本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌轉(zhuǎn)化指某一受體細(xì)菌通過直接吸收來自另一供體細(xì)菌的含有特定基因的脫氧核糖核酸(DNA)片段，從而獲得了供體細(xì)菌的相應(yīng)遺傳性狀，這種現(xiàn)象稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化。自然界的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，一般發(fā)生在同一物種或近緣物種中。細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法已被引入其他生物，例如采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，可將外源DNA注入到不具攝取DNA能力的生物中，使其獲得某些新的特性。細(xì)菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最初由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家格里菲斯(F.Griffith)于1928年發(fā)現(xiàn)，直至1944年美國(guó)科學(xué)家埃弗里(O.T.Avery)等人才證實(shí)了轉(zhuǎn)化因子是脫氧核糖核酸，從而為遺傳學(xué)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。

細(xì)菌轉(zhuǎn)化是現(xiàn)代基因工程與分子生物學(xué)最重要的操作技術(shù)之一。轉(zhuǎn)化效率的高低決定后續(xù)工作的開展，而細(xì)菌的狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化效率最關(guān)鍵的因素之一。已發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)菌中均能發(fā)生轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化成功率與某些因子密切相關(guān)，例如受體菌處于感受態(tài)階段可產(chǎn)生感受態(tài)因子，是接受外來DNA片段的最佳時(shí)期，而鈣離子、環(huán)腺苷酸(cAMP)等物質(zhì)亦可大大提高轉(zhuǎn)化率。然而目前對(duì)于提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的研究還有待進(jìn)一步提升。

其中，EPS廣泛存在于微生物細(xì)胞外和微生物聚集體內(nèi)部。將存在于各種微生物聚集體內(nèi)部的生物大分子(如多糖、蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等)統(tǒng)稱為胞外聚合物。EPS包括所有微生物分泌的大分子物質(zhì)，以及細(xì)胞溶和大分子水解的產(chǎn)物。

根據(jù)EPS在細(xì)胞外存在的位置，可將其分為結(jié)合態(tài)EPS(包括莢膜聚合物、松散結(jié)合聚合物、鞘、凝聚凝膠和附著有機(jī)質(zhì))和游離態(tài)EPS(可溶態(tài)、膠體態(tài)、黏液態(tài)的大分子)。結(jié)合態(tài)EPS與細(xì)胞本身結(jié)合較為緊密，而游離態(tài)EPS與細(xì)胞微弱結(jié)合或存在于環(huán)境溶液中。一般地，結(jié)合態(tài)和游離態(tài)EPS可以通過離心的方法分離，殘留在上清液中的為游離態(tài)EPS，隨微生物細(xì)胞沉淀的為結(jié)合態(tài)EPS。普遍認(rèn)為結(jié)合態(tài)EPS具有雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為緊密結(jié)合態(tài)EPS有特定的形狀并且緊密固定在微生物細(xì)胞表面，外層為松散結(jié)合態(tài)EPS并沒有明顯區(qū)分的疏松分散黏液層。雖然游離態(tài)EPS與細(xì)胞表面的相互作用非常微弱，但在的聚集過程中游離態(tài)EPS起到至關(guān)重要的作用，而結(jié)合態(tài)EPS幾乎不影響這一過程。游離態(tài)EPS在微生物細(xì)胞聚集、固相表面吸附、礦物溶解和生物礦化、重金屬固定等方面有重要影響。

由于細(xì)胞EPS的產(chǎn)生和分泌，進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞膜并與外界環(huán)境隔離，導(dǎo)致外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)這一過程受到EPS的阻礙，使得轉(zhuǎn)化效率低下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的方法，主要包括以下步驟：

1)受體菌的培養(yǎng)：從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落，接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下150rpm下振蕩培養(yǎng)12h，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期；將該菌懸液以1％的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)至OD600＝0.5左右，得到菌液備用；

2)細(xì)胞EPS的去除：將25ml步驟1)制備的菌液加入離心管內(nèi)，4000g離心10min，去掉上清液，再向離心管內(nèi)加入25ml步驟1)制備的菌液，4000g離心10min，去掉上清液；之后加入預(yù)冷的25ml UP水重懸，再次離心，去掉上清液；向離心管中加入預(yù)冷的10ml超純水，重懸菌液，4℃40kHz超聲10min，12000g離心20min，去掉上清液，保留菌體；

3)感受態(tài)細(xì)胞的制備：

a.將步驟2)所得菌體加預(yù)冷的超純水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入兩個(gè)滅菌的50ml離心管中，4℃5000rpm離心10min，收集菌體，去掉上清液；

b.向離心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原體積1/5)，振蕩懸浮菌體，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清，向離心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液25ml(原體積的一半)懸浮菌體沉淀；

d.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清液，向離心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液懸浮菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞懸液，每份100μl分裝后保存于-80℃冰箱中備用；

4)轉(zhuǎn)化：

a.從-80℃冰箱中取200μl步驟3)制備的感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；

b.加入質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；

c.42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；

d.向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；

e.將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)；

f.根據(jù)生長(zhǎng)情況對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述LB培養(yǎng)基的配制方法為：在950mL去離子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl 10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至終總體積為1L，121℃濕熱高溫滅菌20min。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液的配制方法為：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M CaCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法為：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的方法，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作步驟簡(jiǎn)單、溫度和細(xì)菌生長(zhǎng)條件要求低、革蘭氏陰性菌和陽性菌通用的特點(diǎn)，對(duì)分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域具有重要的意義。

附圖說明

圖1本發(fā)明細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程示意圖；

圖2是不同處理下細(xì)胞膜通透性改變情況；

圖3是CaCl₂處理下的感受態(tài)細(xì)胞使用三種質(zhì)粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)轉(zhuǎn)化子統(tǒng)計(jì)結(jié)果；

圖4是MnCl₂處理下的感受態(tài)細(xì)胞使用三種質(zhì)粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)轉(zhuǎn)化子統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更進(jìn)一步詳細(xì)的說明：

一種提高細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的方法，主要包括以下步驟：

1)受體菌的培養(yǎng)：從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落，接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下150rpm下振蕩培養(yǎng)12h，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期；將該菌懸液以1％的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)至OD600＝0.5左右，得到菌液備用；

2)細(xì)胞EPS的去除：將25ml步驟1)制備的菌液加入離心管內(nèi)，4000g離心10min，去掉上清液，再向離心管內(nèi)加入25ml步驟1)制備的菌液，4000g離心10min，去掉上清液；之后加入預(yù)冷的25ml UP水重懸，再次離心，去掉上清液；向離心管中加入預(yù)冷的10ml超純水，重懸菌液，4℃40kHz超聲10min，12000g離心20min，去掉上清液，保留菌體；

3)感受態(tài)細(xì)胞的制備：

a.將步驟2)所得菌體加預(yù)冷的超純水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入兩個(gè)滅菌的50ml離心管中，4℃5000rpm離心10min，收集菌體，去掉上清液；

b.向離心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原體積1/5)，振蕩懸浮菌體，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清，向離心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液(原體積的一半)懸浮菌體沉淀；

d.4℃，5000rpm離心10min，去掉上清液，向離心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液懸浮菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞懸液，每份100μl分裝后保存于-80℃冰箱中備用；

4)轉(zhuǎn)化：

a.從-80℃冰箱中取200μl步驟3)制備的感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；

b.加入PUC19質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；

c.42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；

d.向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；

e.將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)；

f.根據(jù)生長(zhǎng)情況對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

其中，所述LB培養(yǎng)基的配制方法為：在950mL去離子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至終總體積為1L，121℃濕熱高溫滅菌20min。所述20％甘油的冷的0.1mol/LCaCl₂溶液的配制方法為：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2MCaCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法為：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液200ml，滅菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，滅菌，將二者混合均勻即成。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同的是，將所述步驟4)b中的PUC19質(zhì)粒換成PHSG298質(zhì)粒。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1不同的是，將所述步驟4)b中的PUC19質(zhì)粒換成PHSG396質(zhì)粒。

實(shí)施例4

與實(shí)施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液。

實(shí)施例5

與實(shí)施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；將所述步驟4)b中的PUC19質(zhì)粒換成PHSG396質(zhì)粒。

實(shí)施例6

與實(shí)施例1不同的是，將所述步驟3)c中的CaCl₂溶液換成MnCl₂溶液；將所述步驟3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液換成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；將所述步驟4)b中的PUC19質(zhì)粒換成PHSG396質(zhì)粒。

最后應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。