專利名稱：：纖維素酶的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以經(jīng)濟(jì)的方式在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)纖維素酶的方法。技術(shù)背景微生物的宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)纖維素酶。原料成本最大的部分是葡萄糖(碳源)和純的纖維素(誘導(dǎo)劑和碳源)。加入純化的纖維素作為誘導(dǎo)劑來刺激纖維素酶產(chǎn)生在本領(lǐng)域是熟知的。純化的纖維素可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，但昂貴。所以，有必要提供一種容易獲得并且便宜的誘導(dǎo)劑來代替目前使用的昂貴的純的纖維素。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法使用一種容易獲得并且便宜的誘導(dǎo)劑替代昂貴的純的纖維素或類似的誘導(dǎo)劑。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，包括在有益于纖維素酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)能夠產(chǎn)生纖維素酶的所述宿主細(xì)胞，其中加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生。宿主細(xì)胞可以是重組的或野生型宿主細(xì)胞，將在下面作進(jìn)一步地描述。本發(fā)明還涉及預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料作為在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的誘導(dǎo)劑和/或^f友源的用途。圖1顯示APE-[5759]的SDS-PAGE。圖2顯示PCS水解相對(duì)于酶(相對(duì)的蛋白質(zhì)，以培養(yǎng)液/g纖維素表示)加載量(enzymeloading)。APE-58是批式的纖維素發(fā)酵對(duì)照。圖3顯示PCS水解相對(duì)于酶(相對(duì)體積培養(yǎng)液/g纖維素)加載量。APE-58是批式的纖維素發(fā)酵對(duì)照。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供使用容易獲得并且便宜的誘導(dǎo)劑在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，所述誘導(dǎo)劑材料可替代昂貴的纖維素酶誘導(dǎo)劑，例如，目前使用的純的纖維素。用于纖維素酶生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)原料是葡萄糖原3阡連同懸浮的純纖維素。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)目前用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)纖維素酶的純的纖維素，可以用預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(pre-treatedligno-cellulosicmaterial)代替，例如，尤其是預(yù)處理的玉米秸(PCS)。在使用前，優(yōu)選將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行解毒(detoxify),例如，通過洗滌，例如，通過在水中重復(fù)浸漬、離子交換、反萃取(stripping)等。至少部分地進(jìn)行解毒以去除抑制宿主細(xì)胞性能的化合物。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于因?yàn)槭褂萌菀撰@得且比純的纖維素更廉價(jià)的誘導(dǎo)劑而降低了生產(chǎn)成本。生產(chǎn)酶的方法在真菌來源(例如絲狀真菌(filamentousfbngi))或細(xì)菌來源的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)纖維素酶是本領(lǐng)域熟知的。除了用預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料替代誘導(dǎo)劑(如純的纖維素)之外，本發(fā)明的方法可為熟知的方法。長。當(dāng)把宿主細(xì)胞培養(yǎng)物引入發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，該接種的培養(yǎng)物經(jīng)過多個(gè)階段。最初不生長。這個(gè)階段稱為遲滯期并可認(rèn)為是一個(gè)適應(yīng)期。在下一個(gè)被稱為"指數(shù)期，，的階段，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的生長速率逐漸增加。在最大生長期之后，生長速率停止然后培養(yǎng)物進(jìn)入穩(wěn)定期。在又一段時(shí)間之后，培養(yǎng)物進(jìn)入死亡期并且活細(xì)胞的數(shù)量下降。生長期中纖維素酶的表達(dá)取決于纖維素酶和宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維素酶可以在指數(shù)期進(jìn)行表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在指數(shù)期和穩(wěn)定期之間的過渡期(transientphase)產(chǎn)生纖維素酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維素酶也可以在穩(wěn)定期和/或恰在孢子形成(sporulation)前進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶也可以在一個(gè)和/或多個(gè)上述階段中產(chǎn)生。換句話說，根據(jù)本發(fā)明，在合適的培養(yǎng)基中和允許表達(dá)(優(yōu)選分泌和任意地回收)纖維素酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含至少一種碳源和預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料作為誘導(dǎo)劑。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，誘導(dǎo)劑是洗滌的、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素植物材料。纖維素酶生產(chǎn)步驟是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明的下文中，纖維素酶優(yōu)選是通過宿主細(xì)胞分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中的細(xì)胞外的纖維素酶。可替換地，纖維素酶是細(xì)胞內(nèi)的。發(fā)酵后，可以使用本領(lǐng)域中熟知的方法任選地回收纖維素酶。例如，可以使用常規(guī)方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收細(xì)胞外纖維素酶，所述常規(guī)方法包括，但不限于，離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。細(xì)胞內(nèi)纖維素酶的回收方法也是本領(lǐng)域熟知的。至少在本發(fā)明的上下文中，可互換的術(shù)語"培養(yǎng)(cultivation)"和"發(fā)酵(fermentation)"是指使用包含一種或多種宿主細(xì)胞的大量培養(yǎng)(massculture)產(chǎn)生纖維素酶的任意方法。本發(fā)明尤其適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，例如，具有至少50升，優(yōu)選至少100升，更優(yōu)選至少500升，甚至更優(yōu)選至少1000升，尤其是至少5000升的培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法可作為分批、補(bǔ)料分批、重復(fù)補(bǔ)料分批或連續(xù)方法來進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以在需氧或厭氧的條件下實(shí)施。一些酶通過深層培養(yǎng)(submergedcultivation)產(chǎn)生，一些通過表面i咅養(yǎng)(surfacecultivation)產(chǎn)生。才艮4居本發(fā)明優(yōu)選深層培養(yǎng)。因此，根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，其包括在有益于纖維素酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)所述能夠產(chǎn)生纖維素酶的宿主細(xì)胞，其中加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料來誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生。底物本發(fā)明的方法中使用的底物可以是本領(lǐng)域中任何底物。合適的底物可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得或根據(jù)公布的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)的目錄)制備。通常用于纖維素酶生產(chǎn)的碳源底物包括葡萄糖或類似的糖?？杉尤氲吹孜?、生長刺激劑等來改進(jìn)培養(yǎng)和纖維素酶生產(chǎn)。氮源包括氨(NH4C1)和肽?？梢允褂玫鞍酌?，例如，來消化蛋白質(zhì)以產(chǎn)生游離氨基氮(FAN)。這些游離氨基酸可以作為宿主細(xì)胞的營養(yǎng)物起作用，從而促進(jìn)生長和纖維素酶產(chǎn)生。優(yōu)選用于生長的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的例子包括多種維生素、生物素、泛酸/泛酸鹽(pantothenate)、煙酸、煙酸月幾醇(meso-inositol)、硫胺素、吡P多醇(pyridoxine)、對(duì)-氨基苯曱酸、葉酸、核黃素和維生素A,B，C,D,和E。礦物質(zhì)的例子包括礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，其能夠提供包含P，K,Mg,S,Ca,Fe，Zn，Mn和Cu的營養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明，用預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料，優(yōu)選解毒的(例如水洗的)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料代替在纖維素酶的生產(chǎn)過程中通常用作-秀導(dǎo)劑(和^^源)的純的纖維素。根據(jù)本發(fā)明，可將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料和碳源一起加入到培養(yǎng)基中，但是也可以與碳源分開加入。根據(jù)本發(fā)明，可將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在接種宿主細(xì)胞培養(yǎng)物之前，接種的同時(shí)或接種之后加入到培養(yǎng)基中，加入量對(duì)應(yīng)于通常使用的純的纖維素的量。這意味著預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料優(yōu)選的加入量等于通常使用的純的纖維素的量。在本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生過程中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地確定何時(shí)加入以及加入的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的量。在培養(yǎng)的時(shí)間間隔(timespan)中，預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料優(yōu)選的加入量對(duì)應(yīng)于通常使用的純的纖維素的量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的量(對(duì)應(yīng)于純的纖維素的量)與碳源(例如葡萄糖)量的比例范圍是大約1:10至2:1，優(yōu)選大約1:5至1:1。如上所述，預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的使用方式與通常用于熟知的纖維素酶產(chǎn)生方法的純的纖維素的使用方式相同。舉例說明，當(dāng)使用木霉屬(7Wc/20&rma)的菌抹，例如里氏木霉(7Wc/zo&mw^e化/)作為宿主細(xì)胞產(chǎn)生纖維素酶時(shí)，將碳源底物水平保持在低水平，例如，低于lg碳源底物/L,如低于lg葡萄糖/L。本發(fā)明方法可持續(xù)的時(shí)間與相應(yīng)的傳統(tǒng)方法的相同，例如在3-10天。木霉屬發(fā)酵(包括里氏木霉發(fā)酵)一般持續(xù)5-9天。木質(zhì)纖維素材料根據(jù)本發(fā)明，"木質(zhì)纖維素材料"包括含有木質(zhì)纖維素的任何材料。木質(zhì)纖維素一般存在于下述物質(zhì)中植物的莖、葉、殼、皮、和穗軸，或樹的葉、枝和木材。木質(zhì)纖維素材料也可以是，但不限于，草本(herbaceous)材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙以及紙漿廠和造紙廠殘余物。本文中可以理解的是木質(zhì)纖維素材料可以是植物細(xì)胞壁材料的形式，所述植物細(xì)胞壁材料在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。在一個(gè)實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維素材料是玉米纖維、稻草、松樹木材、木屑(woodchip)、白楊木,麥扦(wheatstraw),柳才支禾菱(switchgrass),甘蔗漆,紙和紙漿處理廢物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維素材料是玉米秸(comstover)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維素材料是木本或草本植物。預(yù)處理根據(jù)本發(fā)明，木質(zhì)纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的。術(shù)語"預(yù)處理"可以用術(shù)語"處理，，代替。但是，其包括的優(yōu)選技術(shù)是已知用于"預(yù)處理"木質(zhì)纖維素材料的那些技術(shù)，如下文進(jìn)一步描述的。如上所述，可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來進(jìn)行處理或預(yù)處理，這可以促進(jìn)纖維素從木質(zhì)纖維素材料中分離和/或釋放。預(yù)處理技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，包括物理的、化學(xué)的、和生物的預(yù)處理，或它們的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理作為分批或連續(xù)過程來進(jìn)行。物理預(yù)處理技術(shù)包括多種類型的研磨/粉碎(粒度的減小)，照射，蒸煮/蒸汽噴發(fā)(steaming/steamexplosion),和水熱解(hydrothermolysis)。粉碎包括干磨、濕磨和振動(dòng)球磨(vibratoryballmilling)。優(yōu)選地，物理預(yù)處理包括-使用高壓和/或高溫(蒸汽噴發(fā))。在本發(fā)明的上下文中，高壓包括300至600psi,優(yōu)選400至500psi，例如大約450psi的壓力范圍。在本發(fā)明的上下文中，高溫包括大約100至300。C,優(yōu)選大約140至235。C的溫度范圍。在具體的實(shí)施方案中，在大約450psi的壓力和大約235。C的溫度條件下進(jìn)行浸漬。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用蒸汽槍水解器系統(tǒng)(steamgunhydrolyzersystem)進(jìn)行物理預(yù)處理，該系統(tǒng)采用高壓和高溫，例如，使用Sunds水解器(SundsHydrolyzer)(可由SundsDefibratorAB(瑞典)獲得)?；瘜W(xué)預(yù)處理技術(shù)包括酸，稀釋酸，堿，有機(jī)溶劑，石灰，氨，二氧化硫，二氧化碳，pH-控制的水熱解，濕氧化，和溶劑處理。優(yōu)選地，化學(xué)處理方法是酸處理方法，更優(yōu)選，連續(xù)稀釋的酸或弱酸(mildacid)處理，例如用硫酸，或另外的有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸，或它們?nèi)我獾幕旌衔飦硖幚?。也可以使用其它酸。至少在本發(fā)明的上下文中，弱酸處理是指處理的pH范圍為1至5,優(yōu)選1至3。在具體的實(shí)施方案中，酸濃度的范圍是O.l至2.0wt。/。的酸，優(yōu)選硫酸。酸與木質(zhì)纖維素材料混合或接觸，該混合物在大約160-220。C的溫度范圍保持?jǐn)?shù)分鐘至數(shù)秒鐘的時(shí)間。具體而言，預(yù)處理?xiàng)l件可以是如下所述165-183°C,3-12分鐘，0.5-1.4%(w/w)酸濃度，15-25,優(yōu)選大約20。/。(w/w)總固體濃度。其它預(yù)期的方法在美國專利4,880,473，5,366,558,5,188,673,5,705,369和6，228，177中描述，所述文件全部并入作為參考。濕氧化技術(shù)涉及氧化劑(如亞硫酸鹽類氧化劑等)的使用。溶劑處理的例子包括用DMSO(二曱基亞砜)等處理?；瘜W(xué)處理方法一般進(jìn)行大約5至IO分鐘，^f旦可以進(jìn)4亍更短或更長的時(shí)間。生物預(yù)處理技術(shù)包括采用木質(zhì)素增溶性(lignin-solubilizing)微生物(參見，侈'H口，Hsu,T.-A.，1996,Pre—treatmentofbiomass,inHandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman，C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC179-212;Ghosh,P.,andSingh,A.，1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,inEnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.，Baker,J.O.,andOverend,R.P.,eds.，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,chapter15;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,andTsao,G.T.,1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,inAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.，ed.,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson，L.,andHahn-Hagerdal,B,,1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;andVallander,L.,andEriksson,K.-E.L.,1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行化學(xué)和物理預(yù)處理，包括例如，弱酸處理和高溫及高壓處理?；瘜W(xué)和物理處理可以相繼或同時(shí)進(jìn)4亍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過稀酸蒸汽噴發(fā)步驟來進(jìn)行預(yù)處理。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過氨纖維噴發(fā)步驟(ammoniafiberexplosionstep)(或AFEX預(yù)處理步驟)來進(jìn)行預(yù)處理。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如，將稀酸水解的木質(zhì)纖維素材料(如玉米秸)蒸汽蒸餾(steamstripped)以將該材料解毒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料基本上由纖維素組成。根據(jù)本發(fā)明，纖維素酶是指能夠降解生物質(zhì)的纖維素分解酶。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的纖維素酶可以是任意來源的，包括細(xì)菌或真菌來源。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬(ge"eraSa"7/w"，有支單月包菌屬(p"m(io附o"as)，腐質(zhì)霉屬(i/wm'co/a),鐮孑包屬(/ks(3n'w附),才炎孑包殼屬(772z'6/av7'a)，斗支丁負(fù)《包審屬(y4crg附o"/w附),金孑包子菌屬(C7w3Asaypor/w附)禾口木審屬(7Hc/zo&rwfl)的纖維素酶，例如由特異腐質(zhì)霉(/7ww/co/a/"so/e"力、嗜熱毀絲霉(Afycg/z.o//^/zoraAerwo//z//a)、土生沖炎孑包霉(772/e/av/aferres/r/力、尖鐮孑包(Fz^san'wmca^sporwm)、C7z^vc^por/wm/wcAt7。m^"化和里氏木霧產(chǎn)生的真菌纖維素酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是與宿主細(xì)胞同源的纖維素酶復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是與木霉屬(優(yōu)選里氏木霉的菌抹)的宿主細(xì)胞同源的纖維素酶復(fù)合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是含有里氏木霉纖維素酶復(fù)合物和此外的一種或多種異源共產(chǎn)生的外源酶的纖維素酶制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是與腐質(zhì)霉屬的菌抹，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉的菌林，尤其是特異腐質(zhì)霉，DSM1800同源的纖維素酶復(fù)合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是含有特異腐質(zhì)霉纖維素酶復(fù)合物和此外的一種或多種異源共產(chǎn)生的外源酶的纖維素酶制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是與一種金孢子菌屬的菌抹，優(yōu)選C770^os;w7'wm/wc^wwerae的菌才朱同源的纖維素酶復(fù)合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生的纖維素酶是含有C7zo^wpon'wm/wdbwwerae纖維素酶復(fù)合物和此外的一種或多種異源共產(chǎn)生的外源酶的纖維素酶制劑?？梢岳斫獾氖牵a(chǎn)生的纖維素酶可以是單一成分纖維素酶，例如，在合適的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶、外-纖維二糖水解酶、葡糖水解酶或(3-糖芬酶。合適的宿主細(xì)胞在下文中進(jìn)一步描述。產(chǎn)生的纖維素酶可以是纖維素酶制劑，其中一種或多種同源的纖維素酶成分從天然產(chǎn)生纖維素酶的宿主細(xì)胞中缺失或失活。能夠產(chǎn)生纖維素酶的宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞可以是任何來源。如上所述，纖維素酶與能產(chǎn)生纖維素酶的宿主細(xì)胞可以是同源或異源的。本文使用的術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"，是指攜帶編碼纖維素酶的基因并能表達(dá)所述基因以產(chǎn)生纖維素酶的宿主細(xì)胞，其中已將纖維素酶編碼基因轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等入宿主細(xì)胞。使用的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將基因以一個(gè)或多個(gè)拷貝整合入重組宿主細(xì)胞的基因組。當(dāng)纖維素酶是異源的，能產(chǎn)生纖維素酶的重組宿主細(xì)胞優(yōu)選真菌或細(xì)菌來源。重組宿主細(xì)胞的選擇很大程度上依賴于編碼纖維素酶的基因和纖維素酶的來源。本文使用的術(shù)語"野生型宿主細(xì)胞"，指天然地?cái)y帶編碼纖維素酶的基因并且能表達(dá)所述的基因的宿主細(xì)胞。當(dāng)纖維素酶是同源制劑或纖維素酶復(fù)合物時(shí)，能產(chǎn)生纖維素酶的野生型宿主細(xì)胞或它們的突變體優(yōu)選為真菌或細(xì)菌來源。"它們的突變體"可為野生型宿主細(xì)胞，其中已將一個(gè)或多個(gè)基因缺失或失活，例如，以富集纖維素酶制劑的某種成分。突變體宿主細(xì)胞也可以是用一個(gè)或多個(gè)附加基因轉(zhuǎn)化的野生型宿主細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)附加基因編碼附加酶或蛋白質(zhì)，從而將一種或多種附加酶活性或其他活性引入由野生型宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的制劑或纖維素酶復(fù)合物。附加酶可以具有相同的活性(如纖維素酶活性)，但僅僅是另一種酶分子，例如具有不同的性質(zhì)。為了增加基因表達(dá)以產(chǎn)生更多的酶，突變體野生型宿主細(xì)胞也可以具有經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等，優(yōu)選整合入基因組的附加的同源酶編碼基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組或野生型宿主細(xì)胞是絲狀真菌來源。宿主細(xì)胞的例子包括選自下組的任意一種，包括枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗酶屬、煙管菌屬、白腐菌屬(C^^w/o戸z》、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、擔(dān)子菌屬(尸z'/o6oy、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬(Mag"apo/^e)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬(A^ocaWma幼';c)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬CP/za"erac/zaefe)、射脈菌屬(尸/7M^)、瘤胃壺菌屬(尸/ram;;cM)、側(cè)耳屬(尸/ewra/w"、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬(77e環(huán)oocw力、梭孑包殼屬、彎頸霉屬(r。/j^oc/a血7")、檢菌屬(rrameto)或木霉細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞選自下組，包括泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉的菌抹。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢菌抹的細(xì)胞。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主纟田月包選自下組黑刺煙管菌、Cen>cWo/w&、或Cer—/-/o/w/ssw6vm^pora、C7z，oyj:7oW訓(xùn)/wcA770werae、灰蓋鬼傘(Copn'm^sc/"wew力、毛革蓋菌(Con'o/wi1/z/rawfws)、特異腐質(zhì)霉、i5i棉y犬腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌CP/z朋erac/wetec/z^)Aso^spoWwm)、輻射射月永菌(尸/2/eZ)/flra(i/ato)、尸/ewo^se^ywg〃、土生才炎孑包霉、!Traw故sW〃osa、Tra,tov^s/co/o廠、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉的菌抹。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組或野生型宿主細(xì)胞是細(xì)菌來源的。宿主細(xì)胞的例子包括選自下組的宿主細(xì)胞，其包括革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬的菌抹，例如嗜堿芽孢桿菌(j5acz7/wa汰a/o;Mw)、解淀粉芽孢桿菌(Bacz'〃wsamyfo^々we/ac〖e"s)、#豆芽孑包桿菌(Bacz7/w<s6revz、)、環(huán)4犬芽孑包才干菌(5ac/〃w".rcw/(ms)、凝結(jié)芽孑包桿菌CSac/〃wscoagM/<ms)、火山爛芽孑包桿菌(Bacz'〃ws/(3wfw力、遲纟爰芽孑包4干菌(Bac〃/ws/eWw力、i也衣芽孑包才干菌CSac/〃w/z'c/zemybrw/s)、巨大芽孢桿菌(Bacz'〃wswegafen'wm)、嗜熱脂肪芽孑包桿菌(Bacz'〃wsstoa^o/Zzerwo/p/n'/itf)、#古草4干菌(Sac/〃wsw&z7或蘇云金芽孑包才干菌(5ac/〃w/z鵬."g7.ms&);或鏈霉菌屬菌抹,如淺青紫鏈霉菌(6^epto附y(tǒng)cay//v油ra)或鼠灰鏈霉菌(&^ptowyceswwn7ms);或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌(Eco//)或々i單孑包菌屬的菌種(jPww(iomo"ass;.)。產(chǎn)生纖維素酶的誘導(dǎo)劑的用途。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在纖維素酶產(chǎn)生過程中作為碳源的用途。本文所描述及所要求保護(hù)的本發(fā)明不受本文所公開的具體實(shí)施方案的范圍所限制，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的舉例說明。任何等同的實(shí)施方案都將被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，按照前面的描述，除本文所示和所述的內(nèi)容之外對(duì)本發(fā)明作出各種修改，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。本文引用了各種文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容全部并入本文作為參考。材料和方法材料里氏木霉SMA135-04公開于美國專利/>開號(hào)2005/0233423的實(shí)施例8中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(intuitive)操作來進(jìn)行模式切換，使得用戶方便。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，移動(dòng)終端提供功能設(shè)置模式，其使得能夠執(zhí)行與第一和第二殼體100和200之間的旋轉(zhuǎn)角度相關(guān)聯(lián)的特定模式的注冊。如果檢測到了旋轉(zhuǎn)，則控制單元300執(zhí)行映射到旋轉(zhuǎn)角度的功能。例如，如果檢測到了旋轉(zhuǎn)并且旋轉(zhuǎn)角度被映射到了廣播模式，則控制單元300就控制廣播接收機(jī)330接收廣播數(shù)據(jù)并控制第一顯示110顯示廣播數(shù)據(jù)。用于移動(dòng)終端的操作模式驅(qū)動(dòng)方法，該移動(dòng)終端包括具有第一顯示和第二顯示的第一殼體和具有第一鍵盤和第二鍵盤的第二殼體，第二殼體沿該移動(dòng)終端的縱軸與第一殼體繞軸旋轉(zhuǎn)地耦接，該操作模式驅(qū)動(dòng)方法確定是否激活基于旋轉(zhuǎn)的驅(qū)動(dòng)功能，并且如果基于旋轉(zhuǎn)的驅(qū)動(dòng)功能被激活，則基于第一和第二殼體是否相互旋轉(zhuǎn)來驅(qū)動(dòng)操作模式。該操作模式驅(qū)動(dòng)方法使得能夠設(shè)置執(zhí)行碼，用于執(zhí)行與每個(gè)操作模式相關(guān)聯(lián)的功能。搡作模式包括廣播回放模式。第二殼體相對(duì)于第一殼體旋轉(zhuǎn)，并支持第一殼體處于直立或旋轉(zhuǎn)狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，移動(dòng)終端的操作模式驅(qū)動(dòng)方法注冊與目標(biāo)操作模式(例如多媒體模式或通信模式)的特定功能相關(guān)聯(lián)的快捷號(hào)碼，并且如果檢測到了第一和第二殼體之間的旋轉(zhuǎn)以及快捷號(hào)碼之一，則執(zhí)行映射到該快捷號(hào)碼的功能。向移動(dòng)終端提供該操作模式驅(qū)動(dòng)方法，該終端包括具有第一顯示和第二顯示的第一殼體和具有第一鍵盤和第二鍵盤的第二殼體。第二殼體沿該移動(dòng)終端的縱軸與第一殼體繞軸旋轉(zhuǎn)地耦接。該旋轉(zhuǎn)模式驅(qū)動(dòng)方法確定是否檢測到了第一和第二殼體之間的旋轉(zhuǎn)和執(zhí)行碼，并且如果檢測到了旋轉(zhuǎn)和執(zhí)行碼，則驅(qū)動(dòng)與旋轉(zhuǎn)相關(guān)聯(lián)的目標(biāo)操作模式，并執(zhí)行由執(zhí)行碼指示的目標(biāo)功能。操作模式驅(qū)動(dòng)方法使得能夠設(shè)置執(zhí)行碼，用于執(zhí)行與每個(gè)操作模式相關(guān)聯(lián)的功能，每個(gè)執(zhí)行碼包括快捷號(hào)碼。目標(biāo)操作模式是廣播回放模式，并且快捷號(hào)碼被映射到業(yè)務(wù)頻道。第二殼體相對(duì)于第一殼體旋轉(zhuǎn)并支持第一殼體處于直立和旋轉(zhuǎn)狀態(tài)。另外，操作模式驅(qū)動(dòng)方法提供配置屏幕，用于配置目標(biāo)操作模式和執(zhí)行碼，并且該操作模式驅(qū)動(dòng)方法注冊目標(biāo)操作模式和執(zhí)行碼，用于基于用戶反饋執(zhí)行目標(biāo)操作模式的功能，每個(gè)執(zhí)行碼具有用于識(shí)別目標(biāo)操作模式的識(shí)別碼和用于指示目標(biāo)功能的快捷號(hào)碼。酸和堿進(jìn)料泵調(diào)整pH。ADI1012攪拌控制器用于驅(qū)動(dòng)ApplikonP310電動(dòng)機(jī)，從而以1100至1300rpm的速度攪拌培養(yǎng)液。使用無擋板的Rushton輻流式葉輪(radialflowimpeller)。用無菌空氣流以大約1vvm的速度向培養(yǎng)液通氣；空氣通過安裝在罐底部葉輪之下的噴頭(sparger)進(jìn)入。使用里氏木霉菌抹SMA135-04進(jìn)行發(fā)酵。制備甘油冷凍原液，并將其用作種瓶的接種物。種瓶按下表所示的進(jìn)行培養(yǎng)。如所示的，一些接種物的體積減少。木霉屬發(fā)酵持續(xù)大約165小時(shí)，此時(shí)對(duì)罐進(jìn)行收集。木霉屬發(fā)酵法使用葡萄糖原料。根據(jù)需要，使用PluronicL61表面活性劑(BASF)減少起泡。將PCS分批實(shí)例(APE-57，APE-59)和纖維素分批發(fā)酵(APE-58)進(jìn)行比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>進(jìn)料組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>操作糾<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>將最終發(fā)酵液的等分試樣在蒸餾去離子(DDI)水中稀釋5倍。然后l體積稀釋樣品與2體積混有5%(3-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液(BioRad)混合，煮沸5分鐘。每個(gè)樣品取15微升上樣于8-16。/。Tris-HCI凝膠(BioRad)上，進(jìn)行電泳并用BiosafeCoomassieBlue染色(圖1)。蛋白質(zhì)主條帶在-70kDa。所有培養(yǎng)液在10kDa都顯示清晰的條帶；纖維素分批也顯示在〈8kDa的條帶。通過酶培養(yǎng)液水解稀酸預(yù)處理的玉米秸(PCS)和產(chǎn)生糖的能力來測定酶培養(yǎng)液的活性，產(chǎn)生的糖可通過化學(xué)分析還原性末端來檢測。PCS由國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL,GoldenCO)提供，其葡聚糖含量是53.2%(NREL數(shù)據(jù))。在桶中將1kgPCS懸浮于20升雙重去離子水中，PCS沉積后，將水傾析。重復(fù)才喿作，直到洗滌水在pH4.0以上，此時(shí)還原糖在0.06g/L以下。該沉積的漿通過100目(Mesh)篩以確保吸取的能力。洗滌的PCS的百分比干重含量通過下述方法測定將樣品在105。C的烘箱中干燥24小時(shí)以上(直到恒重)然后與濕重進(jìn)行比較。在用平板密封物(platesealer)(ALPS-300,ABgene)密封的96-深-孔板(AxygenScientific)中進(jìn)行PCS水解。PCS濃度是10g/L,含有50mM醋酸鹽，pH5.0。PCS水解在5(TC進(jìn)行，總反應(yīng)體積為1.0ml,不用額外攪拌。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行三次重復(fù)。如下所述用p-羥基苯曱酸酰肼(PHBAH)試劑分析釋放的還原糖。具體地，吸取0.8mlPCS(12.5g/L)移入96-深-孔板的每個(gè)孔中，其中加入0.10ml醋酸鈉緩沖液(0.5M,pH5.0)，然后加入0.10ml稀釋的酶溶液以開始反應(yīng)，并給出1.0ml的終反應(yīng)體積和10g/L的PCS濃度。在水解開始時(shí)和采集每個(gè)樣品的時(shí)間點(diǎn)之前，通過倒轉(zhuǎn)深-孔板使反應(yīng)混合物混合。混合后，將深-孔板在3000rpm離心2分鐘(帶RTH-250轉(zhuǎn)子的SorvallRT7)，然后去除20樣t升水解物(上清液)，將180微升0.4%NaOH加入96-孔微量反應(yīng)板中。如果需要，可將終止的溶液進(jìn)一步稀釋至還原糖的合適范圍。用下述的對(duì)-羥基苯曱酸酰肼試齊ij(para-hydroxybenzoicacidhydrazidereagent)(PHBAH,Sigma,4-羥基千基酰肼(4-hydroxybenzyhydrazide)分析釋放的還原糖在V-底96-孔熱電偶套管平板(Costar651l)中，將50微升PHBAH試劑(1.5%)與100微升樣品混合，在平板加熱塊上95。C保溫IO分鐘，然后在每個(gè)孔中加入50微升DDI水，混合，并將100微升轉(zhuǎn)移到另一個(gè)平底96-孔板(Costar9017)中，在410nm讀取吸光度。在相同的條件下使用葡萄糖校準(zhǔn)曲線來計(jì)算還原糖。將纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的百分比轉(zhuǎn)化率計(jì)算為%轉(zhuǎn)化率=還原糖(mg/ml)/(加入的纖維素(mg/ml)x1,11)因子1.11用于修正纖維素水解為葡萄糖過程中的重量增加。使用PCS,APE-57和APE-59產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平與采用纖維素的對(duì)照發(fā)酵相似(圖3),而且，培養(yǎng)液與采用纖維素的對(duì)照發(fā)酵(圖2)的纖維素酶活性相似。權(quán)利要求1.一種在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，包括在有益于纖維素酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)能夠產(chǎn)生纖維素酶的所述宿主細(xì)胞，其中加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中木質(zhì)纖維素材料是植物材料，優(yōu)選選自下組玉米秸，玉米纖維，稻草，松木，木屑，白楊木，麥稈，柳枝稷，紙和紙漿處理廢料。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理通過將木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行物理處理，化學(xué)處理，生物處理，或它們的任意組合來進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行粉碎，稀酸蒸汽噴發(fā)，蒸汽噴發(fā)，濕氧化，或氨水纖維噴發(fā)(或AFEX預(yù)處理)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞是重組宿主細(xì)胞或野生型宿主細(xì)胞或它們的突變體。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞是細(xì)菌或真菌來源。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的纖維素酶是纖維素酶復(fù)合物或由野生型宿主細(xì)胞或其突變體產(chǎn)生的制備物，優(yōu)選如下的野生型宿主細(xì)胞或其突變體木霉屬，優(yōu)選里氏木霉的菌抹，或腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉的菌株或金孢子菌屬，優(yōu)選C7w>^tw;cn'M"i/McAowe"化的菌斗朱。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的纖維素酶是單一成分纖維素酶或由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的纖維素酶制備物，優(yōu)選如下的重組宿主細(xì)胞木霉屬，尤其是里氏木霉的菌抹，或腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉的菌抹或金孑包子菌屬，4尤選C/^j^c^/Jon'wm/wcA:wowerae的菌枒、或曲霉屬，4尤選黑曲霉或米曲霉的菌抹。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中纖維素酶生產(chǎn)在至少50升的發(fā)酵罐中進(jìn)行。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中該方法作為補(bǔ)料分批方法進(jìn)行。11.根據(jù)權(quán)利要求1至IO任一項(xiàng)的方法，其中加入碳源，優(yōu)選葡萄糖。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的方法，其中在加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料之前，同時(shí)，或之后加入碳源。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法，其中加入氮源。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其中使用的預(yù)處理的材料基本由纖維素組成。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的方法，其中在培養(yǎng)后回收纖維素酶。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在用于纖維素酶生產(chǎn)前進(jìn)行解毒。17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的方法，其中預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在用于纖維素酶生產(chǎn)前進(jìn)行洗滌。18.預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料作為纖維素酶生產(chǎn)過程中的誘導(dǎo)劑的用途。19.預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料作為纖維素酶生產(chǎn)過程中的碳源的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生纖維素酶的方法，該方法包括在有益于纖維素酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)能夠產(chǎn)生纖維素酶的所述宿主細(xì)胞，其中加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生。本發(fā)明也涉及預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在纖維素酶產(chǎn)生過程中作為誘導(dǎo)劑或碳源的用途。文檔編號(hào)C12N9/30GK101223273SQ200680023897公開日2008年7月16日申請日期2006年6月30日優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日發(fā)明者吉列爾莫·科沃德-凱利,馬茲·P·T·史密斯申請人:諾維信北美公司