰性菌，如短桿菌(5"W6acteWMmspJCM6894)、延長鹽單胞菌0f/^/o附o"oye/o"ga^3f)、鹽月兌氣鹽單胞菌(f/ia/o附o"as/2a/o(ie""ri/ca"s)等。革蘭氏陽性菌只有海球菌(Tl^W"oco"wM52)，可以采用一次培養(yǎng)工藝進(jìn)行四氫嘧啶的生物發(fā)酵，所以一般認(rèn)為革蘭氏陽性細(xì)菌不適合細(xì)菌泌乳工藝。嗜堿芽孢桿菌DTY1(張薇等，微生物學(xué)報(bào)，2006，46(6):956-960)受鹽的誘導(dǎo)可生成四氫嘧啶，但是四氫嘧啶的產(chǎn)量不高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種嗜堿芽孢桿菌(Bacz7/^"/ca/o;Mus)SD7903，為革蘭氏陽性菌。本發(fā)明的另一目的在于提供上述嗜堿芽孢桿菌的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的還在于提供上述嗜堿芽孢桿菌(5""7/ma/ca/opM^)SD7903在生產(chǎn)四氫嘧疲方面的應(yīng)用。本發(fā)明的嗜堿芽孢桿菌(Sfl"7/wa/ca/c;p/n7w)SD7903，自山西五寨縣檸條種植區(qū)鹽堿土壤中分離，已于2009年7月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.3158。上述嗜堿芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，具體操作如下將所述嗜堿芽孢桿菌接種于NaCl濃度為0-12wt。/。的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)溫度為25-37'C的條件下，振蕩培養(yǎng)至飽和后，離心收集菌體。所述LB液體培養(yǎng)基中NaCl濃度為5-9wt%。所述LB液體培養(yǎng)基的pH為7-10。所述培養(yǎng)溫度為32-35'C。本發(fā)明所使用的LB培養(yǎng)基同生物學(xué)領(lǐng)域常用LB培養(yǎng)基相比，成分相同，僅NaCl濃度和pH不完全相同，其他成分濃度均與常用LB培養(yǎng)基相同。其中,NaCl濃度和pH如上所述。上述嗜堿芽孢桿菌(Sacz7/^"/ca/o/M^)SD7903用于生產(chǎn)四氫嘧啶。本發(fā)明菌株嗜堿芽孢桿菌SD7903具有以下微生物學(xué)特征(1)菌落形態(tài)在LB培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣整齊，表面隆起光滑，直徑0.5lmm。(2)細(xì)胞形態(tài)革蘭氏陽性菌，可運(yùn)動，菌體桿狀，大小為0.61^imx34^im，產(chǎn)芽孢，橢圓形(見圖1)。(3)生長條件可以在NaCl濃度為0-12wt^的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)生長(見圖2)，其中，最適生長的NaCl濃度為5-9wt%，最適生長溫度32-35°C，最適生長pH為7-10。(4)生理生化特征過氧化氫酶反應(yīng)陽性，甲基紅反應(yīng)陽性，可以分解吐溫60;不能水解酪氨酸，苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)、卵磷脂酶反應(yīng)、v-p反應(yīng)、精氨酸雙水解反應(yīng)陰性，不能利用檸檬酸鹽，不能合成H2S;與模式菌Bac/〃wa/ca/o;/7//1^DSM485T相比，SD7903兼性厭氧，不水解淀粉和明膠，脲酶反應(yīng)和酪蛋白反應(yīng)陰性。與嗜堿芽孢桿菌(5ac/〃^a/c"/o//n71^)DTY1(張薇等，微生物學(xué)報(bào)，2006，46(6):956-960)相比，硝酸鹽反應(yīng)陽性。SD7903能利用木糖、樹膠醛糖、蜜二糖產(chǎn)酸，能較好利用鼠李糖、阿拉伯糖、甲硫氨酸、半乳糖、乳糖、果糖、木糖、葡萄糖、麥芽糖和肌醇等碳源。本發(fā)明與S"C77/船a/ca/o;M^DSM4857相比，不能利用甘露糖產(chǎn)酸。與Bacz'〃船a/c/c|pM^DTYl相比，可以利用肌醇。具體如表l:表1SD7903生理生化試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注+表示陽性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)(5)功能特征該菌最高可以耐受12n/。NaCl高鹽環(huán)境，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模式菌5ac/〃wsa/ca—MwsDSM48575%和Ba"'〃wsa/ca/qpMwsDTY17%耐鹽度。并且表現(xiàn)出隨鹽度升高四氫嘧啶生成量增加的趨勢，在含10%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中四氫嘧啶產(chǎn)量可達(dá)到170.6mg/g'cdw。(6)抗生素抗性特征該菌對氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平均無抗性。(7)質(zhì)粒特征該菌不攜帶質(zhì)粒，避免了質(zhì)粒的不相容性，可以用作構(gòu)建具多種降解能力的基因工程菌。本發(fā)明嗜堿芽孢桿菌SD7903的16SrDNA序列測定擴(kuò)增約1.4kb的16SrDNA序列，測序鑒定結(jié)果如SEQIDNO.l所示。將其在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對，發(fā)現(xiàn)菌種SD7903與嗜堿芽孢桿菌Sa"'〃wa/c"/o//2//i具有99%同源性。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化結(jié)果和16SrDNA分子測序，確定本發(fā)明分離到的高產(chǎn)四氫嘧啶菌株為嗜堿芽孢桿菌Ba"7/wsa/ca/opMus。本發(fā)明菌株有較高的耐鹽性和四氫嘧啶合成能力，與屬于同一菌種的^^7/wa/cfl/op/2z7mDTYl相比，耐鹽性強(qiáng)且四氫嘧啶產(chǎn)量高，且是一株革蘭氏陽性菌，對目前工業(yè)上主要應(yīng)用革蘭氏陰性菌生產(chǎn)四氫嘧啶而言，拓寬了生物資源利用空間，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景；此外，本發(fā)明的菌株對氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平均無抗性，在實(shí)際使用過程中不會向環(huán)境傳遞這些耐藥因子，保證了生態(tài)安全性；且不攜帶質(zhì)粒，避免了質(zhì)粒的不相容性，可以用作構(gòu)建具多種降解能力的基因工程菌。圖1為本發(fā)明SD7903菌電鏡照片；圖2為本發(fā)明SD7903菌株在不同NaCl濃度中的生長情況；圖3為本發(fā)明SD7903菌株含有四氫嘧啶合成基因片段；其中M為1KbMarker,泳道1D7903菌株，泳道2陰性對照菌株圖4為本發(fā)明SD7903在不同鹽域環(huán)境下四氫嘧啶的合成能力。具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中培養(yǎng)基配方的比例均為重量百分比，特別標(biāo)明的除外，采用常規(guī)方法配制。實(shí)施例中一些分子生物學(xué)操作如未注明具體試驗(yàn)條件和方法，均參照SambrookJ等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)。本發(fā)明所使用的LB培養(yǎng)基同生物學(xué)領(lǐng)域常用LB培養(yǎng)基相比，成分相同，僅NaCl濃度和pH不完全相同，其他成分濃度均與常用LB培養(yǎng)基相同，其中，NaCl濃度和pH見實(shí)施例。生物學(xué)領(lǐng)域常用LB培養(yǎng)基配制常用液體LB培養(yǎng)基的配制以配制1升為例，在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解。用NaOH或HC1調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1L，高壓滅菌20min。常用固體LB培養(yǎng)基的配制以配制l升為例，在上述常用液體LB培養(yǎng)基中再加入15g瓊脂，其他同常用液體LB培養(yǎng)基的配制。實(shí)施例l:嗜堿芽孢桿菌(Bacz7/wa/ca/o/M船)SD7903的獲得該菌株自山西五寨縣擰條種植區(qū)鹽堿土壤中分離，取lg上述土樣用無菌水系列稀釋為10x、100x、1000x濃度，分別涂于含5%NaCl、PH為7.0的LB固體培養(yǎng)基，33'C培養(yǎng)5d后挑取單菌落，反復(fù)劃線直至獲得純菌，從100x稀釋土樣中篩選到本發(fā)明菌。此為第一次篩選，即使用篩選培養(yǎng)基篩選耐鹽細(xì)菌。第二次用PCR方法復(fù)篩可產(chǎn)四氫嘧啶的耐鹽細(xì)菌，CTAB法提取經(jīng)初篩的各耐鹽菌株的基因組DNA，以其為模板，設(shè)計(jì)特異性引物ectll98和ect1966，擴(kuò)增約750bp的四氫嘧啶基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢査，如有該750bp條帶，則為含四氫嘧啶合成基因，為產(chǎn)四氫嘧啶的耐鹽菌(見圖3)。引物序列如下ectl1985'-TCGATTTCTTCGCAGGTGCAGG-3'(SEQIDNO.2)ectl9665'畫GGAATGTGCCATTATGTTCGCC-3'(SEQIDNO.3)PCR反應(yīng)組分為10xPCRbuffer5^1dNTP(各2.5mM)5^1引物ectll98(l(HiM)2^1引物ectl966(1OpM)2^1gDNA(O.l嗎)lplPfuTaq(5U/jxL)0.5^1ddH2034.5^1總體積50^1PCR程序95。C變性5min,95。C40s,58。C40s，72°C1min,共30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。第三次復(fù)篩高產(chǎn)四氫嘧啶的細(xì)菌菌株。將經(jīng)前兩次篩選的耐鹽菌株接種于NaCl濃度為7wt。/。的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在160rpm，33'C的條件下，培養(yǎng)至00578約為1時(shí)，用HPLC法(具體操作見實(shí)施例6的相應(yīng)部分)檢測四氫嘧啶產(chǎn)量，最終篩選出產(chǎn)量最高的嗜堿芽孢桿菌SD7903。實(shí)施例2嗜堿芽孢桿菌(石aci7/wsa/caZop/n7ws)SD7903的16SrDNA的擴(kuò)增、測序及序列比對CTAB法提取菌株SD7903基因組DNA為模板，引物序列如下-27F5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,(SEQIDNO.4)1495R5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQIDNO.5)按照下列擴(kuò)增體系擴(kuò)增約1.4kb的片段。PCR反應(yīng)組分為10xPCRbuffer5ji1dNTP(各2.5mM)5pl引物27F(10pM)2^1引物1495R(1(^M)2^1gDNA(O.l昭)lplPfoTaq(5U4d)01ddH2034.5^1總體積50plPCR反應(yīng)程序:95。C5min;95。C40s，52。C40s，72。Clmin,共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后連接到T載體上克隆，經(jīng)藍(lán)白篩選后提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果具有序列表中SEQIDNo,l的核苷酸序列，測序公司為上海生工。應(yīng)用BLAST對序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)該菌與5ac/〃wa/ca/o//n7^DSM485T(BA16SRRX)同源性最高，達(dá)到99%。因此，參照《Bergey，sManualofDeteriminativeBacteriology》第9版禾f]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》芽孢桿菌屬特征，結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、16SrDNA基因序列相似性，鑒定菌株SD7903為嗜堿芽孢桿菌Sfl"'〃z^a/ca/op/n7ws，保藏號為CGMCCNo.3158。實(shí)施例3嗜堿芽孢桿菌(萬""7/w"/c"/opMw)SD7903的抗性檢測將該菌分別接種于含50mg/L濃度的氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平抗生素的常用LB固體培養(yǎng)基中，33"C溫箱中靜置培養(yǎng)5d，觀察菌體是否在培養(yǎng)基上生長。結(jié)果表明，該菌對氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和利福平均無抗性，在實(shí)際使用過程中不會向環(huán)境傳遞這些耐藥因子，保證了生態(tài)安全性。實(shí)施例4嗜堿芽孢桿菌(Sacz7/wsa/ca/opMw)SD7903的質(zhì)粒檢測用改進(jìn)的堿裂解法提取SD7903的質(zhì)粒。具體方法如下1、常用LB液體培養(yǎng)基33X:、160rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2、取1mL菌液裝于離心管中，4'C條件下12000r/min離心1min收集菌體；3、加入250iiL的P1溶液，振蕩懸浮沉淀；4、加入250pL的P2溶液，輕輕混勻，顛倒幾次至溶液澄清、黏稠；5、加入250的P3溶液，顛倒混勻(可稍微劇烈)至出現(xiàn)白色絮狀物，4。C條件下12000r/min離心10min;6、將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，加0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，12000r/min離心15min;7、去上清，力BlmL無水乙醇，輕混，12000r/min離心5min;8、去上清，無菌風(fēng)吹干，加20pLTE溶液溶解沉淀；9、瓊脂糖凝膠電泳分析。其中，所用試劑的配制如下.-BufferPl:在800mLMilli-Q中加入6.06gTrisbase,3.72gEDTA'2H20，用HCl調(diào)節(jié)pH至8.0,定容至1升，滅菌后4。C保存。BufferP2:在800mLMilli-Q中加入8.0gNaOH，10.0gSDS,定容至1升，不滅菌常溫保存。BufferP3:500mLMilli-Q中加入294.5g乙酸鉀，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5，定容至l升，不滅菌4"C保存。質(zhì)粒檢測結(jié)果表明，該菌不攜帶質(zhì)粒，因此降解基因編碼于染色體上。這一特性使得在利用質(zhì)粒進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移過程中，避免了質(zhì)粒的不相容性，是構(gòu)建具備多種降解能力的基因工程菌的良好材料。實(shí)施例5本發(fā)明的嗜堿芽孢桿菌SD7903的培養(yǎng)方法按表2的培養(yǎng)條件將嗜堿芽孢桿菌SD7903菌接種于含有NaCl的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在160rpm條件下，培養(yǎng)至飽和后，4T:條件下12000r/min離心1min收集菌體。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例6本發(fā)明的嗜堿芽孢桿菌SD7903生產(chǎn)四氫嘧啶的實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例5中按編號1的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的菌液，按體積百分比為1%的接種量分別將其接種于100ml,pH8，NaCl含量為1%、3%、5%、7%、9%、10%的LB液體培養(yǎng)基，于33。C，160rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)至OD578約為1，然后采用如下方法檢測不同鹽濃度條件下四氫嘧啶的生成量。檢測方法用改進(jìn)的Bligh方法(KuhlmannAU,BremerE，ApplEnvironMicrobiol,2002,68:772-783)提取菌體中四氫嘧啶。將菌體在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至ODs78約為l。離心(12000rpm，5min)收集菌體凍干，測菌體干重。用400pl抽提液(甲醇氯仿水=10:5:4)溶解菌體，猛烈振蕩30min進(jìn)行抽提。再加入等體積(約13(Hd)氯仿和水，繼續(xù)振蕩10min。離心(12000r/min,20min)分層收集水相、干燥。干燥物質(zhì)用100^il水和400^il乙腈(ACN)重新懸浮，稀釋后溶解在80%(體積比)ACN中進(jìn)行HPLC(Waters600，USA)分析。色譜柱為氨基反向色譜柱(250x4.6mm，5nm,nBondapak，USA);流動相乙腈:水(v:v)=60:40，流速1.0ml/min，柱溫25。C;檢測波長210nm;進(jìn)樣體積10pl。滯留時(shí)間約6min，結(jié)果見圖4。在l%NaCl濃度的LB培養(yǎng)基中，SD7903可產(chǎn)四氫嘧啶19.1mg/gxdw，而同種菌DTY1產(chǎn)四氫嘧啶1.4mg/g.cdw。隨鹽濃度升高，四氫嘧啶含量也逐漸升高，10。/。NaCl濃度中四氫嘧啶產(chǎn)量最高，達(dá)170.6mg/gxdw(圖4)。在相同鹽濃度的LB液體培養(yǎng)基中，本發(fā)明SD7903的四氫嘧啶生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于屬于同菌種的菌株DTY1的生成量，此外，本發(fā)明菌株還受高鹽環(huán)境的誘導(dǎo)，一定范圍內(nèi)鹽度升高，生成量也隨之增加。參考文獻(xiàn)1、張薇，胡躍高，張力群，高洪文，中度嗜鹽菌DTY1的鑒定及其耐鹽機(jī)制的初步分析，微生物學(xué)報(bào)，2006，46(6):956-9602、KuhlmannAU,BremerE.OsmoticallyregulatedsynthesisofthecompatiblesoluteectoineinBac"/ws/a他w"'z'andrelatedBacz7/z/sspp.ApplEnvironMicrobiol,2002,68:772-783SEQUENCELISTING<110>華北電力大學(xué)<120>—種嗜堿芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用<130>33<160>5<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>1437<212>DNA<213>Bacillusalcalophilus<400>1gagcgaaccaaagggagcttgctcccagaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgg60gcaacctgccctgtagattgggataacatcgagaaatcggtgctaataccggataatcaa120ttgaatcacatggtttgattgtaaaagatggctccggctatcactacgggatgggcccgc180ggcgcattagctagttggtaaggtaatggcttaccaaggcgacgatgcgtagccgacctg240agagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300tagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaagg360ttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcgaataggtcggca420ccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatac480gtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtcttttaa540gtctgatgtgaaatctcggggctcaaccccgagcggtcattggaaactgggagacttgag600tacagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagatatgtggaggaa660caccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtgggg720agcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttag780gggtttcgatgcccttagtgccgaagttaacacattaagcactccgcctggggagtacga840ccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagtggagcatgtggt900ttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagag960atagagctttccccttcgggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgt1020gtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagca1080tttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgt1140caaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagg1200gcagcaaaaccgcgaggtcgagccaatcccataaagccattctcagttcggattgtaggc1260tgcaactcgcctacatgaagccggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtga1320atacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaa1380gtcggtggggtaaccttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggtg1437<210>2<211〉22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴(kuò)增四氫嘧啶基因的上游引物<400>2tcgatttcttcgcaggtgcagg22<210>3<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴(kuò)增四氫嘧嚏基因的下游引物<400>3ggaatgtgccattatgttcgcc22<210>4<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴(kuò)增SD7903基因組DNA上游引物<400>4gagagtttgatcctggctcag<210>5<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴(kuò)增SD7903基因組DNA下游引物<400>5ctacggctaccttgttacga權(quán)利要求1、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)SD7903CGMCCNo.3158。2、權(quán)利要求1所述嗜堿芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，將所述嗜堿芽孢桿菌接種于NaCl濃度為0-12wt。/。的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)溫度為25-37°C的條件下，振蕩培養(yǎng)至飽和后，離心收集菌體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基中NaCl濃度為5-9wt%。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基的pH為7-10。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溫度為32-35'C。6、權(quán)利要求1所述嗜堿芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，所述嗜堿芽孢桿菌用于生產(chǎn)四氫嘧啶。全文摘要本發(fā)明公開了一種屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)SD7903，保藏號為CGMCCNo.3158，本發(fā)明還公開了該菌株的培養(yǎng)方法以及該菌株在生產(chǎn)四氫嘧啶方面的應(yīng)用，該菌具有較高的四氫嘧啶合成能力，且是一株革蘭氏陽性菌，對目前工業(yè)上主要應(yīng)用革蘭氏陰性菌生產(chǎn)四氫嘧啶而言，拓寬了生物資源利用空間，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。文檔編號C12N1/20GK101597581SQ20091008822公開日2009年12月9日申請日期2009年7月13日優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日發(fā)明者薇張申請人:華北電力大學(xué)