一種外切-α-1,4-糖苷酶與其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種外切-α-l，4-糖苷酶及其編碼基因與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] α-葡萄糖苷酶是一類能從多糖的非還原端，以水解α-l，4-糖苷鍵的方式，釋放α-葡萄糖殘基的酶。這類酶廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。
[0003] 根據(jù)底物特異性的不同，α-葡萄糖苷酶分為三類:I.偏好水解蔗糖和對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷之類底物;II.偏好水解麥芽糖和麥芽寡糖;III.對淀粉類底物有較高活 性，同時(shí)也能水解麥芽糖和麥芽寡糖。
[0004] 大多數(shù)糖基水解酶31家族的α-葡萄糖苷酶(31AGs)表現(xiàn)出II型或III型底物特異 性，但是糖基水解酶13家族的α-葡萄糖苷酶（13AGs)表現(xiàn)出I型底物特異性。13AGs含有三個(gè) 保守結(jié)構(gòu)域：（β/α) 8折疊桶結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)域A)、結(jié)構(gòu)域A中3個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊構(gòu)成的環(huán)狀結(jié) 構(gòu)(結(jié)構(gòu)域Β)、回形鑰匙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)域C)。
[0005] 迄今為止，已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)微生物產(chǎn)生的胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶對維持生物體的 正常生理功能起著重要作用。α-葡萄糖苷酶可催化麥芽糖和糖原降解為葡萄糖，它是在人 類和哺乳動物組織中糖原降解方面的重要的酶，如果人類和哺乳動物缺失葡萄糖苷酶， 會導(dǎo)致糖原代謝紊亂。
[0006] 與此同時(shí)，α-葡萄糖苷酶作為工業(yè)化生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶制劑，倍受國內(nèi) 外食品工業(yè)界的重視。低聚異麥芽糖由2-10個(gè)葡萄糖殘基構(gòu)成，分子中至少有一個(gè)α-l，6_ 糖苷鍵，其他為α-l，4-糖苷鍵。由于此類低聚糖具有顯著的防止齲齒和促進(jìn)雙歧桿菌增殖 等功效，正日益受到消費(fèi)者的青睞。低聚異麥芽糖的生產(chǎn)以淀粉為原料，經(jīng)淀粉酶水解為 麥芽糊精后，再由葡萄糖淀粉酶和葡萄糖苷酶共同作用而成低聚麥芽糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的外切-α-l，4_糖苷酶與其編碼基因及 其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0009] -種外切-α-l，4-糖苷酶，該蛋白質(zhì)：
[0010]具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或該蛋白質(zhì)具有在SEQ ID NO. 1所 示的氨基酸序列基礎(chǔ)上缺失、置換、插入或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的衍生序列并且該蛋白 質(zhì)具有外切淀粉酶活性。
[0011] 所述外切淀粉酶活性指能以外切α-l，4_糖苷鍵的方式，作用于可溶性淀粉、支鏈 淀粉等淀粉類底物。
[0012] 為了使上述蛋白質(zhì)便于純化，可在上述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或 羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0013] 表1標(biāo)簽的序列
[0014]
[0015] 上述蛋白質(zhì)可以人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述中 的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列中，缺失、置換、插入或添加 一個(gè)至幾個(gè)，或者連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 本發(fā)明所提供的外切-α-l，4-糖苷酶屬于糖基水解酶13家族。
[0017] SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列由553個(gè)氨基酸殘基組成。
[0018] -種外切-α-1，4_糖苷酶的編碼基因，該基因編碼：
[0019] (a)具有SEQ ID NO. 1所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)；或
[0020] (b)具有衍生自缺失、置換、插入或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列并具有外切淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。
[0021 ] 進(jìn)一步，所述外切-α-l，4-糖苷酶的編碼基因?yàn)?i)、（ ii)或（iii)的DNA分子：
[0022] (i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；
[0023] (ii)在嚴(yán)格條件下與（i)所述的核苷酸序列雜交且編碼具有外切淀粉酶活性的所 述蛋白的DNA分子；
[0024] (ii i)與（i)或（ii)所述的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA分 子。
[0025] SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列由1662個(gè)核苷酸組成。
[0026] 進(jìn)一步，所述嚴(yán)格條件為鈉濃度為50-300mM的溶液中，反應(yīng)溫度為50-68°C。
[0027]例如:在進(jìn)行分子雜交的過程中，可以為在6 X SSC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的SDS的溶液 中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的SDS和1 X SSC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的 SDS各洗膜一次。其中SDS的中文名稱為十二烷基硫酸鈉，1 X SSC包括0.15mol/L NaCl和 0.015mo 1 /L檸檬酸;SDS以及不同濃度倍數(shù)的SSC均為本領(lǐng)域的常用試劑。
[0028] 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明提供一種重組載體，包括上述的外切-α-l，4_糖苷酶的編碼基因。
[0030] 所述重組載體為將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體(例如:pET28a)的多克隆 位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
[0031] 可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因構(gòu)建重組 表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們 可單獨(dú)使用或與其它的啟動子結(jié)合使用;此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還 可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰 接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述 翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū) 域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0032] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，包括上述的重組載體。
[0033]轉(zhuǎn)化體可以為重組菌，例如，將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體（例如： pET28a載體)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。
[0034] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)外切-α-1，4_糖苷酶的方法，該方法包括培養(yǎng)上述述的轉(zhuǎn) 化體并由培養(yǎng)產(chǎn)物中收集外切-α-l，4_糖苷酶。收集的外切-α-l ,4-糖苷酶可以進(jìn)一步進(jìn)行 純化。
[0035] 本發(fā)明還提供一種引物對，用于擴(kuò)增上述的外切-α-l，4_糖苷酶的編碼基因全長 及其任意片段。
[0036] 例如：引物對的序列如SEQ ID Ν0.3和SEQ ID Ν0.4所示。
[0037] 上述任一所述蛋白質(zhì)、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組表達(dá)載體、所述 表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌中的任意一種在降解可溶性淀粉、支鏈淀粉或P-硝基苯-α-D_吡喃葡萄糖苷中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038] 一種上述的外切-α-l，4_糖苷酶在水解α-l，4糖苷鍵中的應(yīng)用。例如：用于水解ρ-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、可溶性淀粉或支鏈淀粉等。
[0039] 在具體應(yīng)用的過程中，可以采用下面的方法：以可溶性淀粉、支鏈淀粉或p-硝基 苯-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，在中性pH條件，利用外切-α-l，4-糖苷酶對可溶性淀粉、支鏈 淀粉或P-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行酶解。
[0040] 所述的降解條件包括:反應(yīng)體系的溫度30-45Γ，優(yōu)選為40°C，反應(yīng)體系的pH值為 6-8.8,優(yōu)選為7.0。
[0041] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)外切-α-l，4_糖苷酶的方法，該方法包括培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化 體并由培養(yǎng)產(chǎn)物中收集外切-α-l，4_糖苷酶。
[0042]本發(fā)明的有益效果是：
[0043]本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)具有外切淀粉酶活性，屬于外切淀粉酶。并且該蛋白與其他 已表征的α-l，4_糖苷酶的氨基酸序列相比，相似性不大于65%，屬于a-葡萄糖苷酶家族中 一員。
[0044]本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可以廣泛應(yīng)用于α-l，4_糖苷鍵的酶解。
[0045]本發(fā)明所述外切-α-l，4_糖苷酶最適天然底物為支鏈淀粉，且具有在中性pH條件 下活性高的特性。
[0046]本發(fā)明對p-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)也有很好的酶活，實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明 所述外切-α-l，4-糖苷酶，以pNPG為底物，在40°C、pH為7.0的條件下具有最高的酶活性，為 288·89mU/mg蛋白；該酶在30-45°C溫度范圍內(nèi)，酶活均較高；在pH 6·0至pH 8·8的pH值范圍 內(nèi)，酶活均較高。該酶在PH6.2-8.6的條件下保持16h，依然有60%以上的酶活性，具有很好 的pH耐受性。
【附圖說明】
[0047] 圖1為Amy 112蛋白純化前后的SDS-PAGE電泳圖。
[0048] 圖2為外切-α-l，4-糖苷酶的活性隨溫度的變化的結(jié)果。
[0049] 圖3為外切-α-l，4-糖苷酶的活性隨pH的變化的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0051 ]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]實(shí)施例1、蛋白及基因的制備與功能
[0054]基因及蛋白的制備
[0055] 1、模板DNA的制備可以分別通過以下兩種方式進(jìn)行：
[0056] (1)嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp. 703總DNA的提?。翰捎醚挎邨U菌Bacillus sp. 703，取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mM Tri s緩沖液中（pH8.0)，加入少量溶菌酶和 8毫升0.25mM EDTA(pH8.0)，混勻后37°C放置20min;之