本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一涉及基因重組與轉(zhuǎn)染方法的研究，同時(shí)涉及目的蛋白的表達(dá)及其功能驗(yàn)證，具體涉及一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一類(lèi)存在于線粒體內(nèi)外膜之間的保守的黃素蛋白，可誘導(dǎo)Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的長(zhǎng)度為2.4kb，編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)有三個(gè)不同長(zhǎng)度的可變剪接體，它們的氨基酸數(shù)分別為613、609和326。除可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，AIF兼具氧化還原酶的活性。
當(dāng)細(xì)胞受到特定的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打開(kāi)，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并進(jìn)入細(xì)胞核中，和另一個(gè)線粒體蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂成50kb大小的片段
在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程時(shí)，AIF有兩個(gè)方面的作用：一是可以作為細(xì)胞凋亡的起始因子，二是可以作為細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)因子。在正常的情況下，AIF存在于線粒體中，可以清除細(xì)胞內(nèi)的自由基從而阻止細(xì)胞凋亡；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后。AIF首先從線粒體出來(lái)，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，最后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
內(nèi)皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一個(gè)被糖基化修飾的80.9KDa的蛋白核心區(qū)組成，修飾后成熟的糖蛋白大約在175KDa。TEM1是近期發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)腫瘤標(biāo)記物之一，其對(duì)腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)血管生成浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有重要作用。
TEM1外部分由五個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域(N端的C型凝集素結(jié)構(gòu)域，壽司樣結(jié)構(gòu)域，和三個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣重復(fù))和一個(gè)粘蛋白樣區(qū)組成，其中核心蛋白大量唾液酸化與血栓調(diào)節(jié)蛋白相似。對(duì)于成體組織，TEM1的表達(dá)分布是這樣的：子宮>腎小球>輸卵管血管>心和肺>其他組織；另外，在內(nèi)皮祖細(xì)胞中TEM1表達(dá)量相對(duì)很少。然而，在以下腫瘤中TEM1都有高表達(dá)，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結(jié)腸癌，且實(shí)驗(yàn)表明在卵巢癌中，TEM1表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、預(yù)后密切相關(guān)。因此，TEM1在正常組織不表達(dá)或者低表達(dá)，而在腫瘤血管組織高表達(dá)的特點(diǎn)，預(yù)示了TEM1作為腫瘤診斷和治療的靶標(biāo)分子的潛力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中天然結(jié)構(gòu)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子AIF對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊缺乏靶向作用。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種AIF與抗體偶聯(lián)的靶向抗腫瘤藥物。
本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是在獲得了整合有AIF-單鏈抗體復(fù)合物的表達(dá)基因的重組質(zhì)粒的情況下，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)此類(lèi)質(zhì)粒的表達(dá)方法操作繁瑣、蛋白表達(dá)水平較低。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達(dá)基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表達(dá)基因，分別通過(guò)酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coli Top10中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；
3)分別收集步驟2)擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；
4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。
作為優(yōu)選，所述T18-AIF表達(dá)基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
作為優(yōu)選，所述AIF表達(dá)基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
作為優(yōu)選，步驟1)所述酶切方式是經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質(zhì)粒中。
作為優(yōu)選，步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株，是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
作為優(yōu)選，HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000～12000個(gè)/孔；HEK293-T細(xì)胞與載體菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。
作為優(yōu)選，所述針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
在以上技術(shù)方案中，所述Abvec-Igk質(zhì)粒明確限定為：NCBI GenBank中編號(hào)為FJ475056的質(zhì)粒，該質(zhì)粒的基因序列如SEQ ID No.3所示。因此本發(fā)明中所述Abvec-Igk質(zhì)粒不具有其他指向作用或概況作用。
在以上技術(shù)方案中，所述T18是一種特異性識(shí)別TEM1的單鏈抗體，該抗體的名稱(即T18)屬于自創(chuàng)詞匯。所述T18-Aif表達(dá)基因是指整合有Aif表達(dá)基因的重組單鏈抗體T18的表達(dá)基因。作為一種自創(chuàng)詞匯，T18-Aif表達(dá)基因的技術(shù)特征是由序列如SEQ ID No.1所示的DNA表征的；在知曉該具體序列的情況下，T18-Aif表達(dá)基因可以通過(guò)本領(lǐng)域中常規(guī)的DNA合成方法獲得，當(dāng)然也可以利用以上優(yōu)選技術(shù)方案中所披露的PCR方法獲得。
本發(fā)明提供了一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，該技術(shù)方案依托于一種特異性識(shí)別TEM1蛋白的單鏈抗體，結(jié)合減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009的腫瘤內(nèi)特異性聚集及胞內(nèi)侵襲的特性，攜帶細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子Aif達(dá)到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來(lái)看，本發(fā)明首先構(gòu)建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T18-Aif重組質(zhì)粒，經(jīng)擴(kuò)增后通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株，利用減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌胞內(nèi)侵襲的特性，以HEK293-T細(xì)胞為宿主實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，最后利用含青霉素、鏈霉素的血清培養(yǎng)基殺死細(xì)胞內(nèi)外的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌，使重組質(zhì)粒釋放至真核細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，該上清液即屬于本發(fā)明所述藥物的一種存在形式，當(dāng)然也可以通過(guò)常規(guī)的分離方式加以純化后，進(jìn)行其他劑型的制備。
本發(fā)明中，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期篩選的單鏈抗體T18作為生物導(dǎo)航，可結(jié)合人類(lèi)TEM1抗原，親和力強(qiáng)，特異性高。通過(guò)T18與人源化毒素Aif的融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡的最終目的。
同時(shí)，本發(fā)明以減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009作為治療載體，綜合應(yīng)用了減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌胞內(nèi)侵襲的特性和特異性聚集在實(shí)體瘤中的性質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)大了本發(fā)明中腫瘤殺傷的特異性。
此外，本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在以下方面：
1、與當(dāng)下流行的ADC藥物相比，本研究所用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除了具備抗體本身的靶向作用，其宿主菌VNP20009可特異性定植于腫瘤，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009具有兩個(gè)靶向腫瘤的彈頭，其特異性靶向腫瘤的作用較當(dāng)下流行的ADC更為準(zhǔn)確；
2、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009屬于活菌，只需按照常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法即可獲得大量的菌體用于腫瘤治療；而當(dāng)下流行的ADC藥物需要昂貴的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、繁瑣的抗體表達(dá)和純化步驟、需要潔凈度極高的GMP車(chē)間以及后期難度高的毒素偶聯(lián)技術(shù)。因此，本發(fā)明使用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除具有比ADC藥物更高的療效外，起生產(chǎn)成本可能僅為ADC藥物的千分之一甚至萬(wàn)分之一。
3、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009攜帶的抗體為全人源化抗體，毒素也為全人源化毒素，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009表達(dá)的毒蛋白為全人源化蛋白，與人體無(wú)任何排斥性，安全性高且半衰期長(zhǎng)。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明具體實(shí)施方式中T18-Aif、Aif對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果評(píng)價(jià)圖。
具體實(shí)施方式
以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1
根據(jù)人源化毒素Aif合成基因片段，通過(guò)PCR方法將實(shí)驗(yàn)室可特異識(shí)別腫瘤標(biāo)志物TEM1的單鏈抗體片段T18擴(kuò)增。之后將Aif和T18一同或者單獨(dú)構(gòu)建入Abvec-Igk載體，獲得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif和Abvec-Igk-Aif。
將-80℃保存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009劃線接種于無(wú)抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單個(gè)菌落于5ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；按1：100比例接種于100ml LB中振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀用1/10體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌兩次，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀再次用1/100體積預(yù)冷的10％甘油洗滌菌體，4℃3000rpm離心10min；將菌體沉淀重懸于1/100體積預(yù)冷的10％甘油中，制成VNP20009感受態(tài)分裝后-80℃留存?zhèn)溆谩?/p>
將已獲得的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif電轉(zhuǎn)進(jìn)入減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009中，采用0.1cm電轉(zhuǎn)杯，條件設(shè)置為：1.8kv 200Ω25uF，電轉(zhuǎn)4.7ms；通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆，獲得重組減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，命名為Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009。
將HEK293T細(xì)胞與Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009按1:50～200比例混合培養(yǎng)后，待細(xì)胞破碎后獲取細(xì)胞混合液上清，即含有T18-Aif、Aif蛋白的上清。
將TEM1陰性細(xì)胞和陽(yáng)性細(xì)胞按照10000/孔，接種于24孔板(采用不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基)，將T18-Aif、Aif蛋白的上清與原培養(yǎng)液上清按1:1與分別加入24孔板中，總體積400μL，培養(yǎng)1-4天，觀察T18-Aif、Aif對(duì)TEM1對(duì)陰陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷效果。如圖1所示，T18-Aif對(duì)TEM1陽(yáng)性細(xì)胞殺傷明顯，對(duì)TEM1陰性細(xì)胞無(wú)殺傷效果；Aif蛋白對(duì)TEM1陰陽(yáng)性細(xì)胞均無(wú)殺傷效果。
實(shí)施例2
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達(dá)基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表達(dá)基因，分別通過(guò)酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coli Top10中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；
3)分別收集步驟2)擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；
4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40h，而后破碎細(xì)胞收集上清。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
所述T18-AIF表達(dá)基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
所述AIF表達(dá)基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
步驟1)所述酶切方式是經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質(zhì)粒中。
步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株，是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，35℃振蕩培養(yǎng)10h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.4；
D)冰浴15min后，離心取沉淀用1/8體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)的甘油中。
HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000個(gè)/孔；HEK293-T細(xì)胞與載體菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380μL。
所述針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
實(shí)施例3
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達(dá)基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表達(dá)基因，分別通過(guò)酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coli Top10中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；
3)分別收集步驟2)擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；
4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
所述AIF表達(dá)基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株，是通過(guò)以下方法制備的：
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；
B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.7；
D)冰浴25min后，離心取沉淀用1/12體積預(yù)冷的無(wú)菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)的甘油中。
HEK293-T細(xì)胞的加入量為12000個(gè)/孔；HEK293-T細(xì)胞與載體菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為420μL。
實(shí)施例4
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達(dá)基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表達(dá)基因，分別通過(guò)酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coli Top10中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增；
3)分別收集步驟2)擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過(guò)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；
4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)10h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，而后破碎細(xì)胞收集上清。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大學(xué)
<120> 一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實(shí)體瘤藥物的制備方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2376
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttagggctga caccagaaca gaaacagaaa aaggccgcgt tatctgcttc agaaggagag 60
gaagttcctc aagacaaggc gccaagtcat gttcctttcc tgctaattgg tggaggcaca 120
gctgcttttg ctgcagccag atccatccgg gctcgggatc ctggggccag ggtactgatt 180
gtatctgaag atcctgagct gccgtacatg cgacctcctc tttcaaaaga actgtggttt 240
tcagatgacc caaatgtcac aaagacactg cgattcaaac agtggaatgg aaaagagaga 300
agcatatatt tccagccacc ttctttctat gtctctgctc aggacctgcc tcatattgag 360
aatggtggtg tggctgtcct cactgggaag aaggtagtac agctggatgt gagagacaac 420
atggtgaaac ttaatgatgg ctctcaaata acctatgaaa agtgcttgat tgcaacagga 480
ggtactccaa gaagtctgtc tgccattgat agggctggag cagaggtgaa gagtagaaca 540
acgcttttca gaaagattgg agactttaga agcttggaga agatttcacg ggaagtcaaa 600
tcaattacga ttatcggtgg gggcttcctt ggtagcgaac tggcctgtgc tcttggcaga 660
aaggctcgag ccttgggcac agaagtgatt caactcttcc ccgagaaagg aaatatggga 720
aagatcctcc ccgaatacct cagcaactgg accatggaaa aagtcagacg agagggggtt 780
aaggtgatgc ccaatgctat tgtgcaatcc gttggagtca gcagtggcaa gttacttatc 840
aagctgaaag acggcaggaa ggtagaaact gaccacatag tggcagctgt gggcctggag 900
cccaatgttg agttggccaa gactggtggc ctggaaatag actcagattt tggtggcttc 960
cgggtaaatg cagagctaca agcacgctct aacatctggg tggcaggaga tgctgcatgc 1020
ttctacgata taaagttggg aaggaggcgg gtagagcacc atgatcacgc tgttgtgagt 1080
ggaagattgg ctggagaaaa tatgactgga gctgctaagc cgtactggca tcagtcaatg 1140
ttctggagtg atttgggccc cgatgttggc tatgaagcta ttggtcttgt ggacagtagt 1200
ttgcccacag ttggtgtttt tgcaaaagca actgcacaag acaaccccaa atctgccaca 1260
gagcagtcag gaactggtat ccgatcagag agtgagacag agtccgaggc ctcagaaatt 1320
actattcctc ccagcacccc ggcagttcca caggctcccg tccaggggga ggactacggc 1380
aaaggtgtca tcttctacct cagggacaaa gtggtcgtgg ggattgtgct atggaacatc 1440
tttaaccgaa tgccaatagc aaggaagatc attaaggacg gtgagcagca tgaagatctc 1500
aatgaagtag ccaaactatt caacattcat gaagacgaat tcgcgggtaa tcgtgtgcgt 1560
cgctctgttg gtcttaaggg tggtggaggt ggttctggtg gtggaggttc tggtggtggt 1620
ggatctggcc agcttgtgct gactcagcca ccttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1680
gccagtctca cctgcacctt acgcagtgac atcaatgttg gttcctacag gatatcctgg 1740
taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga gctacaaatc agactcagat 1800
aagcagaagg gctctggagt ccccagccgc ttctctggat ccaaagatgc ttcggccaat 1860
gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttattgtatg 1920
atttggcaca acagcgctgg ggtgttcggc gggggcacca agctgaccgt cctaggcggt 1980
ggttcctcta gatcttcctc ctctggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gcaggtgcag 2040
ctgcaggagt cgggaggaac cttggtacag cctggggggt ccctgagact ctcttgtgaa 2100
gcctctggat tcacctttag caactatgcc atgggctggg tccgccagac tccaggaaag 2160
gggctggagt ggctgtcggc tattcgtaaa agtggcacta ccacatacta cgcggactcc 2220
gtgaagggcc ggttcatcat ctccagagac aattccaaga acaccctgta tctgcaaatg 2280
aataggctga gagtcggcga cacggccact tattactgtg cgactcaccc catcgcgggc 2340
tactggggcc agggaagcct ggtcactgtc tcctcc 2376
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagggctga caccagaaca gaaacagaaa aaggccgcgt tatctgcttc agaaggagag 60
gaagttcctc aagacaaggc gccaagtcat gttcctttcc tgctaattgg tggaggcaca 120
gctgcttttg ctgcagccag atccatccgg gctcgggatc ctggggccag ggtactgatt 180
gtatctgaag atcctgagct gccgtacatg cgacctcctc tttcaaaaga actgtggttt 240
tcagatgacc caaatgtcac aaagacactg cgattcaaac agtggaatgg aaaagagaga 300
agcatatatt tccagccacc ttctttctat gtctctgctc aggacctgcc tcatattgag 360
aatggtggtg tggctgtcct cactgggaag aaggtagtac agctggatgt gagagacaac 420
atggtgaaac ttaatgatgg ctctcaaata acctatgaaa agtgcttgat tgcaacagga 480
ggtactccaa gaagtctgtc tgccattgat agggctggag cagaggtgaa gagtagaaca 540
acgcttttca gaaagattgg agactttaga agcttggaga agatttcacg ggaagtcaaa 600
tcaattacga ttatcggtgg gggcttcctt ggtagcgaac tggcctgtgc tcttggcaga 660
aaggctcgag ccttgggcac agaagtgatt caactcttcc ccgagaaagg aaatatggga 720
aagatcctcc ccgaatacct cagcaactgg accatggaaa aagtcagacg agagggggtt 780
aaggtgatgc ccaatgctat tgtgcaatcc gttggagtca gcagtggcaa gttacttatc 840
aagctgaaag acggcaggaa ggtagaaact gaccacatag tggcagctgt gggcctggag 900
cccaatgttg agttggccaa gactggtggc ctggaaatag actcagattt tggtggcttc 960
cgggtaaatg cagagctaca agcacgctct aacatctggg tggcaggaga tgctgcatgc 1020
ttctacgata taaagttggg aaggaggcgg gtagagcacc atgatcacgc tgttgtgagt 1080
ggaagattgg ctggagaaaa tatgactgga gctgctaagc cgtactggca tcagtcaatg 1140
ttctggagtg atttgggccc cgatgttggc tatgaagcta ttggtcttgt ggacagtagt 1200
ttgcccacag ttggtgtttt tgcaaaagca actgcacaag acaaccccaa atctgccaca 1260
gagcagtcag gaactggtat ccgatcagag agtgagacag agtccgaggc ctcagaaatt 1320
actattcctc ccagcacccc ggcagttcca caggctcccg tccaggggga ggactacggc 1380
aaaggtgtca tcttctacct cagggacaaa gtggtcgtgg ggattgtgct atggaacatc 1440
tttaaccgaa tgccaatagc aaggaagatc attaaggacg gtgagcagca tgaagatctc 1500
aatgaagtag ccaaactatt caacattcat gaagac 1536
<210> 3
<211> 4756
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 360
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 540
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600
ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 660
caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt 720
gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta 780
gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 840
tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900
acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 960
agcaactgca accggtgtac actcgagcgt acgaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 1020
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1080
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1140
tctggatcga tcgggaatta attcggcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga 1200
ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta 1260
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 1320
tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 1380
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1440
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 1500
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 1560
ggcctaggct tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 1620
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg 1680
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgtagcc 1740
tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 1800
accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 1860
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 1920
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 1980
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 2040
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 2100
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 2160
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 2220
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 2280
tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta 2340
tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2400
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2460
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 2520
cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2580
tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2640
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2700
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 2760
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2820
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2880
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2940
tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3000
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3060
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3120
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3180
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3240
gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3300
gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3360
gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 3420
gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3480
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3540
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3600
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 3660
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 3720
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 3780
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3840
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 3900
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 3960
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4020
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4080
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 4140
cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 4200
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 4260
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 4320
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 4380
tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 4440
accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 4500
gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 4560
attcattaat ccagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4620
gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 4680
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 4740
catgattacg aattaa 4756
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgtcgagtc gaaccggttg ggaagcggca ctgg 34
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcgtgctca ccgtacgtta ggaggagacg gtgaccag 38
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcgtgctca ccgtacgtta gtcttcatga atgttgaata g 41