本發(fā)明屬于合成生物學(xué)和生物能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以大腸桿菌MG1655為研究對(duì)象，根據(jù)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)檢測(cè)和分析確定大腸桿菌異丁醇合成菌株殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的限制因素后，利用合成生物學(xué)方法異源表達(dá)來自運(yùn)動(dòng)單胞菌的ED糖代謝途徑，同時(shí)利用人工啟動(dòng)子進(jìn)行ED途徑上下游的匹配調(diào)節(jié)，最終獲得一株高效低殘?zhí)前l(fā)酵異丁醇的大腸桿菌合成菌株的方法。

背景技術(shù)：

異丁醇作為重要的平臺(tái)化合物，廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域，具有能量密度高、辛烷值高、揮發(fā)性和腐蝕性小等優(yōu)點(diǎn)。與第一代燃料乙醇相比，生物基異丁醇具有高的的可再生能源標(biāo)示數(shù)(RNI)是理想的汽油添加劑或替代品。目前異丁醇生物合成研究主要從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，大部分集中于異丁醇產(chǎn)量最大化和廉價(jià)原料多樣化方面的菌株構(gòu)建與改造，本課題組利用合成生物學(xué)方法設(shè)計(jì)異源Erhlich途徑，以α-酮戊二酸為前體物質(zhì)并且耦合分支氨基酸合成途徑，構(gòu)建了一株高產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌工程菌株E.coli LA09(聞建平；劉蛟；齊海山。一種基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)的異丁醇合成菌株構(gòu)建方法[P]。中國專利：CN104630250A，2014-12-23)。

殘?zhí)?，即生物發(fā)酵完成后未能利用葡萄糖以及其他糖類底物原料，是生物燃料工業(yè)生產(chǎn)中重要的控制指標(biāo)，發(fā)酵過程中殘?zhí)呛窟^高會(huì)導(dǎo)致代謝流量發(fā)生遷移從而影響產(chǎn)物的積累。相比于將發(fā)酵液中殘?zhí)腔厥赵倮茫岣呱锖铣芍袣執(zhí)寝D(zhuǎn)化和降低殘?zhí)菨舛仁歉鉀Q的關(guān)鍵技術(shù)問題。與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝優(yōu)化和菌種篩選的方法相比(孫東平；梁光蕓；自強(qiáng)；顧炎；陳春濤；孫汴京；楊加志。一種以葡萄糖酸作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化方法[P]。中國專利：CN201610584286.1，2016-07-22。王倩；劉好寶；蘇玉龍。耐受高濃度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No10671及其應(yīng)用[P]。中國專利：CN201510579109.X，2015-09-06)，大多研究人員為了提高碳源底物利用效率傾向于采用基因工程調(diào)控糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)增強(qiáng)對(duì)碳源物質(zhì)的耐受性及吸收速率(R.R.-于克莫；A.C.科拉德；T.赫爾曼；喻曉輝；龔巍。利用用于糖輸入的易化擴(kuò)散生產(chǎn)琥珀酸和其他化學(xué)品的方法[P]。中國專利：CN201480041525.8，2014-07-22)，從而忽視了細(xì)胞內(nèi)整體新陳代謝過程對(duì)碳源吸收利用的影響機(jī)理。雖然以上這些方法雖然在一定程度上提高原料的利用效率，但是并不能徹底解決發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛冗^高的問題。

目前針對(duì)殘?zhí)乾F(xiàn)象的機(jī)制研究未發(fā)現(xiàn)有足夠的專利報(bào)道。因此為了實(shí)現(xiàn)異丁醇發(fā)酵單位最大化同時(shí)殘?zhí)菨舛刃∮?g/L的目標(biāo)，僅依賴提高菌株的糖吸收效率是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，如何源頭上提高胞內(nèi)糖轉(zhuǎn)化效率是即本發(fā)明需要解決的關(guān)鍵問題。針對(duì)上述情況本發(fā)明創(chuàng)新性地提出了一種基于合成生物學(xué)理論的解決方案：即確定異丁醇生物合成菌株中限制殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，然后針對(duì)限速途徑進(jìn)行合成生物學(xué)改造，并通過反復(fù)修飾與調(diào)節(jié)，直到在異丁醇生產(chǎn)最大化的條件下實(shí)現(xiàn)殘?zhí)菨舛刃∮?g/L為止。

本發(fā)明是以課題組構(gòu)建的高效異丁醇合成菌株E.coli LA09(專利號(hào)CN201410814025.5)為出發(fā)菌株，通過代謝組學(xué)得出在殘?zhí)寝D(zhuǎn)化過程中的限制因素為胞內(nèi)的6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6－二磷酸果糖這一代謝步驟，本發(fā)明通過降低糖酵解途徑的碳代謝通量從而緩解該限速步驟的胞內(nèi)壓力，首次采用合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)了來自運(yùn)動(dòng)單胞菌的異源人工Entner-Doudoroff(ED)糖代謝途徑，并以人工啟動(dòng)子對(duì)ED上下游途徑進(jìn)行適配性表達(dá)調(diào)節(jié)，降低有毒中間代謝物2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，最終獲得了一株高效低殘?zhí)前l(fā)酵異丁醇的大腸桿菌合成菌株。本發(fā)明所提供的基于合成生物學(xué)控制元件對(duì)提高殘?zhí)寝D(zhuǎn)化效率的研究未見有專利報(bào)道，因此本發(fā)明為指導(dǎo)構(gòu)建高效低殘?zhí)堑墓I(yè)異丁醇合成菌株提供了重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)高產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌合成菌株中殘?zhí)寝D(zhuǎn)化效率較低這一關(guān)鍵問題，提供了一種基于合成生物學(xué)方法設(shè)計(jì)一系列人工異源ED糖代謝元件以構(gòu)建高效低殘?zhí)前l(fā)酵的大腸桿菌異丁醇合成菌株的方法，該發(fā)明對(duì)于提高原料利用率和產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用了如下技術(shù)方案：

一種基于高效低殘?zhí)前l(fā)酵合成異丁醇的大腸桿菌合成菌株的理性構(gòu)建方法，其具體步驟如下：

(1)以大腸桿菌MG1655為宿主，按照本課題組申請(qǐng)的專利中所述的方法構(gòu)建高產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌E.coli LA09(專利號(hào)為CN201410814025.5)。

(2)以高產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌E.coli LA09為研究對(duì)象，在不同濃度的初始葡萄糖濃度下分批發(fā)酵，采用代謝組學(xué)方法確定胞內(nèi)的6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖這一代謝步驟為殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的關(guān)鍵的限制因素。

(3)根據(jù)步驟(2)獲得的限速步驟，利用對(duì)胞內(nèi)的糖代謝通量進(jìn)行分流以緩解限速步驟對(duì)細(xì)胞殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的方法，通過合成生物學(xué)方法理性設(shè)計(jì)了來自運(yùn)動(dòng)單胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4的異源人工ED糖代謝途徑上下游片段，并結(jié)合合成生物學(xué)方法以人工啟動(dòng)子對(duì)ED上下游途徑進(jìn)行匹配調(diào)節(jié)。

(4)通過基因重組構(gòu)建一株能夠高效低殘?zhí)前l(fā)酵異丁醇的大腸桿菌合成菌株E.coli ED。

(5)將構(gòu)建的大腸桿菌E.coli ED進(jìn)行發(fā)酵合成異丁醇，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)菨舛刃∮?g/L，試驗(yàn)證明該合成菌株能夠用于高效低殘?zhí)前l(fā)酵合成異丁醇。

具體方法為：

(1)根據(jù)本課題組申請(qǐng)公開的專利(專利號(hào)CN201410814025.5)中所述的方法成功構(gòu)建高產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌合成菌株E.coli LA09，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的研究。

(2)以異丁醇合成菌株E.coli LA09為研究對(duì)象，開展一系列初始糖濃度由小到大分別為35、40、45、50、55和60g/L的分批發(fā)酵試驗(yàn)，采用GC-MS和LC-MS定性檢測(cè)異丁醇合成菌株的胞內(nèi)代謝物，并借助KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物分類，通過PCA方法和載荷圖等方法理性分析異丁醇合成菌株胞內(nèi)糖分解代謝物變化特征。采用的軟件平臺(tái)MATLAB R2008b進(jìn)行主成成分析，得出關(guān)鍵標(biāo)志物，對(duì)關(guān)鍵標(biāo)志物所處的代謝途徑進(jìn)行胞內(nèi)濃度比較分析，得出殘?zhí)寝D(zhuǎn)化具體的限制步驟。為6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖途徑。

(3)以運(yùn)動(dòng)單胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4基因組為模板，分別構(gòu)建由不同啟動(dòng)子控制人工ED糖代謝上下游途徑片段，其中上游片段是由編碼glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase的ZM4-ZMf基因(片段ZMO0367，序列號(hào)為SEQ ID NO：3)和編碼6-phosphogluconolactonase的ZM4-pgl基因(片段ZMO1478，序列號(hào)為SEQ ID NO：4)組成，而下游片段則由編碼6-phosphogluconate dehydratase的ZM4-edd基因(片段ZMO0368，序列號(hào)為SEQ ID NO：1)和編碼2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase的ZM4-eda基因(片段ZMO0997，序列號(hào)為SEQ ID NO：2)組成。

人工ED代謝下游途徑的構(gòu)建：以運(yùn)動(dòng)單胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4基因組為模板，以z368-F/z368-R(引物序列內(nèi)含有啟動(dòng)子BBa_J23119序列)、z997-F/z997-R兩個(gè)引物對(duì)(引物序列編號(hào)分別為SEQ ID No：10和SEQ ID No：10)通過PCR擴(kuò)增出帶啟動(dòng)子BBa_J23119(來源于iGEM的人工標(biāo)準(zhǔn)元件庫)的ZMO0368基因片段和ZMO0997基因片段(基因序列編號(hào)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，以XER2-F/XER2-R引物對(duì)(引物序列編號(hào)SEQ ID NO：12)，以pUCxer質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶dif位點(diǎn)的慶大霉素抗性片段。采用融合PCR方法將這三個(gè)片段整合成一個(gè)BBa_J23119啟動(dòng)子控制下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif操縱子片段。采用ack-pta-F1/ack-pta-R同源臂引物(引物序列編號(hào)SEQ ID NO：9)擴(kuò)增該整合片段，獲得ED下游途徑突變盒片段。

人工ED糖代謝上游途徑構(gòu)建：以Z.mobilis ZM4基因組為模板，以z367-F/z367-R(引物序列內(nèi)含有啟動(dòng)子BBa_J23118序列)、z1487-F/z1487-R兩個(gè)引物對(duì)(引物序列編號(hào)分別為SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)，擴(kuò)增出帶BBa_J23118啟動(dòng)子(來源于iGEM的人工標(biāo)準(zhǔn)元件庫)的ZMO0367和ZMO1487基因片段(序列編號(hào)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，以XER-F/XER-R為引物(引物序列編號(hào)為SEQ ID NO：8)，以pUCxer質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶dif位點(diǎn)的慶大霉素抗性片段。以融合PCR將這三個(gè)片段整合成一個(gè)BBa_J23118啟動(dòng)子控制下的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif操縱子片段，然后采用ldh-F1/ldh-R同源臂引物(引物序列編號(hào)SEQ ID NO：5)擴(kuò)增該片段，獲得ED上游途徑突變盒片段。

(4)根據(jù)不同強(qiáng)度的人工啟動(dòng)子分別調(diào)節(jié)人工ED途徑的上下游部分，將ED下游途徑突變盒片段電轉(zhuǎn)化進(jìn)入已誘導(dǎo)重組酶的E.coli LA09的感受態(tài)中，通過慶大霉素抗性篩選，獲得同源重組陽性轉(zhuǎn)化子E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)。將ED上游途徑突變盒片段電轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受態(tài)中，獲得同源重組陽性轉(zhuǎn)化子E.coli LA09ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)，最終構(gòu)建獲得了攜帶整個(gè)人工ED途徑的異丁醇合成菌株E.coli ED。

(5)對(duì)E.coli ED進(jìn)行批次發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法構(gòu)建的菌株達(dá)到殘?zhí)切∮?g/L的預(yù)期目標(biāo)，說明該方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

低殘?zhí)钱惗〈己铣删闑.coli ED的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為250rpm，當(dāng)細(xì)胞OD600增長到0.7時(shí)，加入0.1～1mM的IPTG進(jìn)行異丁醇誘導(dǎo)，后續(xù)培養(yǎng)條件為30℃,200rpm。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：45g/L葡萄糖、5g/L酵母浸粉、1000稀釋的Trace mix A5微量元素母液、100μg/ml氨卡青霉素、20μg/ml氯霉素、17g/L Na₂HPO₄·12H₂O、3g/L KH₂PO₄、0.5g/L NaCl、1g/L NH₄Cl、0.24g/L MgSO₄和0.011g/L CaCl₂。Trace mix A5微量元素母液成分為2.86g/L H₃BO₃、1.81g/L MnCl₂·4H₂O、0.222g/L ZnSO₄·7H₂O、0.39g/L NaMoO₄·2H₂O、0.079g/L CuSO₄·5H₂O和49.4mg/L Co(NO₃)₂·6H₂O。

本發(fā)明獲得的高效低殘?zhí)钱惗〈己铣删闑.coli ED，以45g/L初始葡萄糖濃度經(jīng)30h完成發(fā)酵，異丁醇產(chǎn)量達(dá)到13.67g/L，比E.coli LA09(8.74g/L)提升了56％，發(fā)酵殘?zhí)菨舛葹?.87g/L，達(dá)到了殘?zhí)菨舛刃∮?g/L的目標(biāo)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)當(dāng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中菌株Z.mobilis ZM4、E.coli MG1655、質(zhì)粒pKD46和質(zhì)粒pUCxer均有市售。以下實(shí)施例中未注明的具體的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》中所述的方法或者廠商提供的方法進(jìn)行。

實(shí)施例1異丁醇合成菌株LA09的構(gòu)建和影響殘?zhí)寝D(zhuǎn)化的限速步驟解析

(1)異丁醇合成菌株LA09的構(gòu)建嚴(yán)格按照專利CN201410814025.5所述的方法進(jìn)行。

(2)以異丁醇合成菌株LA09為研究對(duì)象，開展一系列初始糖濃度由小到大分別為35、40、45、50、55和60g/L的分批發(fā)酵試驗(yàn)，確定異丁醇合成菌株LA09最優(yōu)初始葡萄糖濃度為45g/L。培養(yǎng)方法：在培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為250rpm條件下培養(yǎng)細(xì)菌，當(dāng)細(xì)胞OD600增長到0.6～0.8時(shí)，加入0.1～1mM的IPTG進(jìn)行異丁醇誘導(dǎo)，后續(xù)培養(yǎng)條件為30℃，200rpm。

(3)提取細(xì)胞內(nèi)外的代謝物進(jìn)行GC-MS和LC-MS分析，通過GC-MS系統(tǒng)內(nèi)置軟件對(duì)得到的總離子流圖中的每個(gè)代謝物峰進(jìn)行峰面積自動(dòng)積分與手動(dòng)修正,可得到各個(gè)代謝物原始峰面積數(shù)據(jù)，并識(shí)別計(jì)算內(nèi)標(biāo)代謝物的峰面積數(shù)據(jù)。LC-MS數(shù)據(jù)則參照平臺(tái)自建的標(biāo)準(zhǔn)品圖庫進(jìn)行定性分析，采用Analyst software進(jìn)行分析，獲得每個(gè)代謝物和內(nèi)標(biāo)物的原始峰面積數(shù)據(jù)。將每個(gè)代謝物的原始峰面積除以樣品干重，并除以相應(yīng)圖譜中內(nèi)標(biāo)物峰面積，得到標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)。然后通過歸一化和尺度化的計(jì)算，采用的軟件平臺(tái)MATLAB R2008b進(jìn)行主成成分析，得出關(guān)鍵標(biāo)志物，對(duì)關(guān)鍵標(biāo)志物所處的代謝途徑進(jìn)行胞內(nèi)濃度比較分析，得出殘?zhí)寝D(zhuǎn)化具體的限制步驟。

實(shí)施例2人工ED上下游途徑片段的構(gòu)建

(1)以運(yùn)動(dòng)單胞菌Z.mobilis ZM4的ED下游途徑基因片段ZMO0368(序列號(hào)為SEQ ID NO：1)為模板設(shè)計(jì)引物z368-F/z368-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：10)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得由啟動(dòng)子BBa_J23119控制的ZMO0368基因片段，以引物z997-F/z997-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：11)擴(kuò)增來自運(yùn)動(dòng)單胞菌ZM4的ED下游途徑另一個(gè)基因片段ZMO0997(序列號(hào)為SEQ ID NO：2)。

啟動(dòng)子構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子BBa_J23119序列包含在引物z368-F中，直接由華大基因合成，啟動(dòng)子BBa_J23119用于調(diào)控ED下游途徑(ZMO0368-ZMO0997)。

PCR反應(yīng)體系：上下游引物(10μM)分別為1μL，模板1μL，dNTP(2.5mM)溶液2μL，10×緩沖液2μL，DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O為12.5μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3min,變性95℃30s,引物退火45～65℃30s,引物延伸72℃t min(t＝DNA片段長度/聚合酶擴(kuò)增速度),循環(huán)數(shù)30～35次,最后延伸72℃10min，具體溫度和時(shí)間參數(shù)調(diào)整參照引物報(bào)告單。

(2)以XER2-F/XER2-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：12)為引物，以pUCxer質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶dif位點(diǎn)的慶大霉素抗性片段。通過核酸定量儀進(jìn)行測(cè)定基因片段產(chǎn)物濃度，利用融合PCR擴(kuò)增出由啟動(dòng)子BBa_J23119調(diào)控下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif基因操縱子片段，并通過基因測(cè)序表明整合片段的序列正確性。

融合PCR反應(yīng)：步驟1、98℃2min，步驟2、98℃20s，步驟3、70℃(-1℃/cycle)20s，步驟4、72℃Length*30s/kb，步驟5、返回步驟2(15cycles)，步驟6、98℃20s，步驟7、55℃20s，步驟8、72℃Length*30s/kb，步驟9、返回步驟6(15cycles)，步驟10、72℃5min。

(3)分別采用ack-pta-F/ack-pta-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：9)同源臂引物擴(kuò)增出由BBa_J23119啟動(dòng)子控制的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif片段，獲得的ED下游途徑突變盒片段。

(4)以運(yùn)動(dòng)單胞菌Z.mobilis ZM4的ED上游途徑基因片段ZMO0367(序列號(hào)為SEQ ID NO：3)為模板設(shè)計(jì)引物z367-F/z367-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：6))，獲得由啟動(dòng)子BBa_J23118控制的ZMO0367，以引物z1487-F/z1487-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：7)擴(kuò)增來自運(yùn)動(dòng)單胞菌ZM4的ED上游途徑的另一個(gè)基因片段ZMO1487(序列號(hào)為SEQ ID NO：4)。

啟動(dòng)子構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子序列包含在引物z367-F中，直接由華大基因合成，引物z367-F含有啟動(dòng)子BBa_J23118，用于調(diào)控ED上游途徑(ZMO0367-ZMO1487)。

(5)以XER2-F/XER2-R(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：12)為引物，以pUCxer質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶dif位點(diǎn)的慶大霉素抗性片段。通過核酸定量儀進(jìn)行測(cè)定基因片段產(chǎn)物濃度，利用融合PCR擴(kuò)增出由啟動(dòng)子BBa_J23118調(diào)控下的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif基因操縱子片段，并通過基因測(cè)序表明整合片段的序列正確性。

(6)分別采用ldh-F/ldh-R同源臂引物(引物序列號(hào)為SEQ ID NO：5)擴(kuò)增出由BBa_J23118啟動(dòng)子控制的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif片段，獲得由BBa_J23118啟動(dòng)子調(diào)解的ED上游途徑突變盒片段。

實(shí)施例3含有異源ED糖代謝途徑的大腸桿菌異丁醇合成菌株E.coli ED的構(gòu)建

(1)E.coli LA09重組系統(tǒng)的構(gòu)建及感受態(tài)制備。

Red重組系統(tǒng)構(gòu)建：將質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入E.coli LA09中，接種于LB液體培養(yǎng)基中，添加氨芐青霉素，30℃，200rpm培養(yǎng)過夜。以1％的接種量接入50mL LB液體培養(yǎng)基中，添加氨芐青霉素抗性(100μg/mL)和加入終濃度為2mM的L-阿拉伯糖，30℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為0.7，停止培養(yǎng)。

感受態(tài)的制備：菌液冰上預(yù)冷20min，在4℃，4000rpm離心10min，收集菌體。加入20mL冰預(yù)冷的10％(v/v)甘油溶液中，保持低溫，輕柔重懸細(xì)胞，4℃，4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌2次。剩余菌體重懸于0.1mL冰預(yù)冷的10％甘油中，按每管50μL分裝于冰預(yù)冷的1.5mL離心管中，制得感受態(tài)細(xì)胞可直接用于電轉(zhuǎn)化或保存于-80℃中以備用。

(2)將由啟動(dòng)子BBa_J23119控制的ED下游途徑突變盒片段電轉(zhuǎn)化進(jìn)入已誘導(dǎo)重組酶的E.coli LA09感受態(tài)中，通過慶大霉素抗性篩選，并以菌落PCR(引物為Test2-F/Test2-R，引物序列號(hào)為SEQ ID NO:14)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得同源重組陽性轉(zhuǎn)化子E.coli MG1655ΔpflBΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)。

電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：冰上融化制備好的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入待轉(zhuǎn)化的DNA片段5μL，輕柔混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1cm電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置電壓1.8kv，時(shí)間5ms，進(jìn)行電擊。電擊完立刻加入1mL常溫含有1mM的L-阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基，置于30℃恒溫箱中，培養(yǎng)2～4h。將轉(zhuǎn)化后的菌體均勻涂布在含有慶大霉素抗性的LB平板上，30℃培養(yǎng)過夜，挑取轉(zhuǎn)化子。

(3)將啟動(dòng)子BBa_J23118控制的ED上游途徑突變盒片段電轉(zhuǎn)化進(jìn)入構(gòu)建好的E.coli

LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受態(tài)中，通過慶大霉素抗性篩選，并以菌落PCR(引物為Test1-F/Test1-R，引物序列號(hào)為SEQ ID NO:13)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得同源重組陽性轉(zhuǎn)化子E.coli

MG1655ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)，最終構(gòu)建由啟動(dòng)子BBa_J23118控制ED途徑上游片段和BBa_J23119控制的整合型ED下游途徑的異丁醇合成菌株E.coli ED。

實(shí)施例4高效低殘?zhí)钱惗〈己铣删甑姆峙l(fā)酵試驗(yàn)

(1)所有異丁醇合成菌株分批發(fā)酵具體過程均為：在試管中加入3ml M9培養(yǎng)基，接種異丁醇合成菌株于37℃250rpm過夜培養(yǎng)，獲得異丁醇合成菌株種子。異丁醇分批發(fā)酵在250mL三角瓶中進(jìn)行，每瓶中加入20mL培養(yǎng)基，異丁醇合成菌株種子的接種量為1％(體積分?jǐn)?shù))，37℃250rpm培養(yǎng)約4h以后，培養(yǎng)液OD₆₀₀值增長到0.7-0.8時(shí)加入0.05mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)異丁醇合成，繼續(xù)在30℃250rpm條件下發(fā)酵生成異丁醇。

(2)培養(yǎng)基和檢測(cè)方法

培養(yǎng)基成分：45g/L葡萄糖、5g/L酵母浸粉、1000稀釋的Trace mix A5微量元素母液、100μg/ml氨卡青霉素、20μg/ml氯霉素、17g/L Na₂HPO₄·12H₂O、3g/L KH₂PO₄、0.5g/L NaCl、1g/L NH₄Cl、0.24g/L MgSO₄和0.011g/L CaCl₂。Trace mix A5微量元素母液成分為2.86g/L H₃BO₃、1.81g/L MnCl₂·4H₂O、0.222g/L ZnSO₄·7H₂O、0.39g/L NaMoO₄·2H₂O、0.079g/L CuSO₄·5H₂O和49.4mg/L Co(NO₃)₂·6H₂O。

檢測(cè)方法：異丁醇合成菌株濃度通過分光光度計(jì)測(cè)定的發(fā)酵液600nm下的吸光度測(cè)定，并將吸光度數(shù)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重表征菌體增長。細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法為取適當(dāng)?shù)捏w積不同OD600值的菌液，12000rpm離心獲得菌體，在80℃恒溫干燥至恒重，OD600值與干重之間計(jì)算關(guān)系測(cè)定為1OD＝0.332g/L(細(xì)胞干重)。其發(fā)酵液中的葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀測(cè)定。發(fā)酵液經(jīng)離心(12000rpm，10min)取上清液測(cè)定異丁醇濃度，按照氣相色譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，以正丁醇為內(nèi)標(biāo)物。

序列表

天津大學(xué)

一種基于高效低殘?zhí)前l(fā)酵異丁醇的大腸桿菌合成菌株構(gòu)建方法

SEQ ID NO: 1

ZMO0368

ATGACTGATCTGCATTCAACGGTAGAAAAGGTTACCGCGCGCGTTATTGAACGCTCGCGGGAAACCCGTAAGGCTTATCTGGATTTGATCCAGTATGAGCGGGAAAAAGGCGTAGACCGTCCAAACCTGTCCTGTAGTAACCTTGCTCATGGCTTTGCGGCTATGAATGGTGACAAGCCAGCTTTGCGCGACTTCAACCGCATGAATATCGGCGTCGTGACTTCCTACAACGATATGTTGTCGGCTCATGAACCATATTATCGCTATCCGGAGCAGATGAAAGTATTTGCTCGCGAAGTTGGCGCAACGGTTCAGGTCGCCGGTGGCGTGCCTGCTATGTGCGATGGTGTGACCCAAGGTCAGCCGGGCATGGAAGAATCCCTGTTTAGCCGCGATGTTATCGCTTTGGCTACCAGCGTTTCTTTGTCTCATGGTATGTTTGAAGGGGCTGCCCTTCTCGGTATCTGTGACAAGATTGTCCCTGGTCTGTTGATGGGCGCTCTGCGCTTTGGTCACCTGCCGACCATTCTGGTCCCATCAGGCCCGATGACGACTGGTATCCCGAACAAAGAAAAAATCCGTATCCGTCAGCTCTATGCTCAGGGTAAAATCGGCCAGAAAGAACTTCTGGATATGGAAGCGGCTTGCTACCATGCTGAAGGTACCTGCACCTTCTATGGTACGGCAAACACCAACCAGATGGTTATGGAAGTCCTCGGTCTTCATATGCCAGGTTCGGCATTTGTTACCCCGGGTACCCCGCTCCGCCAGGCTCTGACCCGTGCTGCTGTGCATCGCGTTGCTGAATTGGGTTGGAAGGGCGACGATTATCGTCCGCTTGGTAAAATCATTGACGAAAAATCAATCGTCAATGCTATTGTTGGTCTGTTGGCAACCGGTGGTTCCACCAACCATACCATGCATATTCCGGCCATTGCTCGTGCTGCTGGTGTTATCGTTAACTGGAATGACTTCCATGATCTTTCTGAAGTTGTTCCGTTGATTGCCCGCATTTACCCGAATGGCCCGCGCGACATCAATGAATTCCAGAATGCAGGCGGCATGGCTTATGTCATCAAAGAACTGCTTTCTGCTAATCTGTTGAACCGTGATGTCACGACCATTGCCAAGGGCGGTATCGAAGAATACGCCAAGGCTCCGGCATTAAATGATGCTGGCGAATTGGTCTGGAAGCCAGCTGGCGAACCTGGTGATGACACCATTCTGCGTCCGGTTTCTAATCCTTTCGCAAAAGATGGCGGTCTGCGTCTCTTGGAAGGTAACCTTGGCCGTGCAATGTACAAGGCCAGTGCGGTTGATCCTAAATTCTGGACCATTGAAGCACCGGTTCGCGTCTTCTCTGACCAAGACGATGTTCAGAAAGCCTTCAAGGCTGGCGAATTGAACAAAGACGTTATCGTTGTTGTTCGTTTCCAGGGCCCGCGCGCAAACGGTATGCCTGAATTGCATAAGCTGACCCCGGCTTTGGGTGTTCTGCAGGATAATGGCTACAAAGTTGCTTTGGTAACTGATGGTCGTATGTCCGGTGCTACCGGTAAAGTTCCGGTTGCTTTGCATGTCAGCCCAGAAGCTCTTGGCGGTGGTGCCATCGGTAAATTACGTGATGGCGATATCGTCCGTATCTCGGTTGAAGAAGGCAAACTTGAAGCTTTGGTTCCAGCTGATGAGTGGAATGCTCGTCCGCATGCTGAAAAACCGGCTTTCCGTCCGGGAACCGGACGCGAATTGTTTGATATCTTCCGTCAGAATGCTGCTAAAGCTGAAGACGGTGCAGTCGCAATATATGCAGGTGCCGGTATCTAA

SEQ ID NO: 2

ZMO0997

ATGCGTGATATCGATTCCGTAATGCGTTTGGCACCGGTTATGCCGGTCCTCGTCATTGAAGATATTGCTGATGCAAAACCTATCGCAGAAGCTTTGGTTGCTGGTGGTCTGAACGTTCTTGAAGTAACGCTTCGCACCCCTTGTGCTCTTGAAGCCATCAAGATCATGAAAGAAGTTCCGGGTGCCGTTGTTGGTGCCGGTACGGTTCTGAACGCAAAAATGCTCGACCAAGCTCAGGAAGCTGGTTGCGAATTTTTCGTTAGCCCGGGTCTGACCGCTGACCTCGGCAAGCATGCTGTTGCCCAGAAAGCAGCTTTGCTTCCAGGTGTTGCTAATGCTGCTGATGTGATGCTTGGTCTTGACCTTGGTCTTGATCGCTTCAAATTCTTCCCGGCTGAAAATATCGGTGGTTTACCTGCCCTGAAGTCCATGGCTTCTGTTTTCCGTCAGGTTCGTTTCTGCCCGACCGGCGGTATCACCCCGACGTCAGCTCCTAAATATCTTGAAAACCCGTCCATTCTTTGCGTCGGTGGTAGCTGGGTTGTTCCGGCTGGCAAACCAGATGTCGCAAAAATCACGGCACTCGCTAAAGAAGCTTCTGCTTTCAAGCGCGCTGCTGTTGCCTAA

SEQ ID NO: 3

ZMO0367

ATGACAAATACCGTTTCGACGATGATATTGTTTGGCTCGACTGGCGACCTTTCACAGCGTATGCTGTTGCCGTCGCTTTATGGTCTTGATGCCGATGGTTTGCTTGCAGATGATCTGCGTATCGTCTGCACCTCTCGTAGCGAATACGACACAGATGGTTTCCGTGATTTTGCAGAAAAAGCTTTAGATCGCTTTGTCGCTTCTGACCGGTTAAATGATGACGCTAAAGCTAAATTCCTTAACAAGCTTTTCTACGCGACGGTCGATATTACGGATCCGACCCAATTCGGAAAATTAGCTGACCTTTGTGGCCCGGTCGAAAAAGGTATCGCCATTTATCTTTCGACTGCGCCTTCTTTGTTTGAAGGGGCAATCGCTGGCCTGAAACAGGCTGGTCTGGCTGGTCCAACTTCTCGCCTGGCGCTTGAAAAACCTTTAGGTCAAGATCTTGCTTCTTCCGATCATATTAATGATGCGGTTTTGAAAGTTTTCTCTGAAAAGCAAGTTTATCGTATTGACCATTATCTGGGTAAAGAAACGGTTCAGAATCTTCTGACCCTGCGTTTTGGTAATGCTTTGTTTGAACCGCTTTGGAATTCAAAAGGCATTGACCACGTTCAGATCAGCGTTGCTGAAACGGTTGGTCTTGAAGGTCGTATCGGTTATTTCGACGGTTCTGGCAGCTTGCGCGATATGGTTCAAAGCCATATCCTTCAGTTGGTCGCTTTGGTTGCAATGGAACCACCGGCTCATATGGAAGCCAACGCTGTTCGTGACGAAAAGGTAAAAGTTTTCCGCGCTCTGCGTCCGATCAATAACGACACCGTCTTTACGCATACCGTTACCGGTCAATATGGTGCCGGTGTTTCTGGTGGTAAAGAAGTTGCCGGTTACATTGACGAACTGGGTCAGCCTTCCGATACCGAAACCTTTGTTGCTATCAAAGCGCATGTTGATAACTGGCGTTGGCAGGGTGTTCCGTTCTATATCCGCACTGGTAAGCGTTTACCTGCACGTCGTTCTGAAATCGTGGTTCAGTTTAAACCTGTTCCGCATTCGATTTTCTCTTCTTCAGGTGGTATCTTGCAGCCGAACAAGCTGCGTATTGTCTTACAGCCTGATGAAACCATCCAGATTTCTATGATGGTGAAAGAACCGGGTCTTGACCGTAACGGTGCGCATATGCGTGAAGTTTGGCTGGATCTTTCCCTCACGGATGTGTTTAAAGACCGTAAACGTCGTATCGCTTATGAACGCCTGATGCTTGATCTTATCGAAGGCGATGCTACTTTATTTGTGCGTCGTGACGAAGTTGAGGCGCAGTGGGTTTGGATTGACGGAATTCGTGAAGGCTGGAAAGCCAACAGTATGAAGCCAAAAACCTATGTCTCTGGTACATGGGGGCCTTCAACTGCTATAGCTCTGGCCGAACGTGATGGAGTAACTTGGTATGACTGA

SEQ ID NO: 4

ZMO1487

TTAAGGGGGCATCGTTGCCTGTGGCATTTGCATCAATGCAGGGCGAGCCAACAAAAAACCTTGCATCAAATCAACACCAAGATCTTGCAAAACTTTAAATTCTTCTATTGTTTCGACGCCTTCGACGACAAAATCAATACCAAGATCGCGACATAGGCCTACCATCGCTTTGACAACGGCACGCCGTCTTTTGTCATGTTCGATGCCAACAACATAATGCCGATCGAGCTTGATGATATCGGGATGATAGGCTGTCAAAAGATTAAAATTCGAATAAAGGCCGCCGAAATCATCAAAAGCAACTTTAAAATTTAAATGCTTATAGCGTGAGATAACATGGCGAATATGGTCATATTCGGTGAGATATTCTTTTTCCGACCATTCAAAAATAAGGCGAGCAGGATTGATCCCCAGCTTTTCACAAGTGGATAACGTCTGGCTAAGGCAATATTCGGGATAATAAACGGCATTCGGCATGAAGTTGATGCTGATAGCACCATCCCAATTACAGGATAATGCCGATTGCAGGGCTTTATCACGGGCTTTCTGGTCAAAACTATAGCGATTATTTTCATCAATTCGGGAAAGAATGCTGTGAGCCCCCTCGCCCTTTAATCCACGGACTAAGGCTTCTTGCGCGTAAATGTGGCCATTCTTGATATTGACGATGGGCTGGAAAGCAAAAATAAAATTGAAGTCGAAGGGCTGTGGGTCTCGATTGTCGCCGCAAGGTGACGTGCTGTCATACCCTTGTATCGGTTGTTGAATCTGCCCCAT

SEQ ID NO: 5

ldh-F1

5’-ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACCTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’

ldh-R

5’-CCATACCCAACGAACCAATTTTCTGATTTTTCAGCGCTTCAATTGCTGCCTGAGA-3’

SEQ ID NO: 6

z367-F

5’-CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCTTTTAAGGACGAGAATAATGAC-3’

z367-R

5’-CTCCATTGATACCTGCCAGGATCAGTCATACCAAGTTACTCC-3’

SEQ ID NO: 7

z1478-F

5’-GGAGTAACTTGGTATGACTGATCCTGGCAGGTATCAATGGAG-3’

z1478-R

5’-CTAGAGTCGACCTGCAGGCTTATTTGCTCCAGTACACG-3’

SEQ ID NO: 8

XER-F

5’-CGTGTACTGGAGCAAATAAGCCTGCAGGTCGACTCTAG-3’

XER-R

5’-GCGCTTCAATTGCTGCCTGAGATTACGAATTCGAGCTCGGTA-3’

SEQ ID NO: 9

ack-pta-F

5’-CAACTTTATCGTTAATACTATTCTGGCACAAAAACCAGAACTGTCTGCGCAGCTGACTGCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’

ack-pta-R

5’-GATCATCAGGTCAGGACGTTTTTCCTGCGCCAGACGAGTTGCTTCGCGAACTTTTTCTACCAATCACCGGATCGTAACGACGAACC-3’

SEQ ID NO: 10

z368-F

5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCGCCGAACGTGAAGGAGGAACTTGGTATG-3’

z368-R

5’-CACGCATCTTAGCCTCCTGCCGCTGGAAAAATTAGATACCGGCACCTGC-3’

SEQ ID NO: 11

z997-F

5’-GCAGGTGCCGGTATCTAATTTTTCCAGCGGCAGGAGGCTAAGATGCGTG-3’

z997-R

5’-CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCTTAGGCAACAGCAGCGCGCTTGAAAG-3’

SEQ ID NO: 12

XER2-F

5’-CTTTCAAGCGCGCTGCTGTTGCCTAAGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGG-3’

XER2-R

5’-CAATCACCGGATCGTAACGACGAACCCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTAC-3’

SEQ ID NO: 13

Test1-F

5’-ATGAAACTCGCCGTTTATAG-3’

Test1-R

5’-CCAGTTCGTTCGGGCAGG-3’

SEQ ID NO: 14

Test2-F

5’-CGTATCAATTATAGGTACTTCC-3’

Test2-R

5’-CGTTAACCGGCTTGCGCATACC-3’