專利名稱：一種獲得紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到基因誘變和基因重組領(lǐng)域，具體表現(xiàn)為紫外誘變和快中子誘變技術(shù)，以及原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得高產(chǎn)菌株，不僅提高了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，也拓寬了微生物的遺傳種質(zhì)資源，豐富了基因庫的內(nèi)容。
背景技術(shù)：
目前紅霉素生產(chǎn)菌發(fā)酵水平較低，生產(chǎn)成本相對較高，滿足不了當(dāng)今市場的需求。因此選育紅霉素高產(chǎn)菌株是紅霉素生產(chǎn)發(fā)展中有待解決的關(guān)鍵問題。目前常規(guī)的理化因子誘變育種在紅霉素生產(chǎn)菌的選育中應(yīng)用較多，誘變育種在一定程度上可以提高菌種生產(chǎn)能力，改善生產(chǎn)菌的性狀和抗生素的品質(zhì)。由于目前環(huán)境因素的改變使得紅霉素生產(chǎn)菌抗性能力提高，利用單一誘變方法已很難較大程度的提高紅霉素生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力。原生質(zhì)體融合技術(shù)可以實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的充分重組，能夠提高融合子成為高產(chǎn)、并具有優(yōu)良性狀的重組子的可能性。而且原生質(zhì)體融合往往能夠引起細(xì)胞質(zhì)粒的消除，這可以導(dǎo)致細(xì)胞染色體的改變，或是次級代謝途徑的變化，從而增加高產(chǎn)菌株出現(xiàn)的幾率。本發(fā)明將兩種誘變方法得到的高產(chǎn)菌株經(jīng)原生質(zhì)體融合，大大提高了獲得高產(chǎn)重組子的幾率，能夠為生產(chǎn)提供高產(chǎn)菌種，獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益；同時也拓寬了微生物的遺傳種質(zhì)資源，豐富了基因庫的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容與要點分述如下:
一.紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株I的獲得，其步驟是:
(O篩選出發(fā)菌株:選取效價較高且穩(wěn)定的紅霉素鏈霉菌作為出發(fā)菌株。(2)紫外線照射誘變:將出發(fā)菌株制備成孢子懸液進(jìn)行紫外線照射誘變，稀釋后涂布于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。(3)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價。(4)遺傳穩(wěn)定性考察:對篩選得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選得到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株。之上所述的紫外照射條件為15W、30cm照射90s，利用搖瓶考察來篩選高產(chǎn)菌株，所用斜面培養(yǎng)基為:可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調(diào)pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。種子瓶培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g，氯化鈉3g，玉米漿7.lg，分析純碳酸鈣6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵瓶培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g,中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質(zhì)碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0。 二.紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株II的獲得，其步驟是:(I)篩選出發(fā)菌株:選取效價較高且穩(wěn)定的紅霉素鏈霉菌作為出發(fā)菌株。(2)快中子照射誘變:將出發(fā)菌株制備成孢子懸液進(jìn)行快中子輻射誘變，稀釋后涂布于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。(3)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價。 (4)遺傳穩(wěn)定性考察:對篩選得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選得到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株。之上所述的快中子輻射劑量為6X 10nN/cm2。之上所述的篩選培養(yǎng)基成分同一。三.高產(chǎn)菌株I和II的原生質(zhì)體融合，其步驟是:
(I)孢子懸液的制備:將權(quán)利要求書I和2中所得到的高產(chǎn)菌株I和II分別制備成孢子懸液。(2)菌體的培養(yǎng):取適量孢子懸液接入種子瓶內(nèi)，在適宜條件下將菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(3)原生質(zhì)體的融合:將權(quán)利要求1和2中得到的高產(chǎn)菌株I和II進(jìn)行原生質(zhì)體融合，包括原生質(zhì)體的分離、融合及再生。(4)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價。(5)遺傳穩(wěn)定性考察:對初篩的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選得到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株。(6)發(fā)酵罐試驗:將所篩選的高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵罐試驗，測定其效價。之上所述的原生質(zhì)體融合過程中溶菌酶濃度為2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;熱滅活溫度為60°C，時間為IOmin ;紫外滅活照射條件為15W、30cm照射150s。本發(fā)明的優(yōu)點及效果
1.本發(fā)明中首先對出發(fā)菌株進(jìn)行兩種方法的誘變以獲得誘變后高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株，菌株代謝能力起點較高，為后續(xù)獲得高產(chǎn)的重組子奠定了良好的基礎(chǔ)。2.本發(fā)明中采用原生質(zhì)體融合技術(shù)對兩株紅霉素高產(chǎn)菌株進(jìn)行融合，通過遺傳物質(zhì)的充分重組，獲得了高產(chǎn)且具有優(yōu)良性狀的重組子。有效提高了菌株的代謝能力，獲得了良好的經(jīng)濟(jì)效益，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。同時也拓寬了微生物的遺傳種質(zhì)資源，豐富了基因庫的內(nèi)容。
具體實施例方式下面通過實施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一.紫外和快中子誘變獲得高產(chǎn)菌株I和II 1.出發(fā)菌株的篩選
用接種鏟從沙土管中取適量含有紅霉素鏈霉菌的沙土，放入盛有玻璃珠的三角瓶中，用力震蕩以打散孢子，梯度稀釋后按梯度分別涂布于平皿上，34土 TC，濕度50%培養(yǎng)9-lld。從平皿上挑取10個單菌落轉(zhuǎn)接入斜面中，成熟后接入到搖瓶中測定其效價(表1)，選擇效價高且較穩(wěn)定的菌株SE7作為出發(fā)菌株(表2)。
2.誘變
A.紫外誘變
孢子成熟后，制備孢子懸液，用無菌玻璃珠打散均勻，血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為IO8個/ml，作為待處理菌液，分別取4-5ml加到6個平皿中，打開平皿蓋，用15w的紫外燈30 11處分別照射08、308、608、908、1208、1508后黑暗中放置201^11，在紅燈下將誘變后的菌液分別稀釋IO3-1O4,取0.1ml涂布于篩選培養(yǎng)皿上，用黑布包好后避光，340C，濕度50%培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9-lld，記錄菌落數(shù)，計算致死率。通過大量實驗證明，紫外照射時間為90s時，正突變率較高，因此將紫外線照射時間確定為90s (表3)。B.快中子誘變
孢子成熟后，制備孢子懸液，用無菌玻璃珠打散均勻，血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為IO8個/ml，作為待處理菌液，分別取4-5ml加到6個小瓶中，分別用劑量為OXlOllN'cm'3 X IO11N.Cnr2AxiollNcnr2Axio11Ncm'12 X IO11Ncm'15 X IO11N.CnT2 的快中子輻射，將誘變后的菌液分別稀釋IO3-1O4,取0.1ml涂布于篩選培養(yǎng)皿上，34°C，濕度50%培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9-lld，記錄菌落數(shù)，計算致死率。通過大量實驗證明，快中子劑量為6 X IO11N cnr2時正突變率最高，因此將快中子劑量確定為6X 10nN.CnT2 (表4)。3.篩選高產(chǎn)菌株
隨機(jī)挑選若干株誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，7天后，測定其效價。

其中紫外線誘變突變株UV17效價較高，為5931u/ml，較原始菌株SE7提高了6.1%。其中快中子輻射誘變突變株FN23效價較高。為6143u/ml，較原始菌株SE7提高了
9.3%。4.遺傳穩(wěn)定性考察
為確定初篩高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性，將突變株UV17和FN23分別進(jìn)行五次傳代傳代后轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，7d后測定各代菌株紅霉素效價，效價測定方法為有機(jī)溶劑萃取與反萃取法。突變株UV17和FN23性狀穩(wěn)定，因此將兩株菌株確定為誘變后高產(chǎn)菌株。二.高產(chǎn)菌株I和II的原生質(zhì)體融合
1.孢子懸液的制備
取高產(chǎn)菌株I (UV17)和II (FN23)新鮮成熟孢子斜面各一支，將孢子刮下，放入裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，打散均勻后，血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為IO8個/ml，作為待處理菌液。2.菌體培養(yǎng)
在250ml的三角瓶內(nèi)裝25ml種子培養(yǎng)基，接種孢子懸液0.5-1.0ml, 34°C，250rpm振蕩培養(yǎng)46h左右。為使生長的菌絲體容易被溶菌酶酶解成原生質(zhì)體，需加入等體積0.5%的甘氨酸高滲預(yù)處理Ih。3.原生質(zhì)體的融合 A.原生質(zhì)體的分離3000r/min離心IOmin收集生長較好的菌絲體,用高滲穩(wěn)定液反復(fù)離心洗漆兩次,棄上清，加入IOml 2.5mg/ml溶菌酶溶液用吸管輕輕吸打，使菌絲體均勻地懸浮于酶溶液中，34°C水浴中酶解lh，酶解后3000r/min離心lOmin，棄上清，用高滲穩(wěn)定液反復(fù)離心洗滌兩次以除去殘余溶菌酶，再將原生質(zhì)體懸浮于定量的高滲溶液中，使得孢子濃度達(dá)到IO7-1O8個/ml。B.原生質(zhì)體的融合
取兩種制備好的原生質(zhì)體各Iml混合，離心去上清，用0.5M CaCl2洗滌，加入PEG4000溶液室溫下震蕩融合30min。C.原生質(zhì)體的再生
為了簡化融合子的篩選采用親本滅活的方法處理融合前的原生質(zhì)體，親本I (UV17)選擇熱滅活方法，親本2 (FN23)采用紫外滅活的方法。親本I的原生質(zhì)體懸液在60°C下滅活lOmin，用高滲溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀釋后，涂布于高滲完全培養(yǎng)基上。親本2的原生質(zhì)體懸液在15W、30cm照射150s，用高滲溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀釋后，涂布于高滲完全培養(yǎng)基上。平板分別在34°C培養(yǎng)7d。4.篩選高產(chǎn)菌株
隨機(jī)挑選若干株融合后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，7天后，測定其效價(表5)。其中以融合子PF26效價最高，為6513，較出發(fā)菌株SE7提高了 14.5%，較紫外誘變菌株UV17提高了 8.9%，較快中子誘變菌株FN23提高了 5.7%。5.遺傳穩(wěn)定性考察 為確定初篩高產(chǎn)菌株P(guān)F26的穩(wěn)定性，對其進(jìn)行五次傳代，每代菌轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，7d后測定其紅霉素效價，效價測定方法為有機(jī)溶劑萃取與反萃取法。PF26性狀穩(wěn)定(表6)，可以確定其為高產(chǎn)且性狀穩(wěn)定的菌株。6.發(fā)酵罐試驗:將高產(chǎn)菌株P(guān)F26進(jìn)行發(fā)酵罐試驗，接種量為10%，培養(yǎng)170h后，放罐測定其效價，小試發(fā)酵罐效價達(dá)到11000u/ml以上。附表:
表I原始菌株效價
權(quán)利要求
1.采用紫外線照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株I，其步驟是: (1)篩選出發(fā)菌株:選取效價較高且穩(wěn)定的紅霉素鏈霉菌作為出發(fā)菌株； (2)紫外線照射誘變:將出發(fā)菌株制備成孢子懸液進(jìn)行紫外線照射誘變，稀釋后涂布于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)； (3)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價； (4)遺傳穩(wěn)定性考察:對篩選得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選得到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株。
2.采用快中子照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株II，其步驟是: (O篩選出發(fā)菌株:選取效價較高且穩(wěn)定的紅霉素鏈霉菌作為出發(fā)菌株； (2)快中子照射誘變:將出發(fā)菌株制備成孢子懸液進(jìn)行快中子輻射誘變，稀釋后涂布于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)； (3)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價； (4)遺傳穩(wěn)定性考察:對篩選得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選得到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株。
3.采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將權(quán)利要求1和權(quán)利要求2中獲得的高產(chǎn)菌株I和II進(jìn)行融合，獲得新的高產(chǎn)重組子，其步驟是: (1)孢子懸液的制備:將權(quán)利要求書I和2中所得到的高產(chǎn)菌株I和II分別制備成孢子懸液； (2)菌體的培養(yǎng):取適量孢子懸液接入種子瓶內(nèi)，在適宜條件下將菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長期； (3)原生質(zhì)體的融合:將權(quán)利要求1和2中得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，包括原生質(zhì)體的分離、融合及再生； (4)篩選高產(chǎn)菌株:隨機(jī)挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價； (5)遺傳穩(wěn)定性考察:對初篩的高產(chǎn)菌株進(jìn)行多次傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，最終篩選到高產(chǎn)且穩(wěn)定的菌株； (6)發(fā)酵罐試驗:將所篩選的高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵罐試驗，測定其效價。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用紫外線照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:所述的紫外照射條件為15W、30cm照射90s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用快中子照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:所述的快中子輻射劑量為6X10nN/cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用原生質(zhì)體融合的方式將兩株高產(chǎn)菌株融合獲得新的高產(chǎn)重組子的方法，其特征在于:溶菌酶濃度為2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;熱滅活溫度為60°C，時間為IOmin ;紫外滅活照射條件為15W、30cm照射150s。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、 要求2和要求3中所述的紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株的初篩和復(fù)篩方法，其特征在于:利用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測定紅霉素效價的方式來篩選高產(chǎn)菌株，所用斜面培養(yǎng)基為:可溶性淀粉6g,玉米楽；7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g ;種子瓶培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g,硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米楽；7.1g,分析純碳酸韓6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，調(diào)pH值至7.0 ;發(fā)酵瓶培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質(zhì)碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵罐試驗的方法，其特征在于:所用種子罐培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉15g,糊精30g,黃豆餅粉15g,氯化鈉2g,硫酸銨1.2g,玉米楽；3g,輕質(zhì)碳酸 丐8g,豆油5ml，消沫劑0.3ml ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:玉米淀粉30g，糊精10g，黃豆餅粉30g，氯化鈉2g,硫 酸銨1.8g,玉米楽:13g，輕質(zhì)碳酸隹丐8g，豆油5ml,消沫劑0.3ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獲得紅霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株的方法，其特征是先利用紫外線和快中子分別誘變紅霉素鏈霉菌，獲得高產(chǎn)菌株Ⅰ和Ⅱ，再利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將兩株高產(chǎn)菌株融合獲得新的高產(chǎn)重組子。該重組子搖瓶效價為6513u/ml，較原始菌株提高了14.5%，較誘變菌株Ⅰ和Ⅱ分別提高了8.9%和5.7%，經(jīng)多次傳代后效價穩(wěn)定，小試發(fā)酵效價達(dá)到11000u/ml以上。該方法有效地提高了菌株的代謝能力，獲得了良好的經(jīng)濟(jì)效益，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。
文檔編號C12N15/03GK103160445SQ20111041102
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者李瑾, 程傳東, 何海燕, 張麗麗, 于新令, 王鳳灘 申請人:山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司