本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥與疾病免疫領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法。

背景技術(shù)：

自1940年代發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素的廣泛使用讓人們擺脫了細菌性感染帶來的恐懼。但隨著抗生素的長期使用以及濫用，刺激了病原微生物耐藥性的產(chǎn)生。耐藥性結(jié)核桿菌、MRSA等對人類和動物的危害日趨嚴重，對社會造成了慘重的經(jīng)濟損失。新型抗生素的篩選進展也因為細菌的耐藥性而變得愈加困難。

在合成抗生素發(fā)展緩慢的情況下，如何克服因抗生素引起的細菌耐藥性問題是當前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，有的生物在受到微生物感染后，會迅速產(chǎn)生一些具有抗菌活性的小分子物質(zhì)——抗菌肽參與機體免疫。隨后科學(xué)家們又陸續(xù)從植物、微生物、兩棲動物、昆蟲、哺乳動物乃至人體內(nèi)鑒定出上千種抗菌肽，說明它幾乎是所有生命物種都具有的重要免疫分子。這類抗菌肽具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌細胞等生物活性，從氨基酸組成、合成機制和作用機制等方面都與傳統(tǒng)的微生物(細菌、真菌和鏈霉菌等)產(chǎn)生的抗生素完全不同。因此，抗菌肽作為一種生物來源的、核糖體合成的小分子肽，在新型抗菌劑開發(fā)領(lǐng)域具有毋庸置疑的潛在優(yōu)勢，逐漸成為生物醫(yī)藥學(xué)科的研究熱點[1]。人們積極探索抗菌肽的藥用價值，希望開發(fā)出替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌劑，為解決病原菌對抗生素逐漸產(chǎn)生的耐藥性問題提供新途徑。

1972年瑞典科學(xué)家Boman H.G.領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，通過將大腸桿菌注射到惜古比天蠶蛹中，在誘導(dǎo)的天蠶免疫血淋巴中發(fā)現(xiàn)并提純得到了抗菌肽P9A和P9B。通過氨基酸序列測序分析，確定了此類抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)，并將之命名為天蠶素(cecropins)，這也是人類發(fā)現(xiàn)并得到的第一個抗菌肽。

抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMPs)由10～50個氨基酸構(gòu)成，是生物先天性非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分。AMPs具有廣譜抗菌活性、高效性、穩(wěn)定性等特點，對細菌、真菌甚至是艾滋病病毒和癌細胞也具有很強的抑制作用。此外，由于它們的作用靶點主要位于微生物的細胞膜上，誘導(dǎo)微生物細胞膜去極化，導(dǎo)致細胞破裂，因此，不易引起微生物抗性突變產(chǎn)生，是替代傳統(tǒng)抗生素的有力候選者之一。

目前，人們主要通過三種方法獲得目的抗菌肽:(1)生物提取，(2)化學(xué)合成，(3)利用基因工程手段表達，它們各有優(yōu)缺點。

(1)生物提取的抗菌肽

生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，其缺點是含量低、難度大、效率低、對技術(shù)和成本要求高，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，且對于一些高等生物和人源抗菌肽的生產(chǎn)來說也不現(xiàn)實。

(2)化學(xué)合成的抗菌肽

隨著對多肽和蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的進一步深入研究和多肽合成技術(shù)的誕生，人工合成活性肽的方法為抗菌肽的研究提供了很大便利。許多研究結(jié)果表明，化學(xué)合成的AMPs表現(xiàn)出與天然AMPs相同的生物學(xué)活性，但化學(xué)合成方法同樣面臨著成本高昂的問題，限制了抗菌肽的廣泛應(yīng)用。

(3)基因工程表達的抗菌肽

對大量抗菌肽分子結(jié)構(gòu)的分析和比較后人們發(fā)現(xiàn)，計算機輔助設(shè)計新型抗菌肽并利用基因工程技術(shù)制備是新藥開發(fā)的一個重要手段。抗菌肽分子量小，化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，抗菌譜廣，無抗生素抗性，免疫反應(yīng)性低，便于合成，這些優(yōu)點有利于人們利用計算機軟件對抗菌機理進行測試分析和修飾改造。

基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展使抗菌肽大規(guī)模制備成為可能，但目前也存在著許多問題。通過基因工程技術(shù)在細菌中表達抗菌肽分子量小，表達的產(chǎn)物可能對宿主有害，進而對基因的高水平表達造成不良影響。如何有效降低抗菌肽表達產(chǎn)物對宿主菌的毒性，提高表達效率，是抗菌肽利用基因工程表達亟待解決的問題。在宿主菌融合表達中，親和層析的應(yīng)用最為廣泛。傳統(tǒng)的親和層析是將親和標簽在DNA水平上與目的蛋白序列融合。然后將細胞破碎液通過親和柱，分離得到目的蛋白。但層析技術(shù)所使用的親和介質(zhì)昂貴，且常需通過蛋白酶水解作用將親和標簽從融合蛋白上除去。就工業(yè)應(yīng)用而言，親和標簽的去除是蛋白生產(chǎn)過程中花費最昂貴的一步。外源物的添加還可能影響目的蛋白的生物活性。此外，抗菌肽分子量小，容易降解，進一步降低了回收率，使多肽生產(chǎn)的成本大幅提高。因此，亟需我們開發(fā)新型的抗菌肽表達純化體系，為工業(yè)化制備抗菌肽奠定基礎(chǔ)。

類彈性蛋白(Elastin-like polypeptides,ELPs)是一種從基因水平改編的人造生物聚合物，它是廣泛存在于脊椎動物結(jié)締組織中的彈性蛋白(elastins)的衍生物。類彈性蛋白由一個重復(fù)的五肽單位Val–Pro–Gly–Xaa–Gly構(gòu)成，其中Xaa可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸。而將功能性目的蛋白N-端或C-端與ELP融合后的體系則被稱為ELPylation。

(1)類彈性蛋白(ELPs)的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

ELPs是以Val–Pro–Gly–Xaa–Gly(VPGXG)五肽為單位而組成的聚合體，是彈性蛋白的衍生物。其中，Xaa又叫客殘基“guest residue”，它可以是除脯氨酸(Pro)外的其他氨基酸，因為脯氨酸會破壞相變。文獻中也是根據(jù)第四位氨基酸的種類和出現(xiàn)的次數(shù)對ELPs進行分類的。為了使特定ELP的結(jié)構(gòu)標注顯得簡潔并標準，有人提出了如下的表示形式：[XiYjZk]n

X，Y，Z——每個字母表示出現(xiàn)在五聚體第四位的氨基酸；

i，j，k——表示第四位氨基酸出現(xiàn)在五聚體單位中的比率；

n——表示所給出的ELP五聚體的總個數(shù)。

ELPs屬于三類熱敏生物聚合物中的一種，其性質(zhì)隨環(huán)境溫度的的變化而改變。水溶性的ELPs具有較低臨界溶解溫度，即當溫度高于所謂的相變溫度時，ELPs在溫度變化較窄范圍內(nèi)(2～3℃)由可溶狀態(tài)變?yōu)榫鄢翣顟B(tài)，此過程稱為凝聚作用。Meyer將相變溫度Tt定義為：當升高溶液溫度使ELP發(fā)生凝聚致溶液混濁度增加到初始值一半時的溫度值為相變溫度。當溶液溫度低于Tt時，游離的聚合物鏈呈無序的水合狀態(tài)(可溶形式)；當溶液溫度高于Tt時，聚合物鏈呈現(xiàn)出更加有序的結(jié)構(gòu)(β-螺旋)，通過疏水相互作用而變得穩(wěn)定，同時分子內(nèi)的β-結(jié)構(gòu)也加強了聚合鏈之間的結(jié)合能力。

然而上述過程是可逆的，當環(huán)境溫度降低時ELP也會從凝聚狀態(tài)轉(zhuǎn)變成可溶形態(tài)。有趣的是，即使將ELP與其他蛋白融合，這種與溫度相關(guān)的相變可逆性質(zhì)仍然存在。G和L蛋白與ELP結(jié)構(gòu)域融合，發(fā)現(xiàn)其在一定溫度范圍內(nèi)仍相變可逆。ELPs的Tt值取決于幾個因素。如溶液中ELP的濃度、溶液的離子強度、鹽濃度和聚合物的分子質(zhì)量，此外融合蛋白的性質(zhì)也對Tt值有一定影響。隨著這些參數(shù)值的升高，Tt降低。對于一個給定的生物聚合體而言，單體第四位上氨基酸的不同也對Tt值有影響。當這個位置的氨基酸屬于疏水基團時，Tt較低；反之為親水基團時，Tt值升高(影響取決于特殊殘基的摩爾比率)。通過改變五肽單位的第四位殘基，可設(shè)計得到理想的Tt值。如果第四位的氨基酸殘基易受到電離作用的影響，那么可以通過改變pH值對Tt值進行調(diào)節(jié)；而當氨基酸帶有能進行化學(xué)反應(yīng)的側(cè)鏈時，可將其他分子與ELP偶聯(lián)。

(2)內(nèi)含肽來源與結(jié)構(gòu)和功能

1990年，Hirata的研究小組與Kane的小組分別在編碼釀酒酵母空泡膜H⁺-ATP酶的VMA1基因中發(fā)現(xiàn)了一個框內(nèi)插入片段，并出現(xiàn)在前體mRNA中，隨Vmal蛋白一起翻譯，而在翻譯后被切除。因其與RNA內(nèi)含子從前體mRNA上剪切下來的過程類似，所以這一自我切除的過程叫做蛋白質(zhì)的剪接。被切下來的那段多肽命名為內(nèi)含肽。因此，內(nèi)含肽是嵌入在宿主蛋白內(nèi)部的蛋白元件，具有自我剪接(self-splicing)的能力，又叫蛋白剪接元件。發(fā)生自我剪接反應(yīng)時，內(nèi)含肽從宿主蛋白中自我切除，同時促使兩邊的外顯肽通過側(cè)鏈連接成一個完整的蛋白并恢復(fù)宿主基因的功能。內(nèi)含肽的切除是一個翻譯后的過程，不需要酶或輔因子的輔助。蛋白質(zhì)的自剪接僅包含四步分子內(nèi)反應(yīng)，其中只涉及了內(nèi)含肽和外顯肽的一小部分關(guān)鍵催化殘基。自1999年12月以來，已經(jīng)有100多種內(nèi)含肽被鑒定并收錄于InBase數(shù)據(jù)庫(http://www.neb.com/neb/inteins.html)。

從結(jié)構(gòu)上可將內(nèi)含肽分為兩類：1)在兩個剪接區(qū)域含有歸巢內(nèi)切酶的大分子內(nèi)含肽；2)缺失歸巢內(nèi)切酶的mini-內(nèi)含肽。最近人們又新發(fā)現(xiàn)了一種可進行反式-剪接的內(nèi)含肽。歸巢內(nèi)切酶是存在于特定位點的雙鏈DNA內(nèi)切酶，它在重組-依賴性的過程中通過側(cè)翼序列促進自身編碼區(qū)域基因組間的橫向遷移，這個過程被叫做“歸巢”。通常情況下，歸巢內(nèi)切酶由一個包含內(nèi)含子或內(nèi)含肽的開放閱讀框編碼而來。大分子內(nèi)含肽是雙功能蛋白，內(nèi)有一個蛋白剪接區(qū)和一個中心內(nèi)切酶區(qū)域。Chong等將大分子內(nèi)含肽中的中心內(nèi)切酶區(qū)域刪除，構(gòu)建了具有高效剪接功能的mini-內(nèi)含肽，證明內(nèi)切酶區(qū)域不參與蛋白的剪接作用。剪接區(qū)被內(nèi)切酶區(qū)分成N-端和C-端兩個子域，在N-端子域含A、N2、B和N4氨基酸保守區(qū)，而在C-端子域有G和F保守區(qū)。這些區(qū)域也存在于mini-內(nèi)含肽中。天然的mini-內(nèi)含肽和人工構(gòu)建的mini-內(nèi)含肽在三維結(jié)構(gòu)上類似?，F(xiàn)已知的內(nèi)含肽在序列上相似性程度低，僅在N-端和C-端序列高度保守。多數(shù)內(nèi)含肽殘基以Ser或Cys開頭，His-Asn或His-Gln結(jié)尾。

內(nèi)含肽的剪接是一個快速的四步親和進攻反應(yīng)，由四個保守的剪接功能殘基介導(dǎo)：(1)內(nèi)含肽N-端第一個殘基N-O(絲氨酸,Ser)或N-S?；?半胱氨酸，Cys)發(fā)生轉(zhuǎn)移，在N-外顯肽和內(nèi)含肽功能域之間形成一個(硫)酯鍵。(2)(硫)酯鍵受到C-外顯肽第一個殘基(Cys，Ser或Thr)OH-或SH-群的攻擊，使N-外顯肽的與C-外顯肽第一個殘基側(cè)鏈發(fā)生酯交換反應(yīng)。(3)內(nèi)含肽C-端保守氨基酸殘基Asn發(fā)生環(huán)化作用使內(nèi)含肽釋放出來，同時兩側(cè)的外顯肽通過(硫)酯鍵連接起來。(4)連接兩外顯肽的(硫)酯鍵發(fā)生重排，S-N或O-N酰基轉(zhuǎn)換形成一個肽鍵。

(3)內(nèi)含肽的自切割作用與應(yīng)用

天然內(nèi)含肽可在體內(nèi)發(fā)生自我剪接作用(splicing)，而利用基因工程手段對天然內(nèi)含肽的N-端或C-端保守氨基酸序列進行突變則可控制其只在C-端或N-端進行自切割反應(yīng)。如果只想在N-端切割，則將天然內(nèi)含肽的末端殘基突變，避免剪接機制的第(3)步發(fā)生(同時也終止了第(4)步)。而前兩步仍可發(fā)生，使酯鍵自發(fā)水解將N-端外顯肽從內(nèi)含肽上切割開。反之，突變內(nèi)含肽的第一個殘基，則剪接機制的(1)(2)(4)步都不發(fā)生，而第(3)步仍繼續(xù)，從而使外顯肽從C-端切割下來。利用此特性，可將具有自切割能力的基因工程內(nèi)含肽與各種蛋白純化標簽融合，介導(dǎo)其蛋白的純化作用。

經(jīng)改造的內(nèi)含肽可分為兩類：pH-誘導(dǎo)的C-端自切割內(nèi)含肽和硫醇-誘導(dǎo)的N-/C-端自切割內(nèi)含肽。pH-誘導(dǎo)的內(nèi)含肽只需要調(diào)節(jié)緩沖液的pH即可誘導(dǎo)切割反應(yīng)，所以是最經(jīng)濟的體系。其中，New England Biolabs(NEB)公司開發(fā)的pTWIN1和pTWIN2質(zhì)粒中攜帶的Ssp DnaB內(nèi)含肽是目前發(fā)表最多的pH-誘導(dǎo)自切割內(nèi)含肽。另一pH-誘導(dǎo)的內(nèi)含肽是Branki等人通過工程改造、遺傳篩選的突變mini-內(nèi)含肽△I-CM，它來源于Mut RecA，現(xiàn)已成功和非親和層析標簽如ELP、PHB等結(jié)合用于蛋白純化。pH和溫度誘導(dǎo)的內(nèi)含肽缺點是有蛋白可能在被回收和純化前，在體內(nèi)發(fā)生自我切割。但體內(nèi)切割程度可通過低溫表達(12-15℃)限制到最低。

硫醇-誘導(dǎo)內(nèi)含肽中報道最多的是來源于釀酒酵母的Sce VMA內(nèi)含肽，可從商業(yè)途徑獲得，可作為IMPACT Kit與CBD親和標簽聯(lián)用。N-端的切割反應(yīng)可用強親核試劑如2-巰基乙烷、磺酸鈉、羥胺、苯硫酚、β-巰基乙醇、DTT或游離的半胱氨酸誘導(dǎo)，其中最常用的是DTT。使用硫醇-誘導(dǎo)內(nèi)含肽的優(yōu)點是在體內(nèi)幾乎不發(fā)生自切割反應(yīng)，此外，pH和溫度誘導(dǎo)的內(nèi)含肽對硫醇不敏感，且價格便宜，適于大規(guī)模生產(chǎn)。缺點是硫醇誘導(dǎo)可能會破壞目的蛋白的二硫鍵。

內(nèi)含肽在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。內(nèi)含肽的天然剪接活性可用于蛋白和多肽的連接，又叫做內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接作用(IPL)或者表達蛋白的連接作用(EPL)，在分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法學(xué)的應(yīng)用上已較完善。此外，內(nèi)含肽也被廣泛用于NMR分析中蛋白質(zhì)的分段標記、蛋白質(zhì)環(huán)化、毒性蛋白的控制表達、蛋白與量子點的共軛、生物分離等方面。在基礎(chǔ)研究中，研究人員用內(nèi)含肽監(jiān)測體內(nèi)蛋白與蛋白之間的相互作用，或者用來改變蛋白進入細胞器的位置。生物技術(shù)應(yīng)用中的大多數(shù)內(nèi)含肽都來源于原核微生物，或者是工程改造的釀酒酵母VMA1-內(nèi)含肽的變體。

Thomas等將甲烷桿菌mini-內(nèi)含肽(Mth RIR1，intein)應(yīng)用于蛋白的連接作用。Mini-內(nèi)含肽含134個氨基酸殘基。與內(nèi)含肽N-端半胱氨酸相鄰有一個脯氨酸Pro^-1-Cys¹，在天然狀態(tài)下，發(fā)現(xiàn)其在大腸桿菌中的剪接效率很低。當脯氨酸突變成丙氨酸時，內(nèi)含肽的剪接(splicing)效率增加。而將內(nèi)含肽C-端的精氨酸或N-端的半胱氨酸突變?yōu)楸彼釙r，突變體會在N-或C-端表現(xiàn)出高效的切割作用(cleavage)。將mini-內(nèi)含肽C-端/N-端進行突變Asn¹³⁴-Ala/Cys¹-Ala，并與CBD融合，另一端和MBP或T4連接酶融合，形成MBP-intein(N)-CBD和CBD-intein(C)-T4DNA ligase三聯(lián)體，用大腸桿菌進行表達，破碎細胞后利用CBD提取蛋白，最后將兩種三聯(lián)體蛋白在一定條件下混合，通過兩者自身的多肽鍵反應(yīng)將MBP和T4ligase連接起來。實驗表明此mini-內(nèi)含肽具有自剪接的能力，且它獨特的性質(zhì)擴展了基于內(nèi)含肽介導(dǎo)的方法在體外細菌表達大分子融合蛋白連接中的應(yīng)用。

Wu等利用pH-誘導(dǎo)的△I-CM內(nèi)含肽對含二硫鍵的人源抗體片段、麥芽糖結(jié)合蛋白和β-半乳糖苷酶進行了表達與純化。他們將目標蛋白從基因水平上融合到帶幾丁質(zhì)結(jié)合域的自切割內(nèi)含肽標簽上，通過幾丁質(zhì)-瓊脂糖親和柱層析純化。純化后的目標蛋白仍然留在層析柱上，然后在室溫下改變pH8.5到pH6.0-6.5，可直接將切割的目的蛋白洗脫下來。實驗證實CBD-內(nèi)含肽純化方法可得到良好的產(chǎn)率和產(chǎn)品純度，且產(chǎn)品活性較好。

(4)Titin/Z1Z2-Telethonin復(fù)合物蛋白支架及用途

Titin又叫肌聯(lián)蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的單基因編碼的最大蛋白，分子量約3-3.7MDa，長約1μm，約占肌節(jié)的一半，它是高度彈性的分子，在維持肌肉肌節(jié)的完整性方面起著重要作用。Titin普遍存在于心肌和骨骼肌中，被稱為第三肌絲，具有復(fù)雜的生物力學(xué)性質(zhì)和生物化學(xué)功能，是近年來分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點。Titin由300個重復(fù)的區(qū)域串聯(lián)組成，主要包括免疫球蛋白(Ig)和纖連蛋白III型區(qū)域，PEVK(富含脯氨酸，谷氨酸，纈氨酸和賴氨酸)韌性區(qū)以及幾個其他獨特的區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)刪除包括激酶區(qū)域的Titin C-端，會損壞肌原纖維，導(dǎo)致肌肉疾病如肌無力的發(fā)生。

Telethonin也被成為TCAP，在人源中由TCAP基因編碼，在心肌和骨骼肌的Z-線中表達，其功能是調(diào)節(jié)肌節(jié)的組裝、T-小管功能和細胞凋亡。Telethonin包含了167個氨基酸殘基，分子量為19KDa。研究發(fā)現(xiàn)它與幾種疾病的發(fā)生有關(guān)，包括肌帶型營養(yǎng)不良癥，肥厚心肌病，擴張型心肌病和特發(fā)性心肌病等。Telethonin具有獨特的β-折疊結(jié)構(gòu)，從而使其與心臟和骨骼肌的肌聯(lián)蛋白Titin的Z1Z2域呈反向平行的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，Titin的N-端是由兩個免疫球蛋白區(qū)域Z1和Z2組成，而Z1Z2則緊緊地與Telethonin相結(jié)合?；瘜W(xué)鍵研究顯示，后者與Titin的復(fù)合物Z1Z2高度特異性結(jié)合，與兩者的單體卻不產(chǎn)生作用。對Telethonin進行生物化學(xué)方面的研究表明，Telethonin與Z1Z2復(fù)合物的結(jié)合作用是刺激肌肉生長的必要條件。Morten Bertz等研究發(fā)現(xiàn)，Titin-Telethonin之間的裂解力高達700pN，遠遠超過了從Titin測得的其他所有Ig區(qū)域。Titin-telethonin復(fù)合物完美的將巨肌蛋白牢牢錨定在Z-線上。鄒培建等通過X-ray晶體學(xué)手段揭示了巨肌蛋白Titin的氨基酸殘基如何與Telethonin組裝成反向平行的2:1三明治結(jié)構(gòu)。鄒通過體內(nèi)蛋白相互作用試驗，和體外的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，證實了其獨特的結(jié)構(gòu)(如圖1)。不僅如此，鄒還從此結(jié)構(gòu)中受到啟發(fā)，設(shè)計了以Titin/Z1Z2-Telethonin蛋白質(zhì)復(fù)合物為藥物載體作為蛋白質(zhì)藥物研發(fā)的平臺，稱為ZT技術(shù)。對Titin/Z1Z2-Telethonin的研究發(fā)現(xiàn)，此復(fù)合物的大小在56KDa左右，可通過原核宿主表達制備。且來源為人源，免疫原性低，分子之間結(jié)合力牢，超級穩(wěn)定；作為載體，可極大地提高蛋白質(zhì)、多肽藥物的半衰期和穩(wěn)定性，是潛在的蛋白藥物開發(fā)載體。

本發(fā)明受上述前期基礎(chǔ)研究的啟發(fā)，在基因工程手段制備抗菌肽等一系列活性蛋白多肽的基礎(chǔ)上，利用特殊的融合蛋白標簽——具有自切割功能的內(nèi)含肽(intein)、條件性相變的類彈性蛋白(ELPs)和具有多連接點的ZT復(fù)合物(Titin/Z1Z2-Telethonin)組合和優(yōu)化，并將其作為整體應(yīng)用于制備抗菌肽等生物活性蛋白質(zhì)中，避免直接表達抗菌肽對宿主造成的毒性問題；避免傳統(tǒng)的親和層析純化方法，節(jié)約成本，利用支架的強結(jié)合力，高溶解性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，為工業(yè)化大規(guī)模制備抗菌肽等活性蛋白多肽創(chuàng)造了條件。特別是本技術(shù)還具有一定的通用性，可廣泛應(yīng)用于多種生物活性蛋白多肽的高效制備和穩(wěn)定利用，從而大大克服了多肽制備和利用中普遍存在的瓶頸問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法。

本發(fā)明的第二個目的在于提供利用基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法制備獲得的生物活性小肽的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法制備獲得的生物活性小肽。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：一種基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)ELPs介導(dǎo)的C-intein融合LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建：構(gòu)建以大腸桿菌為宿主的牛乳鐵素高效融合表達體系，將pET-22b-EI載體插入通過重疊PCR構(gòu)建的LfcinB，構(gòu)建pET-22b-EI-LfcinB，利用ELPs可逆相變的特性在C-Inteins介導(dǎo)的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸殘基的LfcinB；

(2)根據(jù)Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分別與LfcinB串連，構(gòu)建pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒，以大腸桿菌為宿主制備Titin-LfcinB、Telethonin-LfcinB兩種融合抗菌肽，Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB摩爾量比為1-4:1-4的比例將兩者單體混合后，制備得到ZT-LfcinB，其中1-4個單體串聯(lián)或并聯(lián)穩(wěn)定利用相耦合在一起，并利用Native SDS-PAGE分析顯示組裝成功。

作為一個優(yōu)選方案，Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB的摩爾量比為2:1。

作為一個優(yōu)選方案，EI-LfcinB的優(yōu)化表達條件為，當IPTG的誘導(dǎo)濃度為1mM，誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)表達時間為24h時，目的蛋白可得到最佳表達。

作為一個優(yōu)選方案，內(nèi)含肽自剪切所采用的切割緩沖液為預(yù)冷的含NaCl(1-3M)cleaving buffer。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：利用上述基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法制備獲得的生物活性小肽在制備抗菌或抗病毒藥物中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法制備獲得的生物活性小肽。

本發(fā)明具體分為以下三個部分：

(1)含可自剪切功能的內(nèi)含肽、可相變的類彈力蛋白和蛋白支架多肽Titin/Z1Z2-Telethonin的表達載體設(shè)計和構(gòu)建

構(gòu)建以大腸桿菌為宿主的牛乳鐵素高效融合表達體系，利用實驗室已有的pET-22b-EI載體，分別插入通過重疊PCR構(gòu)建的LfcinB，以及基因合成的2LfcinB、4LfcinB兩種多拷貝的串聯(lián)子片段，成功構(gòu)建pET-22b-EI-LfcinB、pET-22b-EI-2LfcinB、pET-22b-EI-4LfcinB三種表達質(zhì)粒。對以上三種形式的融合抗菌肽進行表達，利用ELPs可逆相變的特性在C-Inteins介導(dǎo)的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸殘基的LfcinB。根據(jù)Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分別與LfcinB串連，構(gòu)建pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒，以大腸桿菌為宿主制備Titin-LfcinB、Telethonin-LfcinB兩種融合抗菌肽，通過一定比例進行組裝制備ZT-LfcinB融合抗菌肽。

(2)活性小分子多肽的無純化標簽表達和溫控相變分離純化及活性檢測

本發(fā)明利用ELPs具有溫度依賴的相變循環(huán)(ITC)特性，可作為蛋白質(zhì)的純化工具，替代傳統(tǒng)親和層析技術(shù)，節(jié)約工藝成本。溫度和pH依賴型的C-Inteins內(nèi)含肽可以介導(dǎo)目的蛋白的自剪切作用使目的蛋白分離，避免了引入蛋白酶或其他試劑所造成的干擾，簡化了蛋白分離步驟和成本。以ELPs介導(dǎo)的Intein多肽融合表達方式，使抗菌肽在胞內(nèi)呈無活性狀態(tài)，避免了其對宿主細胞的抑制作用；表達產(chǎn)物利用瓊脂平板抑菌圈法和MIC測定重組抗菌肽的活性。且步驟簡單方便，節(jié)約時間以及純化成本，是工業(yè)規(guī)模放大的熱點。

(3)利用Titin和Telethonin分別與目標多肽串聯(lián)提高抗菌肽的穩(wěn)定性利用。通過重疊PCR構(gòu)建出Titin-LfcinB和Telethonin-LfcinB基因，并成功構(gòu)建了pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB兩種表達質(zhì)粒。對目的蛋白進行表達后發(fā)現(xiàn)，Titin-LfcinB為上清表達，共有244aa，分子量約為26KDa，可使用鎳柱親和層析方法對融合多肽進行分離純化。對蛋白純化條件進行探索后發(fā)現(xiàn)，最佳咪唑洗脫濃度為400mM，且純度較高，產(chǎn)率為1.27mg/100ml發(fā)酵菌液。Telethonin-LfcinB為包涵體表達，共有156aa，分子量約為17.8KDa。通過包涵體洗滌緩沖液洗滌三次即可得到純度較高的融合多肽，尿素梯度透析復(fù)性后，超濾濃縮，產(chǎn)率為907.9μg/100ml發(fā)酵液。按照摩爾質(zhì)量Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB＝2:1的比例將兩者單體混合后，制備得到ZT-LfcinB，Native SDS-PAGE分析顯示組裝成功。由于Telethonin-LfcinB在組裝的過程中非常容易形成沉淀，因此會殘留少量Titin-LfcinB融合蛋白單體存在于上清中，這為利用原核宿主表達穩(wěn)定活性的抗菌肽奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提出了一種通過自剪切與蛋白支架相組合的生物活性小肽制備及其利用技術(shù)。本發(fā)明在基因工程手段制備抗菌肽的基礎(chǔ)上，利用類彈力蛋白(Elastin-like polypeptides，ELPs)介導(dǎo)的內(nèi)涵肽(Intein)自剪切特性，構(gòu)建以大腸桿菌為宿主的生物活性小肽穩(wěn)定高效融合表達體系，并將蛋白支架ZT技術(shù)運用于抗菌肽的原核表達，對ZT融合表達的生物活性小肽穩(wěn)定性、多效性和高效利用創(chuàng)制了條件。將表達、純化和穩(wěn)定利用相耦合在一起，使整個小肽從構(gòu)建在表達載體到體外組裝成帶有穩(wěn)定支架的藥物，是一個整體流程，較好地克服了某些蛋白質(zhì)及小肽表達生產(chǎn)和利用效率普遍較低的實際問題。這一技術(shù)為克服目前以抗菌肽為代表的生物活性小肽在基因工程研究方面存在的表達效率低、穩(wěn)定性差、對宿主產(chǎn)生毒性、穩(wěn)定性差、分子量小和利用的半衰期短等缺點提供新的途徑和選擇。同時該發(fā)明具有一定的通用性和實用性，利用該組合技術(shù)所制備的生物活性小肽，應(yīng)用領(lǐng)域不局限于抗菌和抗病毒等感染性疾病，其應(yīng)用對象不限于人類，還可用于動物。

附圖說明

圖1為Titin/Z1Z2-Telethonin復(fù)合物示意圖。

圖2為pET-22b-EI-LfcinB重組質(zhì)粒圖譜。

圖3為ET-22b-EI-2LfcinB重組轉(zhuǎn)化子菌落PCR，M:500DL Marker；1-6：單菌落菌液PCR；7：陰性對照。

圖4為pET-22b-EI-4LfcinB重組轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證，M:500DL Marker；1-9：單菌落菌液PCR；10：陰性對照。

圖5為pET-22b-EI-4LfcinB重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖6為ITC技術(shù)純化EI-LfcinB蛋白12％SDS-PAGE，M:蛋白marker；1：細胞破碎后沉淀；2：第一次ITC后上清；3：加入預(yù)冷cleaving buffer后離心沉淀；4:第二次ITC后沉淀EI-LfcinB。

圖7為重組LfcinB蛋白Tricine-SDS-PAGE，M：蛋白marker；1：重組LfcinB。

圖8為IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化SDS-PAGE，M:低分子量蛋白marker；1：0.2mM IPTG；2：0.4mM IPTG；3：0.6mM IPTG；4：0.8mM IPTG；5：1.0mM IPTG。

圖9為IPTG誘導(dǎo)溫度優(yōu)化SDS-PAGE，M:低分子量marker；1：37℃；2：30℃；3：25℃；4：20℃；5：16℃。

圖10為IPTG誘導(dǎo)時間優(yōu)化SDS-PAGE，M：低分子量蛋白marker；1：誘導(dǎo)6h；2：誘導(dǎo)18h；3：誘導(dǎo)24h；4：誘導(dǎo)32h；5：誘導(dǎo)48h。

圖11為ITC技術(shù)純化EI-2LfcinB/EI-4LfcinB蛋白12％SDS-PAGE，M：蛋白marker；1/1’：誘導(dǎo)前細胞裂解液；2/2’：誘導(dǎo)后細胞裂解液；3/3’：第一次ITC沉淀。

圖12為加入重組LfcinB后細菌生長曲線測定，A.金黃色葡萄球菌生長曲線；B.大腸桿菌生長曲線。

圖13為重組LfcinB的抑菌活性檢測，a.LfcinB抗金黃色葡萄球菌抑菌圈。1：重組LfcinB濃度112μg/ml；2：重組LfcinB濃度56μg/ml；3：重組LfcinB濃度28μg/ml；4：重組LfcinB濃度14μg/ml；5：陽性對照AMP 10μg/ml。b.LfcinB抗大腸桿菌抑菌圈。1：重組LfcinB濃度112μg/ml；2：重組LfcinB濃度56μg/ml；3：重組LfcinB濃度28μg/ml；4：重組LfcinB濃度14μg/ml；5：陽性對照AMP 10μg/ml。

圖14重組LfcinB的MIC測定，A.LfcinB對金黃色葡萄球菌的MIC；B.LfcinB對大腸桿菌的MIC。

圖15 Titin-LfcinB基因PCR擴增，M:DL2000DNA maker；1:Titin-LfcinB第一次PCR；2:Titin-LfcinB第二次PCR。

圖16 pET-24a-Titin-LfcinB重組質(zhì)粒圖譜。

圖17 Telethonin-LfcinB基因PCR擴增，M:DL2000DNA maker；1:Telethonin第一次PCR；2:Telethonin第二次PCR。

圖18轉(zhuǎn)化子菌液PCR擴增結(jié)果，M:2000bp Marker；1-7:單克隆轉(zhuǎn)化子。

圖19 pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒圖譜。

圖20 Bradford法測定蛋白濃度標準曲線。

圖21 Titin-LfcinB蛋白15％SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：誘導(dǎo)前；2：導(dǎo)后菌液；3：破碎液離心上清；4：離心沉淀；5：鎳柱流穿液；6：400mM咪唑流穿液；7：400mM咪唑洗脫液；8：超濾后濃縮液。

圖22 Telethonin-LfcinB蛋白15％SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：誘導(dǎo)后菌液；2：10000rpm離心上清；3：第一次包涵體洗滌液；4：第二次包涵體洗滌液；5：包涵體變性溶解溶液。

圖23 ZT-LfcinB蛋白15％Native SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：ZT-LfcinB 4℃組合48h；2：Telethonin-LfcinB；3：超濾濃縮Titin-LfcinB。

圖24 ZT-LfcinB的抑菌活性檢測，ZT-LfcinB抗大腸桿菌抑菌圈。1：實驗組ZT-LfcinB 500μg/ml；2：陽性對照AMP 5μg/ml；3：陽性對照AMP 10μg/ml ZT-LfcinB抗金黃色葡萄球菌抑菌圈。1-3：實驗組ZT-LfcinB 500μg/ml；4：陰性對照組ddH2O；5：陽性對照AMP 5μg/ml。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次或三次以上重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

實施例1.ELPs介導(dǎo)的C-intein融合LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用實驗室已有的pET-22b-EI-mCherry質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶將原有的mCherry基因切除，替換上PCR擴增或全基因合成的lfcinb、2lfcinb和4lfcinb基因，構(gòu)建了pET-22b-EI-LfcinB、ET-22b-EI-2LfcinB、pET-22b-EI-4LfcinB三種重組表達質(zhì)粒。核酸電泳驗證和測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3LfcinB基因序列:由于LfcinB的長度只有75bp，25個氨基酸殘基，其氨基酸序列為FKCRRWQW RMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：1)，因此可以直接設(shè)計兩個較長引物，利用重疊PCR得到目的基因。其引物設(shè)計如下:

LfcinB-F：

CAGCGTGTACACAACATGTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGBsrGI(SEQ ID NO：2)

LfcinB-R：

CCCAAGCTTTTACCATGGAAAGGCACGACGCACACAGGTGATAGACGHindIII(SEQ ID NO：3)

2LfcinB氨基酸序列和基因序列

氨基酸序列：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：4)

基因序列：

TGTACACAACTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTTAAAAGCTT(SEQ ID NO：5)

4LfcinB氨基酸序列和基因序列:氨基酸序列：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：6)

基因序列：

TGTACACAACTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTT TAAAAGCTT(SEQ ID NO：7)

表1.引物

pET-22b-EI-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

LfcinB重疊PCR擴增：設(shè)計LfcinB-F和LfcinB-R兩個長引物，C-端有20bp重疊序列，通過退火將兩引物通過重疊部分結(jié)合起來，延伸得到LfcinB基因全長。電泳結(jié)果顯示，在80-100bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，擴增成功。

pET-22b-EI-2LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將全基因合成的含有2LfcinB的質(zhì)粒pUC57-2LfcinB轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)進行培養(yǎng)，挑取單克隆轉(zhuǎn)化子擴增，提取質(zhì)粒。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BsrGI和HindIII雙酶切，通過3％瓊脂糖凝膠電泳得到2LfcinB的目的基因單一條帶，隨后通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因片段，與線性化的質(zhì)粒pET-22b-EI進行過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鋪平板培養(yǎng)后，挑取單克隆子進行菌液PCR，隨后進行3％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖3所示。挑取1-2號菌液送睿迪生物技術(shù)公司測序顯示，目的基因2LfcinB已正確連接到載體上，pET-22b-EI-2LfcinB重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

pET-22b-EI-4LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將全集因合成的含有4LfcinB的質(zhì)粒pUC57-4LfcinB轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)進行培養(yǎng)。挑取單克隆轉(zhuǎn)化子擴增，提取質(zhì)粒，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BsrGI和HindIII雙酶切。通過2％瓊脂糖凝膠電泳得到4LfcinB的目的基因單一條帶，隨后通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因，與線性化的質(zhì)粒pET-22b-EI進行過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞DH5α，鋪平板培養(yǎng)后，挑取單克隆子進行菌液PCR，隨后進行2％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖4所示。

挑取5-9號菌液送睿迪生物技術(shù)公司測序顯示，目的基因4LfcinB已正確連接到載體上，pET-22b-EI-4LfcinB重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖5為構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒譜。

實施例2.EI-LfcinB的表達和純化

EI-LfcinB的表達：在對目的蛋白的表達條件進行摸索后，發(fā)現(xiàn)EI-LfcinB、EI-2LfcinB、EI-4LfcinB三種重組蛋白中只有EI-LfcinB得到了有效的表達，而EI-2LfcinB、EI-4LfcinB導(dǎo)入到兩種不同的表達宿主中都不能得到表達。因此，只對EI-LfcinB的表達條件進行了摸索，并成功純化出了LfcinB抗菌肽。EI-LfcinB的表達與純化結(jié)果如圖6所示。

由圖6可看出EI-LfcinB在E.coli BL21(DE3)中得到了表達，通過兩次ITC循環(huán)可以得到融合蛋白EI-LfcinB，大小在67KD左右。但是這種方法也存在一些不足，由圖可看到通過ITC純化后的融合蛋白中仍有少量雜蛋白存在。

重組LfcinB的純化：將得到的融合蛋白EI-LfcinB在自剪切緩沖液中22℃水浴16h，收集上清，Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示獲得了純度>95％的重組LfcinB抗菌肽。雙縮脲法測定重組LfcinB的濃度為2mg/100ml發(fā)酵液。

雖然使用EI標簽進行兩次ITC后沒有得到較純的融合蛋白，目的蛋白下方仍會出現(xiàn)雜帶，但由圖7可知，在進行Intein自剪切反應(yīng)后，通過ITC可以將雜帶完全除去。而目的多肽LfcinB分子量很小，則可以留在上清中。由此可得到高純度的重組抗菌肽。

實施例4.EI-LfcinB誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化與純化

為了提高EI-LfcinB的產(chǎn)量，我們對pET-22b-EI-LfcinB/E.coli BL21(DE3)的表達條件進行了探索和優(yōu)化，結(jié)果如下所示。

(1)EI-LfcinB加入IPTG濃度優(yōu)化

設(shè)計了五個實驗組，恒溫搖床中37℃，200rpm培養(yǎng)2-3h，待OD₆₀₀達到約0.5后分別向每組試管中加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的IPTG，轉(zhuǎn)至20℃誘導(dǎo)表達24h。直接收集菌體進行SDS-PAGE，結(jié)果圖8顯示當IPTG的誘導(dǎo)濃度為1.0mM時，EI-LfcinB的表達量最高。

(2)EI-LfcinB加入IPTG誘導(dǎo)表達溫度優(yōu)化

設(shè)計了五個實驗組，恒溫搖床中37℃，200rpm培養(yǎng)2-3h，待OD₆₀₀達到約0.5后加入終濃度為1.0mM的IPTG，然后將5支試管分別放入37℃、30℃、25℃、20℃、16℃誘導(dǎo)表達24h。直接收集菌體進行SDS-PAGE，結(jié)果圖9顯示當溫度在25℃時，EI-LfcinB的表達量最高。

(3)EI-LfcinB表達時間優(yōu)化

設(shè)計了五個實驗組，恒溫搖床中37℃，200rpm培養(yǎng)2-3h，待OD₆₀₀達到約0.5后加入終濃度為1.0mM的IPTG，然后將5支試管置于25℃誘導(dǎo)表達6h、18h、24h、32h、48h。直接收集菌體進行SDS-PAGE，結(jié)果圖10顯示當表達時間為24h時，EI-LfcinB的表達量最高。

綜上所述，對EI-LfcinB的表達條件進行優(yōu)化后可知，當IPTG的誘導(dǎo)濃度為1mM，誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)表達時間為24h時，目的蛋白可得到最佳表達。

(4)EI-2LfcinB和EI-4LfcinB的表達純化

由SDS-PAGE結(jié)果分析圖11可知，雖然EI-2LfcinB和EI-4LfcinB的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，但并不能表達出正確大小的融合蛋白。經(jīng)過自剪切反應(yīng)16h后，對離心上清進行Tricine-SDS-PAGE，并未得到任何多肽電泳條帶。

實施例5.重組LfcinB的抑菌活性檢測

(1)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長曲線測定

由圖12可知，加入了64μg/ml重組LfcinB的實驗組比對照組菌體生長更加緩慢，說明實驗制備的重組LfcinB對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑菌活性。且LfcinB對革蘭氏陽性菌的抑菌活性強于對革蘭氏陰性菌的作用。

(2)瓊脂擴散法測定LfcinB抑菌活性

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌測定了制備的重組LfcinB抗菌肽的抑菌活性，并進行了三組重復(fù)實驗。

圖13a為瓊脂擴散法測定LfcinB對金黃色葡萄球菌的抑菌活性結(jié)果。圖13b為瓊脂擴散法測定LfcinB對大腸桿菌的抑菌活性結(jié)果。標注的1-4分別表示牛津杯中加入了200ml終濃度為112μg/ml、56μg/ml、28μg/ml、14μg/ml的LfcinB作用18h后的抑菌圈；5表示加入了200ml終濃度為10μg/ml的AMP陽性對照。瓊脂擴散法檢測結(jié)果顯示，重組LfcinB抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有殺菌作用。實驗結(jié)果顯示，112μg/ml的LfcinB對金黃色葡萄球菌可以平均產(chǎn)生14mm直徑的抑菌圈，對大腸桿菌可以產(chǎn)生約10mm直徑的抑菌圈。隨著LfcinB使用量的減少，抑菌圈直徑也逐漸減少。

(3)微量稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)

純化后的重組LfcinB抗菌肽的濃度為2mg/ml，將其用無菌MH培養(yǎng)基兩倍連續(xù)稀釋后，與等體積的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，進行MIC測定。實驗結(jié)果圖14顯示，重組LfcinB對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別在56μg/ml和112μg/ml。

表2.重組LfcinB的MIC

實施例6.ZT-LfcinB融合抗菌肽在大腸桿菌中的構(gòu)建

(1)引物設(shè)計

表3.Titin引物

表4.Telethonin引物

(2)Z-LfcinB的重疊PCR擴增

表5.Z-LfcinB PCR反應(yīng)體系(F2-R2)

表6.Z-LfcinB反應(yīng)條件(F2-R2)

用PCR純化試劑盒對產(chǎn)物進行回收。

表7.Z-LfcinB PCR反應(yīng)體系(F1-R1)

表8.Z-LfcinB反應(yīng)條件(F1-R1)

(3)T-LfcinB的重疊PCR擴增

表9.T-LfcinB PCR反應(yīng)體系(F2-R2)

表10.T-LfcinB反應(yīng)條件(F2-R2)

用PCR純化試劑盒對產(chǎn)物進行回收。

表11.T-LfcinB PCR反應(yīng)體系(F1-R1)

表12.T-LfcinB反應(yīng)條件(F1-R1)

(4)目的片段的回收和表達載體的雙酶切鑒定

pET-24a-Titin/Telethonin質(zhì)粒線性化

表13.雙酶切體系

37℃水浴反應(yīng)1h，加入10×DNA loading buffer終止反應(yīng)，并加入適量Gelred。

(5)目的基因Titin-LfcinB雙酶切

表14.雙酶切體系

37℃水浴反應(yīng)1h，加入10×DNA loading buffer終止反應(yīng)，并加入適量Gelred。

(6)目的基因Telethonin-LfcinB雙酶切

表15.雙酶切體系

37℃水浴反應(yīng)1h，加入10×DNA loading buffer終止反應(yīng)，并加入適量Gelred。

(7)目的片段和表達載體的連接

分別將目的片段和載體進行瓊脂糖凝膠電泳，并進行膠回收，進行酶切產(chǎn)物連接。

表16.酶切產(chǎn)物連接體系

(8)pET-24a-Titin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

Titin-LfcinB重疊PCR擴增，通過兩次PCR，將LfcinB基因拼接到Titin的3’-端。圖15電泳結(jié)果顯示，在500-750bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，擴增成功。

(9)pET-24a-Titin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述PCR純化回收得到的Titin-LfcinB目的片段和線性化的質(zhì)粒pET-24a進行過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鋪平板培養(yǎng)后，挑取單克隆子進行菌液PCR驗證，隨后進行3％瓊脂糖凝膠電泳。菌落PCR結(jié)果顯示，在1000bp左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的長度一致。挑取1、3、4號菌液送睿迪生物技術(shù)公司測序顯示，目的基因Titin-LfcinB已正確連接到載體上，pET-24a-Titin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。圖16為構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒圖。

(10)pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

Telethonin-LfcinB重疊PCR擴增，通過兩次PCR，將LfcinB基因拼接到Telethonin的3’-端。電泳結(jié)果顯示，在500bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，擴增成功。結(jié)果如圖17所示。

pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

將上述PCR純化回收得到的Telethonin-LfcinB目的片段和線性化的質(zhì)粒pET-24a進行過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鋪平板培養(yǎng)后，挑取單克隆子進行菌液PCR驗證，隨后進行3％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖18所示。

菌落PCR結(jié)果顯示，在750bp左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的長度一致。挑取3、4、5號菌液送睿迪生物技術(shù)公司測序顯示，目的基因Telethonin-LfcinB已正確連接到載體上，pET-24a-Telethonin-LfcinB重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

實施例7.ZT-LfcinB融合抗菌肽表達、純化與活性測定

(1)目的蛋白的表達

①挑取BL21轉(zhuǎn)化子單菌落接種于含Kan⁺(50μg/ml)的5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)；

②取培養(yǎng)過夜的菌液按1:100的比例加入到含Kan⁺(50μg/ml)的100ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)約2.5h，至OD₆₀₀達到0.5左右；

③加入IPTG至終濃度為1mM,37℃，200rpm誘導(dǎo)6h；

④收集培養(yǎng)液，4℃，12000rpm離心10min，棄上清收集菌體；

⑤加入15ml PBS重懸菌體，4℃，12000rpm離心10min，棄上清收集菌體，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

⑥加入10ml預(yù)冷的PBS重懸菌體，4℃高壓勻漿破碎細胞。

(2)目的蛋白的純化

1.上清表達的Titin-LfcinB的Ni-NTA純化

①將破碎后的菌液4℃，12,000rpm離心15min，收集上清；

②組裝Ni柱，用5×柱體積的ddH₂O洗去20％的乙醇，除盡空氣；

③用10×柱體積的PBS緩沖液進行柱平衡；

④緩慢加入蛋白樣品，上清使用前先用0.22μm的濾膜過濾；

⑤用5×柱體積的NTA梯度20，60，100，200，300，400，600Buffer緩慢洗脫，收集各梯度流穿液，SDS-PAGE分析最佳洗脫條件；

⑥用10×柱體積的NTA-600洗脫柱子；

⑦用10×柱體積的ddH₂O清洗柱子；

⑧加入20％乙醇溶液，4℃保存；

⑨將純化洗脫的蛋白質(zhì)進行透析并超濾濃縮，-20℃保存。

2.包涵體表達的Telethonin-LfcinB的純化

①將破碎后的菌液4℃，10,000rpm離心15min，收集沉淀；

②加入包涵體洗滌液重懸沉淀，冰浴下200rpm轉(zhuǎn)子攪拌10min，4℃，8000rpm離心15min，棄上清；

③重復(fù)三次；

④加入包涵體變性緩沖液10ml，冰浴下200rpm轉(zhuǎn)子攪拌30min，4℃，8000rpm離心15min，取上清；

⑤將上清進行超濾濃縮，-20℃保存；

⑥各步驟均留樣進行SDS-PAGE。

3.Bradford法測定純化后的蛋白濃度

a.BSA標準曲線的繪制

①將0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml牛血清白蛋白(BSA)標準溶液(100μg/ml)分別加入到試管中，加入補足ddH₂O到1ml；

②向各試管中加入5ml考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5-10min；

③用分光光度計測定595nm處的吸光值，并記錄讀數(shù)；以不含BSA的樣品的光吸收值作為空白對照；繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。標準曲線如圖20所示。

表17.標準曲線表

(3)ZT-LfcinB自組裝

測定純化并濃縮后的融合抗菌肽濃度，按照Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB＝2:1的比例進行混合，并在透析的條件下進行48h自組裝。超濾濃縮組裝后的ZT-LfcinB。

(4)ZT-LfcinB融合抗菌肽活性測定

1.瓊脂擴散法測定ZT-LfcinB抑菌活性

①按0.8％的比例向蒸餾水中加入瓊脂粉末，121℃高溫滅菌，取約7ml平鋪于無菌的平板中，凝固待用；

②用接種環(huán)挑取單個待檢菌落，接種于5ml的MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，3-6h使其OD₆₀₀＝0.6；

③按比例取0.5ml上述菌液至50ml含1％瓊脂的LB培養(yǎng)基中使菌量保持在2-7×10⁵CFU/ml。無菌條件下用約15ml的量均勻鋪于培養(yǎng)皿上，完全凝固后待用；

④向完全凝固的瓊脂平板上放入牛津杯，將純化后的重組ZT-LfcinB用0.22μm濾膜過濾，取200μl加入相應(yīng)的牛津杯中，37℃靜置培養(yǎng)16-24h，測定抑菌圈大小。本實驗以AMP作陽性對照，ddH₂O作陰性對照。

⑤重復(fù)上述實驗三次。

(5)ZT-LfcinB融合抗菌肽的純化

Titin-LfcinB的純化：Titin-LfcinB融合抗菌肽為上清表達，因其N-端帶有6×His組氨酸標簽，遂采用鎳柱親和層析的方法分離純化。細菌破碎后離心取上清，用0.22μm濾膜過濾，緩慢加入鎳柱中，并用咪唑梯度洗脫，圖21結(jié)果SDS-PAGE分析可知，當咪唑濃度為400mM時洗脫條件最佳，純度可達95％以上。通過超濾管離心濃縮后，Brad-ford測定蛋白濃度為1.27mg/100ml發(fā)酵菌液。

(6)Telethonin-LfcinB的純化

Telethonin-LfcinB融合抗菌肽為包涵體表達，遂采用包涵體洗滌的方法分離純化。細菌破碎后離心取沉淀，加入包涵體洗滌緩沖液洗滌三次，加入含8M尿素的變性緩沖液充分溶解融合抗菌肽，并通過尿素梯度透析24h緩慢復(fù)性。超濾離心濃縮后，由SDS-PAGE分析可知，包涵體洗滌緩沖液洗滌三次后可完全除去膜蛋白等雜質(zhì)，純度可達95％以上。Brad-ford測定蛋白濃度為907.9μg/100ml發(fā)酵菌液。

(7)ZT-LfcinB融合抗菌肽

圖22和圖23顯示，將分別超濾濃縮后的Titin-LfcinB和Telethonin-LfcinB融合多肽按照摩爾量2:1的比例混合，4℃下靜置組裝48h，12,000rpm離心后取上清，Native SDS-PAGE顯示，形成了ZT-LfcinB融合多肽。我們發(fā)現(xiàn)，由于Telethonin-LfcinB在組裝的過程中非常容易形成沉淀，因此會殘留少量Titin-LfcinB融合蛋白單體存在于上清中。超濾管離心濃縮后，Brad-ford測定蛋白濃度為2mg/ml。

(8)瓊脂擴散法測定ZT-LfcinB融合抗菌肽活性

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌測定了制備的ZT-LfcinB融合抗菌肽的MIC，并進行了三組重復(fù)實驗。圖24a為瓊脂擴散法測定ZT-LfcinB對大腸桿菌的抑菌活性結(jié)果。圖中標注的1表示牛津杯中加入了200ml濃度為500μg/ml的ZT-LfcinB作用18h后的抑菌圈；2和3分別表示牛津杯中加入了200ml濃度為5μg/ml和10μg/ml AMP產(chǎn)生的抑菌圈。圖24b為瓊脂擴散法測定ZT-LfcinB對金黃色葡萄球菌的抑菌活性結(jié)果。標注的1-3表示牛津杯中加入了200ml濃度為500μg/ml的ZT-LfcinB作用18h后的抑菌圈；4表示200ml的ddH₂O陰性對照組，5表示加入的200ml 5μg/ml AMP產(chǎn)生的抑菌圈。由圖24可知，當ZT-LfcinB的濃度高達500μg/ml時對這兩種試驗菌仍然沒有肉眼可見的抑菌作用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 華東理工大學(xué)

<120> 一種基于組合自剪切與蛋白支架的生物活性小肽制備方法

<130> /

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

20 25

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cagcgtgtac acaacatgtt caaatgccgt cgttggcagt ggcgtatgaa aaaactgggt 60

gctc 64

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cccaagcttt taccatggaa aggcacgacg cacacaggtg atagacggag cacccagttt 60

tttcata 67

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys

20 25 30

Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

35 40 45

Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

50 55

<210> 5

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgtacacaac ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 60

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 120

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg ccttttaaaa 180

gctt 184

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys

20 25 30

Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

35 40 45

Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys Cys Arg

50 55 60

Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys

65 70 75 80

Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys Cys Arg Arg Trp

85 90 95

Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg

100 105 110

Arg Ala Phe

115

<210> 7

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tgtacacaac ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 60

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 120

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa 180

caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 240

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 300

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg ccttttaaaa 360

gctt 364

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

taatacactc actataggg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgctagttat tgctcagcgg 20

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cagcgtgtac acaacatgtt caaatgccgt c 31

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggaattccat atgcatcatc atcaccacca tagcagca 38

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

catatgcatc atcatcacca ccatagcagc atgaccaccc aggcaccga 49

<210> 13

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccgctcgagt taaaaggcac gacgcacaca ggtgatagac ggagcaccca gttttttcat 60

acgccactgc caacgacggc atttgaaag 89

<210> 14

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tgccaacgac ggcatttgaa agaaccacca ccaccagaac caccaccacc agaaccacca 60

ccaccgccct gcaccagcag ctcgg 85

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ggaattccat atgaaacatc accatcacca tcacccca 38

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aaacatcacc atcaccatca cccca 25

<210> 17

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tgccaacgac ggcatttgaa agaaccacca ccaccagaac caccaccacc agaaccacca 60

ccacccggca gtacccgctg gtagg 85