技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種纖維素外切酶多拷貝表達(dá)提高黑曲霉纖維素酶酶活的方法。

背景技術(shù)：

黑曲霉纖維素酶是一種廣泛應(yīng)用的酶類(lèi)，黑曲霉具有很好的食品安全性，是食品或工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的菌種。黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶酶系組成中，纖維素外切酶的活力相對(duì)較低。已有的提高黑曲霉纖維素酶酶活的方法是通過(guò)基因工程的手段導(dǎo)入纖維素外切酶基因，提高外切酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，從而提高纖維素酶蛋白的分泌量。

一些多克隆研究中，有些通過(guò)多克隆的基因表達(dá)量增加的不多，或者是三拷貝的基因克隆與二拷貝的基因克隆相比，目標(biāo)基因表達(dá)量幾乎沒(méi)有大的提升。已有的多克隆增加基因表達(dá)量的方法采用的都是相同的信號(hào)肽，信號(hào)肽對(duì)胞外酶的分泌具有重要的影響。信號(hào)肽與其連接的蛋白構(gòu)成一個(gè)分泌的蛋白整體，這個(gè)蛋白整體的電荷分布、分子量大小、蛋白的形狀等都影響到分泌的效率。相同信號(hào)肽連接的蛋白在外分泌的過(guò)程中可能有分泌競(jìng)爭(zhēng)存在，這樣即使是二克隆或三克隆表達(dá)的蛋白也不能迅速分泌向胞外。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種纖維素外切酶多拷貝表達(dá)提高黑曲霉纖維素酶酶活的方法，以及通過(guò)該方法得到的黑曲霉菌株。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種纖維素外切酶多拷貝表達(dá)提高黑曲霉纖維素酶酶活的方法，包括如下步驟：

（1）構(gòu)建以啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列為基本單元的纖維素外切酶多拷貝表達(dá)盒。表達(dá)盒中各單元的信號(hào)肽編碼序列均不相同；相鄰兩個(gè)單元之間優(yōu)選通過(guò)連接序列連接。

（2）在纖維素外切酶多拷貝表達(dá)盒兩端加入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶將表達(dá)盒構(gòu)建到表達(dá)載體上。

（3）將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到黑曲霉中，轉(zhuǎn)化有重組載體的黑曲霉菌株纖維素酶酶活得到提高。

步驟（1）中所述的纖維素外切酶多拷貝表達(dá)盒的組成優(yōu)選為：?jiǎn)?dòng)子序列-信號(hào)肽1編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列-連接序列-啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽2編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列-連接序列-啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽3編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列。所述的啟動(dòng)子序列、信號(hào)肽1編碼序列、纖維素外切酶編碼序列、終止子序列、連接序列、信號(hào)肽2編碼序列、信號(hào)肽3編碼序列分別優(yōu)選如SEQ ID NO.1-7所示。

步驟（2）中所述的表達(dá)載體優(yōu)選為pCAMBIA1300；所述的限制性?xún)?nèi)切酶優(yōu)選為EcoRI和PmeI。

步驟（3）優(yōu)選通過(guò)農(nóng)桿菌將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到黑曲霉中。

步驟（3）中所述的黑曲霉優(yōu)選為黑曲霉ATCC16404。

一種黑曲霉菌株，為上述轉(zhuǎn)化有重組載體的黑曲霉菌株。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明利用不同的信號(hào)肽進(jìn)行組合，避免相同信號(hào)肽競(jìng)爭(zhēng)，從而提高了黑曲霉所產(chǎn)纖維素酶的酶活。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料

黑曲霉ATCC16404，質(zhì)粒pCAMBIA1300（Biovector），農(nóng)桿菌EHA105，大腸桿菌DH5α，限制性?xún)?nèi)切酶（TakaRA）等。

合成的兩段有酶切位點(diǎn)的多拷貝表達(dá)片段1，多拷貝表達(dá)片段1的序列組成為：GGGAATTC（EcoRI酶切位點(diǎn)序列）-啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽1編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列-終止子與啟動(dòng)子之間的連接序列（連接序列）-啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽2編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列-連接序列-啟動(dòng)子序列-信號(hào)肽3編碼序列-纖維素外切酶編碼序列-終止子序列- GTTTAAACGG（PmeI酶切位點(diǎn)序列）。其中，啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.1所示，信號(hào)肽1編碼序列如SEQ ID NO.2所示，纖維素外切酶編碼序列如SEQ ID NO.3所示，終止子序列如SEQ ID NO.4所示，連接序列SEQ ID NO.5所示，信號(hào)肽2編碼序列如SEQ ID NO.6所示，信號(hào)肽3編碼序列如SEQ ID NO.7所示。

2、方法

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）質(zhì)粒pCAMBIA1300的提取

含有pCAMBIA1300的大腸桿菌DH5α接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基：氯化鈉1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃滅菌20min，加入微孔過(guò)濾的卡那霉素，卡那霉素在LB中的終濃度為30μg/mL）中，35℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照說(shuō)明書(shū)說(shuō)明提取pCAMBIA1300質(zhì)粒，提取步驟如下：

使用前請(qǐng)先在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

1）柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2）取2mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm（13400×g）離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。

4）向離心管中加入250μL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

5）向離心管中加入350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm（13400×g）離心10min。

6）將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

7）可選步驟：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步可省略。

8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

9）重復(fù)操作步驟8）。

10）將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

11）將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測(cè)序，需使用ddH₂O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

（2）質(zhì)粒pCAMBIA1300、多拷貝表達(dá)片段1的酶切和電泳

往41μL pCAMBIA1300質(zhì)粒溶液或多拷貝表達(dá)片段1溶液中加入2μL EcoRI、2μL PmeI和5μL酶切緩沖液，總體積為50.0μL，在30℃酶切2h。使用瓊脂糖凝膠電泳試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行電泳。

1）打開(kāi)試劑盒，依照說(shuō)明書(shū)清點(diǎn)各種試劑，并按實(shí)驗(yàn)需要量將50×電泳緩沖液稀釋為1×電泳緩沖液待用；將核酸熒光染料與6×Loading Buffer按1:1比例混合備用。

2）把U型凝膠托盤(pán)放入制膠槽中，插好梳子，置于一水平面上。

3）將0.25g瓊脂糖加到盛有適當(dāng)體積1×電泳緩沖液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝膠濃度0.8-1.2%）。

4）將瓶口用封口膜輕輕蓋住，在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖完全熔化（熔化到?jīng)]有小顆粒物為止）。

5）將溫?zé)岬哪z溶液倒入U(xiǎn)型凝膠托盤(pán)中（超過(guò)二分之一處）。

6）將凝膠室溫放置15-30min完全冷卻至凝固，小心拔除梳子，將凝膠托盤(pán)移入電泳槽，梳井（點(diǎn)樣孔）一端朝負(fù)極方向，加入1×電泳緩沖液，使凝膠全部被浸沒(méi)。

7）將樣品與6×Loading Buffer和核酸熒光染料充分混合（20μL樣品+1μL 6×Loading Buffer+1μL核酸熒光染料），用微量移液器將以上混合物緩慢加入梳井內(nèi)，注意避免引入氣泡。

8）蓋上電泳槽蓋，樣品應(yīng)向陽(yáng)極（紅色插頭）泳動(dòng)，提供5-10V/cm的電壓。

9）當(dāng)樣品與染料在凝膠中遷移到足夠距離時(shí)，關(guān)上電源，拔出電極插頭和打開(kāi)電泳槽蓋，在DNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶。

（3）膠回收

使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收質(zhì)粒pCAMBIA1300、多拷貝表達(dá)片段1的酶切、電泳產(chǎn)物。

1）從瓊脂糖凝膠中割下含目的條帶的膠塊，稱(chēng)重。

2）加入膠塊重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分鐘溶膠。

3）選做，對(duì)于<500bp的片段，加入1/3 Buffer B2體積的異丙醇。

4）將溶膠液移入吸附柱中，8000×g離心30秒。倒掉收集管中液體。

5）加入500μL Wash Solution，9000×g離心30秒，倒掉收集管中液體。

6）重復(fù)步驟5）一次。

7）空吸附柱于9000×g離心1分鐘。

8）將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。保存管中DNA溶液。

（4）質(zhì)粒pCAMBIA1300和多拷貝表達(dá)片段1的連接

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）進(jìn)行連接。

1）將酶切的質(zhì)粒pCAMBIA1300與酶切的多拷貝表達(dá)片段1混合制備成體積為10μL的DNA溶液，質(zhì)粒和多拷貝表達(dá)片段1的體積比為1:3。

2）向上述DNA溶液中加入等體積的 Solution I，充分混勻。

3）16℃反應(yīng)12h。

（5）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和篩選

1）從-80℃冰箱中取100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上溶解10分鐘。

2）取10μL上述連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。

3）42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻2分鐘。

4）加入890μL LB 液體培養(yǎng)基（不含Kan），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（KanR）。

5）將上述菌液搖勻后取100μL涂布于含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后挑取部分轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)后，提質(zhì)粒驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-pc1。

二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉及黑曲霉轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵

（1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1）在新活化的農(nóng)桿菌EHA105的LB平板（LB液體培養(yǎng)基添加5%瓊脂）上，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基。

2）28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.7。

3）取1.5mL無(wú)菌離心管，每管分裝1mL菌液，6000r/min離心10min。

4）去除上清，用1mL 10%無(wú)菌甘油重懸菌體，6000r/min離心10min，重復(fù)此過(guò)程3次，充分洗滌菌體以去除殘留的培養(yǎng)基。

5）洗好的菌體用100μL 20%無(wú)菌甘油重懸，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

1）將100μL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入10μL重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-pc1，充分混勻，冰上放置30min。

2）置液氮中快速冷卻約1min后迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化。

3）加1mL無(wú)抗生素的YM 液體培養(yǎng)基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麥芽糖0.5%，自然pH）于28℃、230r/min培養(yǎng)2-4h。

4）3000r/min離心2min收集菌體，將上清吸去500μL，剩余液體重懸培養(yǎng)菌后直接涂布含氨芐霉素30μg/mL的YM平板，28℃、230r/min培養(yǎng) 36h。

5）挑取單菌落接種到含氨芐霉素的YM液體培養(yǎng)基中，28℃、250r/min 培養(yǎng)48h，將菌液用于保存-20℃，得到含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-pc1的農(nóng)桿菌。

（3）黑曲霉菌絲的制備

1）從-80℃冰箱取出甘油管保藏的黑曲霉ATCC16404菌株，置于室溫下，快速解凍。

2）吸取適量菌液加到淀粉培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將菌液涂布均勻（或者用無(wú)菌接種環(huán)蘸取適量菌液作平板劃線(xiàn)分離），34℃恒溫培養(yǎng)5天。

3）待平板上長(zhǎng)出單菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落移至裝有察氏培養(yǎng)基的三角瓶中，34℃培養(yǎng)5天。

4）將三角瓶中菌液全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管，8000rpm離心5min，棄去上清。

5）加入20mL生理鹽水，反復(fù)吹打混勻，8000rpm離心洗滌 5min，棄上清，再加入適量生理鹽水重懸使菌體濃度OD₆₀₀值達(dá)到1.5左右，留待轉(zhuǎn)化用。

（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉

1）試劑的配制

無(wú)機(jī)鹽液：將2.61g KCl、7.48g KH₂PO₄和29.8g NaNO₃溶于80mL水中，再加水定容至100mL，用5M KOH調(diào)pH至5.5，高壓滅菌，4℃保存。

50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

1M MgSO₄：24.7g MgSO₄溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

MM微量元素溶液：將1.1g H₃BO₃、2.1g ZnSO₄·7H₂O、0.16g CuSO₄·5H₂O、0.5g MnC1₂·4H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、0.17g CoC1₂·6H₂O、0.15g Na₂MoO₄·2H₂O和0.1g EDTA溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。

MM選擇培養(yǎng)平板：取20mL無(wú)機(jī)鹽溶液、20mL 50%葡萄糖溶液、2mL 1M MgSO₄溶液、1mL MM微量元素溶液加入到957mL經(jīng)高壓滅菌含有20g瓊脂粉的蒸餾水中使總體積至1L，充分混勻（即瓊脂濃度2%）。當(dāng)溫度降至60℃，加入1mL 100mg/mL潮霉素B（終濃度100μg/mL）和1mL 0.2M頭孢噻肟（終濃度0.2mM），加入1mL 200mM乙酰丁香酮（終濃度0.2mM)，混合均勻后制成MM選擇培養(yǎng)平板。

PDA培養(yǎng)基：①稱(chēng)量和熬煮：按培養(yǎng)基配方逐一稱(chēng)取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000mL，在加熱器上加熱至沸騰，維持20-30min，用2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄取。②加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所1000mL。

2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉

在含有200μM乙酰丁香酮的IM培養(yǎng)基平板上貼一層玻璃紙濾膜（盡量不要產(chǎn)生氣泡），將100μL黑曲霉菌絲懸液與100μL轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-pc1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液等體積混合均勻后涂布于濾膜上，22.5℃避光培養(yǎng)3天。將濾膜轉(zhuǎn)移至含有200μM頭孢噻肟（目的殺死農(nóng)桿菌細(xì)胞）和100μg/mL潮霉素的MM選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)4-6天，篩選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉pc1。

（5）黑曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵

轉(zhuǎn)化子選育：將黑曲霉pc1接種到PDA平板上，30℃培養(yǎng) 6d，得到孢子。挑取的孢子用無(wú)菌水稀釋到孢子濃度為1×10⁷/mL，涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)72h得到單菌落，單菌落接種到PDA斜面，30℃培養(yǎng)108h左右，得到黑曲霉pc1選育的孢子。同時(shí)以出發(fā)菌株黑曲霉ATCC16404作為對(duì)照。

接種發(fā)酵：選育的孢子接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，孢子最終濃度為1×10⁸孢子/mL發(fā)酵培養(yǎng)液，30℃、130r/m培養(yǎng)96h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成：MM微量元素液3mL，麩皮12g，甘蔗渣（粉碎過(guò)20目篩）15g，玉米芯12g，葡萄糖5g，蛋白胨1g，自來(lái)水定容至1L。

發(fā)酵結(jié)束后，用濾紙過(guò)濾發(fā)酵液，測(cè)定濾液的纖維素酶，葡糖苷酶酶活、外切酶酶活、內(nèi)切酶等測(cè)定方法依據(jù)文獻(xiàn)（馮月，蔣建新，朱莉偉，菅紅磊。纖維素酶活力及混合纖維素酶協(xié)同作用的研究。北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，第31卷，增刊1）。測(cè)定得到，黑曲霉pc1發(fā)酵液的濾紙酶活為3.6U/mL，葡糖苷酶酶活為12.6U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為27.1U/mL，外切酶酶活為0.36U/mL；黑曲霉ATCC16404發(fā)酵液的濾紙酶活為2.2U/mL，葡糖苷酶酶活為13.6U/mL，內(nèi)切酶酶活26.3U/mL，外切酶酶活為0.21U/mL。從結(jié)果可以看出，黑曲霉pc1的纖維素酶酶活顯著增加，外切酶的酶活顯著增加。

對(duì)比試驗(yàn)1

除多拷貝表達(dá)片段1中三個(gè)信號(hào)肽編碼序列全部為信號(hào)肽1編碼序列外，其余操作同實(shí)施例1。

最后篩選得到的黑曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的濾紙酶活2.4U/mL，葡糖苷酶酶活為12.9U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為26.5U/mL，外切酶酶活為0.28U/mL。這說(shuō)明信號(hào)肽序列相同雖然能提高纖維素酶酶活，但是與非同樣序列的信號(hào)肽相比，纖維素酶酶活低很多。

對(duì)比試驗(yàn)2

除多拷貝表達(dá)片段1中的信號(hào)肽2編碼序列替換為信號(hào)肽1編碼序列外，其余操作同實(shí)施例1。

最后篩選得到的黑曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的濾紙酶活為2.72U/mL，葡糖苷酶酶活為12.9U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為26.5U/mL，外切酶酶活為0.32U/mL。從對(duì)比試驗(yàn)看出，非相同序列的信號(hào)肽組合有利于提高纖維素酶的酶活。

對(duì)比試驗(yàn)3

除多拷貝表達(dá)片段1中的信號(hào)肽1編碼序列替換為信號(hào)肽3編碼序列外，其余操作同實(shí)施例1。

最后得到的黑曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的濾紙酶活為2.83U/mL，葡糖苷酶酶活為12.8U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為26.9U/mL，外切酶酶活為0.31U/mL。

上述結(jié)果表明信號(hào)肽序列的組合對(duì)纖維素酶的酶活有很大影響。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學(xué)

<120> 一種纖維素外切酶多拷貝表達(dá)提高黑曲霉纖維素酶酶活的方法

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 781

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 啟動(dòng)子序列

<400> 1

taccacctcg tgctgtgaga gcagatgagg ttcttatagt ttctatgtca gagtcttctg 60

gtttcccgat aactctgaaa agttgtttcc cattatagcc ctttggagga gcctaaggta 120

acgggtcgat agacagtgaa gtagttttcc tgtcatcttt tccttccacc gtggatgttt 180

acggtagtaa cgctatttcc tttccgatag caagttctac ggagacggct gtcaccaggg 240

tttctacctg ggggtgggtg ctcctcgtag cacctttttc ttctgcaagg ttggtgcaga 300

agtttcgttc acctaactac actattgtac cacctcgtgc tgtgagagca gatgaggttc 360

ttatagtttc tatgtcagag tcttctggtt tcccgataac tctgaaaagt tgtttcccat 420

tatagccctt tggaggagcc taaggtaacg ggtcgataga cagtgaagta gttttcctgt 480

catcttttcc ttccaccgtg gatgtttacg gtagtaacgc tatttccttt ccgatagcaa 540

gttctacgga gacggctgtc accagggttt ctacctgggg gtgggtgctc ctcgtagcac 600

ctttttcttc tgcaaggttg gtgcagaagt ttcgttcacc taactacact atagaggtga 660

ctgcattccc tactgcgtgt tagggtgata ggaagcgttc tggaaggaga tatattcctt 720

caagtaaagt aaacctctcc tgtgcgactt tagtggtcag agagagatgt ttagatagag 780

a 781

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 信號(hào)肽1編碼序列

<400> 2

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggca 54

<210> 3

<211> 1188

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素外切酶編碼序列

<400> 3

tgtgagcgct ctgcccactg caagctctac tccgactccc tctactccgg gcccatcgac 60

taccccagca ccaactgcgg cccctggtgg gaaccccttc gagggatacc agcaatatgt 120

caatccttac tacaagtccg aggtcctgtc ccttgctgtt ccttccatga ccggcgacct 180

cgctgcgcag gcgagtgcgg cagctgacgt tccgtcgttc ttctggcttg tcaacagcga 240

cacagccgac aaggtccctc agatgggcac cttcctgaag aacatcaagg aggcaaatga 300

cggcggcgcc aatcccccca atgcgggcat cttcgttgtc tacgacttgc cggaccgcga 360

ctgcgccgcg ctggccagca acggcgagta ttcgattgcg gacggcggtg tcgagaaata 420

caaggcgtac atcgactcga tcaagaagca gctggagacc tactctgatg ttcagaacat 480

cctcatcatc gagccggata gtctggccaa cctggtgacc aacatgaacg tcgagaagtg 540

cgccaacgcc cacgatgcct acctggagtg caccaactat gccatcacgc agctgaacct 600

ccccaatgtg gcgatgtatc tcgacgctgt catgccggat ggctgggctg gcccgccaac 660

atcggccccg cggccgagct gttcgccgga gtctacaaga acgcgtcttc ccctgctgcc 720

ctccgtggac tggcaactaa cgtggccaac tacaacgcct tctccatcga cacctgcccc 780

tcgtacacct cagagaacga ggtctgcgat gagaagagct atatcaacaa ctttgcgccc 840

gaactcaaga gcaacggctt cgatgctcac ttcattgtcg acactgctcc accaggtcgc 900

aacggtaacc agcccactgg acagctggag tggggtgact ggtgcaatgt tgtcgacacc 960

ggcttcggtg ctcgtccctc caccgacacc ggtgatgaac tggttgatgc ctttgtctgg 1020

gtgaagcctg gtggtgagag tgacggtacc tcggacacct ctgctgagcg ctatgatgcc 1080

cactgcggtc tggatgacgc cctgaagccg gctcctgagg ctggtacttg gttccaggcg 1140

tactttgagc agctggtgaa gaacgcgaac ccacctctgt ctagctag 1188

<210> 4

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 終止子序列

<400> 4

tctagaaaga aggattacct ctaaacaagt gtacctgtgc attctgggta aacgactcat 60

aggagagttg taaaaaagtt tcggccggcg tattgggtgt tacggagcat tcactaggca 120

accatggtta ctattgtata cccatcttag taggaatgat tttcgaggtt tatacctacg 180

atgaatgtgt gtcctgtagg cttgagagtt caaggaagaa acagtgcaat tatctttgcg 240

aacccagggg ctggtgacgg aattttcata gtcaagctat cagagtaaag aagaggagca 300

tgtcaaagta caattagaga caaatatata gtcgcgtgga gccaagagcg gattcctcag 360

tctcgtaggt ctcttgacga ccgttgatct gcttgatctc gtctcccgaa aatgaaaata 420

gactctgcta agctattctt ctgcttcgcc ggagcctgaa gggcgtacta gggttgcgag 480

gtccaatgca ttaatgcatt gcagatgagc tgtatctgga agaggtaaac ccgaaacgcg 540

ttttattctt gttgacatgg agctattaaa tcactagaag gcactctttg ctgcttggac 600

aaatgaacgt atcttatcga gatcctgcac accatttgtc tcaactccgg agctgacatc 660

gacaccaacg atcttatatc cagattcgtc aagctgtttg atgatttcag taacgttaag 720

tggatc 726

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 連接序列

<400> 5

gctgtgttgg cgggcccgaa aggcc 25

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 信號(hào)肽2編碼序列

<400> 6

atgccttcct tgactgctct cgcgggcctc ctcgctctgg ttccctcggc actggct 57

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 信號(hào)肽3編碼序列

<400> 7

atgcgggccc tgtgggctct tgcacccgtt ctcttccctg ctgtgagcgc t 51