一種耐高溫真菌α-淀粉酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑領(lǐng)域，特別是一種耐高溫真菌α -淀粉酶。
【背景技術(shù)】
[0002]α-淀粉酶全稱為ct-l，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉時，可從分子內(nèi)部切開ct -1,4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為α-構(gòu)型，故得名為α-淀粉酶。
[0003]常見的Ct-淀粉酶有二種:細(xì)菌α-淀粉酶、真菌α -淀粉酶和麥芽α -淀粉酶。細(xì)菌Ct-淀粉酶是由細(xì)菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等產(chǎn)生的，細(xì)菌α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0004]真菌α -淀粉酶最早于1896年由日本的高峰讓吉從米曲霉中提取，并作為消化劑使用。50年代以來，真菌α-淀粉酶的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，開始應(yīng)用于淀粉制糖、釀造、面包、果蔬飲料、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域。用于淀粉制糖可以生產(chǎn)出以麥芽三糖為主的新型糖漿；與葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶合用，可以制備異麥芽低聚糖；在傳統(tǒng)的飴糖、黃酒生產(chǎn)中使用此酶，可以簡化生產(chǎn)工藝，提高原料利用率，節(jié)省糧食，降低生產(chǎn)成本；用于面包制作可以縮短發(fā)酵周期，制成的面包氣孔分布均勻，體積大，保鮮期長，還可替代以往常用的面包添加劑溴酸鉀；用于醫(yī)藥可作為消化劑，代替動物中提取的酶；用于果蔬飲料可以消除渾濁，提高收率；用于飼料可以提高飼料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的應(yīng)用具有廣闊的市場前景。
[0005]但真菌α -淀粉酶的最適作用溫度在55°C左右，當(dāng)溫度高于60°C便會逐漸失活，且熱穩(wěn)定相對較低，不適用于較高溫度的反應(yīng)過程，因此其應(yīng)用與發(fā)展受到一定程度的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種耐高溫的真菌α -淀粉酶。
[0007]所述的耐高溫的真菌α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0008](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，為50_75°C之間，最適作用溫度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活，具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0009](2)該酶最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值4.5-7.0酶活保持在70%以上。
[0010](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株901-18，制備的耐高溫真菌α -淀粉酶酶活力為12000-15000U/ml，相較出發(fā)菌株酶活提高3.6倍。
[0011]所述的耐高溫真菌α -淀粉酶的制備方法，包括如下步驟:
[0012]⑴菌種活化
[0013]將保存完好的里氏木霉的PDA斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，27_30°C培養(yǎng)36_48h進(jìn)行菌種活化，如此活化2-3次；
[0014](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0015]將活化后的菌種經(jīng)過三級搖瓶發(fā)酵和以及種子罐發(fā)酵。
[0016]所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0017]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5 %，海藻糖1-3 %，硫酸鈣lg，氯化鎂2g，檸檬酸鈉l_3g，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH 值 5-6.5，121-123°C滅菌 30_40min。
[0018]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0019]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5 %，玉米漿0.1-0.5 %，磷酸氫二鉀0.8-1.5 %，硫酸鎂0.05-0.1 %，檸檬酸鈉0.1-0.5 %，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH 值 5-6.5，121-123°C滅菌 30_40min。
[0020](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0021]將一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27-30°C，攪拌速度120-180r/min，通風(fēng)量(V/V)l:l_3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至27_30°C，恒溫培養(yǎng) 15-20h ；
[0022]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0023]放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0024]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l-5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 100mL, pH 值 5-6.5，121。。滅菌 20min ；
[0025]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-6.5，121-123°C滅菌30_40min。
[0026]發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫真菌α -淀粉酶。
[0027]所述的耐高溫真菌α -淀粉酶由里氏木霉901_18Trichoderma reesei 901-18。該菌株已于2013年11月24日保藏于中中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2013602。
[0028]所述里氏木霉901-18由一株分離自津市市河堤食用菌培植基地土壤樣本的里氏木霉菌株經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，所述菌株特點(diǎn)如下:該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.2-0.8mm,菌落邊緣白色,整齊；生長速度快，48h菌落直徑達(dá)1.5-8.5mm, 72h達(dá)30_55mm ；菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2-5 μ m。分生孢子梗從菌絲的短側(cè)枝發(fā)生，側(cè)枝上對生。該菌株產(chǎn)真菌ct -淀粉酶的最適pH 3.0-6.5 ;最適溫度為27?30°C。
[0029]有益效果:
[0030]1、本發(fā)明所述的生產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的方法以里氏木霉901-18為菌種，該菌種為首次公開。
[0031]2、采用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的耐高溫真菌α -淀粉酶具有如下特點(diǎn):酶活力高達(dá)12000-15000u/ml ;酶溫度適應(yīng)范圍較寬，為50_75°C之間，最適作用溫度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活，具有較好的熱穩(wěn)定性和保存活性；該酶最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值4.5-7.0之間酶活保持在70%以上。比現(xiàn)有的耐高溫真菌α-淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0032]3、本發(fā)明中的耐高溫真菌α -淀粉酶在制備過程中由于對培養(yǎng)基實(shí)施全程優(yōu)化，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了里氏木霉901-18的抗應(yīng)激能力，致使菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)，使得本發(fā)明所產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強(qiáng)、適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有更好的穩(wěn)定性和保存活性。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]實(shí)施例1:酶活性的測定
[0035](I)酶活單位的定義:lmL粗酶液,于65°C、pH 5.5條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0036](2)采用DNS法測定901-11,901-15，901-18的淀粉酶活性，得知，901-18具有穩(wěn)定最高酶活性。
[0037]實(shí)施例2:酶學(xué)性質(zhì)的測定
[0038](I)溫度對酶活性的影響以及酶的熱穩(wěn)定性
[0039]相同反應(yīng)體系，于40-80°C下分別測定該淀粉酶酶活力，結(jié)果表明該酶在50_75°C之間具有82%以上的酶活性，說明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬。且熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)表明，該酶在70°C保溫3h后，于65°C，pH5.5條件下仍然具有80%以上酶活定，溫度高于75°C，酶活損失嚴(yán)重。
[0040](2) pH對酶活性的影響
[0041]相同反應(yīng)體系，在pH 3-8.5下分別測該酶酶活，結(jié)果表明該酶在pH4.5-7時酶活性保持在70%以上，且pH5.5時達(dá)到最大值。
[0042]實(shí)施例3:
[0043]一種變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α -淀粉酶的方法，包括如下步驟:
[0044](I)菌種活化
[0045]將保存完好的里氏木霉901-18的PDA斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)24h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次；
[0046](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0047]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化制成的孢子懸液接入500毫升搖瓶中，使孢子濃度達(dá)到15個/mL，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床120r/min，培養(yǎng)溫度27°C，培養(yǎng)時間1h ；
[0048]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0049]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000 _升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100r/min，培養(yǎng)溫度27°C，培養(yǎng)時間1h ；
[0050]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度TVC，攪拌速度200rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間1h ；
[0051]所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0052]酵母粉0.3%，葡萄糖I %，蛋白胨0.3 %，牛肉膏0.5 %，磷酸氫二鉀0.8%，海藻糖1%，硫酸韓Ig,氯化鎂2g,朽1檬酸鈉lg，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5,121°C滅菌30min。
[0053]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0054]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%，檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5，121°C滅菌30min。
[0055](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0056]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27°C，攪拌速度120r/m，通風(fēng)量(V/V) 1:1，培養(yǎng)時間1h ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至1tVg溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至27 °C，恒溫培養(yǎng)15h ；
[0057]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15% ；
[0058]PH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5 ；
[0059]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0060]放罐標(biāo)準(zhǔn):60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0061]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑0.1g,純凈水 100mL, pH 值 5，121°C滅菌 20min ；
[0062]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉