本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。

背景技術(shù)：

玉米(Zea mays L.)是世界三大糧食作物之一，也是重要的工業(yè)原料和生物能源物質(zhì)，在我國乃至全世界的糧食生產(chǎn)中都占有舉足輕重的地位。在提高玉米單產(chǎn)的諸多因素中，新品種選育的作用占40％。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始在玉米新品種選育中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)成為僅次于轉(zhuǎn)基因大豆的全球種植面積第二大的轉(zhuǎn)基因作物。

良好的受體系統(tǒng)是玉米遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要環(huán)節(jié)，關(guān)系到提供適宜轉(zhuǎn)化的受體材料以及轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能否再生為正常植株等問題。迄今為止，玉米最有效的受體材料包括幼胚、幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)得到的愈傷組織，另外還有成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織、胚性愈傷組織或懸浮細(xì)胞系分離出的原生質(zhì)體和莖尖分生組織等。與此同時，玉米的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、電擊法、PEG法和花粉管通道法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法為目前常用的轉(zhuǎn)基因方法。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)幼胚的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法被廣泛采用，但其具有成本高、取材受季節(jié)限制、以及狀態(tài)不穩(wěn)定等缺點。雖然已有成熟胚誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞系分離出的原生質(zhì)體和莖尖分生組織的成功案例，但是現(xiàn)有技術(shù)一般采用基因槍轟擊懸浮細(xì)胞系的方法，懸浮細(xì)胞系的制備方法需要經(jīng)過漫長的繼代過程才能獲得TypeII型愈傷組織，再由TypeII型愈傷組織制備懸浮細(xì)胞系，不僅操作繁瑣，而且周期長；由基因槍轟擊法獲得的轉(zhuǎn)化子不僅轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)高，加大了后續(xù)性狀篩選工作的難度，而且轉(zhuǎn)化效率較低、不穩(wěn)定；而經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的懸浮細(xì)胞系，會產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，釋放活性氧，易導(dǎo)致愈傷組織褐化死亡，難以獲得抗性愈傷組織進(jìn)而再生成穩(wěn)定表達(dá)的植株。因此，需要開發(fā)一個成本低，取材方便，周期短、轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化玉米的方法，有效克服現(xiàn)有技術(shù)成本高、取材受季節(jié)限制、周期長、狀態(tài)不穩(wěn)定等技術(shù)缺陷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法，包括將玉米幼胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷組織，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含麥草畏、毒莠定和激動素。

優(yōu)選地，所述麥草畏的濃度為0.2-10mg/L，所述毒莠定的濃度為0.2-10mg/L，所述激動素的濃度為0.01-5mg/L。

更優(yōu)選地，所述麥草畏的濃度為2mg/L，所述毒莠定的濃度為2.2mg/L，所述激動素的濃度為0.3mg/L。

進(jìn)一步地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含芐氨基嘌呤。

優(yōu)選地，所述芐氨基嘌呤的濃度為0.01-5mg/L。

更優(yōu)選地，所述芐氨基嘌呤的濃度為0.02mg/L。

更進(jìn)一步地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含大量鹽、微量鹽、有機質(zhì)、脯氨酸、水解酪蛋白、天冬氨酸、蔗糖和2,4-D。

優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含MS鹽、N6維生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、天冬氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、2,4-D 0.1-5mg/L、麥草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、激動素0.01-5mg/L和芐氨基嘌呤0-5mg/L。

可選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含MS鹽、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麥草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L和激動素0.3mg/L。

可選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含MS鹽、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麥草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L、激動素0.3mg/L和芐氨基嘌呤0.02mg/L。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法，包括將所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以獲得玉米懸浮細(xì)胞系。

具體地，所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法包括：

所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織通過第一懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)和繼代以獲得懸浮細(xì)胞團(tuán)；

所述懸浮細(xì)胞團(tuán)通過第二懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以獲得懸浮細(xì)胞系。

更具體地，所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法包括：

所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織通過第一懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)10-25天，然后繼代2-3次以獲得懸浮細(xì)胞團(tuán)；

所述懸浮細(xì)胞團(tuán)通過第二懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)5-7天以獲得懸浮細(xì)胞系。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述第一懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽或N6鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麥草畏0.2-10mg/L和2,4-D 0.1-5mg/L。

優(yōu)選地，所述第一懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、麥草畏1.5mg/L和2,4-D 1mg/L。

進(jìn)一步地，所述第二懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽或N6鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麥草畏0.2-10mg/L。

優(yōu)選地，所述第二懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麥草畏1.5mg/L。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種大量擴增玉米懸浮細(xì)胞系的方法，包括采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法獲得的所述玉米懸浮細(xì)胞系通過懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行繼代以擴增玉米懸浮細(xì)胞系。

具體地，所述大量擴增玉米懸浮細(xì)胞系的方法包括采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法獲得的所述玉米懸浮細(xì)胞系通過第二懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行繼代以擴增玉米懸浮細(xì)胞系。

優(yōu)選地，所述第二懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽或N6鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麥草畏0.2-10mg/L。

具體地，所述第二懸浮培養(yǎng)液包含MS鹽、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麥草畏1.5mg/L。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種節(jié)省玉米外植體的方法，包括所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織，采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法以獲得玉米懸浮細(xì)胞系，將所述玉米懸浮細(xì)胞系通過懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行繼代以擴增玉米懸浮細(xì)胞系。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種提高農(nóng)桿菌侵染效率的方法，包括農(nóng)桿菌侵染預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)，所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)來自采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法獲得的所述玉米懸浮細(xì)胞系，所述預(yù)處理包括熱激處理。

進(jìn)一步地，所述熱激處理的時間為不超過8分鐘。

更進(jìn)一步地，所述熱激處理的溫度為30-60℃。

優(yōu)選地，所述熱激處理的溫度為42℃或60℃。

更優(yōu)選地，所述熱激處理為溫度60℃烘箱熱激處理5分鐘。

可選地，所述預(yù)處理還包括超聲波處理。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述提高農(nóng)桿菌侵染效率的方法包括：

玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)以獲得預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

所述預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)處理以獲得預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

侵染后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)以獲得共培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種有效篩選玉米抗性愈傷組織的方法，包括將所述提高農(nóng)桿菌侵染效率的方法獲得的所述共培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)在含有選擇劑的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇抗性愈傷組織。

進(jìn)一步地，所述選擇劑為抗生素、除草劑或糖類。

具體地，所述有效篩選玉米抗性愈傷組織的方法包括：將所述提高農(nóng)桿菌侵染效率的方法獲得的所述共培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)在含有雙丙氨膦的第一篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，再在含有雙丙氨膦的第二篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，選擇抗性愈傷組織。

優(yōu)選地，所述第二篩選培養(yǎng)基中雙丙氨膦的濃度為50-100mg/L。

進(jìn)一步地，所述第二篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麥草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激動素0.01-5mg/L和雙丙氨膦50-100mg/L。

優(yōu)選地，所述第二篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦100mg/L。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述第一篩選培養(yǎng)基中雙丙氨膦的濃度為3-5mg/L。

優(yōu)選地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麥草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激動素0.01-5mg/L和雙丙氨膦3-5mg/L。

可選擇地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦3mg/L。

可選擇地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦5mg/L。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化玉米的方法，包括：

所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織，采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法以獲得玉米懸浮細(xì)胞系；

農(nóng)桿菌侵染所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)。

所述農(nóng)桿菌侵染所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)具體為農(nóng)桿菌侵染預(yù)處理后的所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)，所述預(yù)處理包括熱激處理。

進(jìn)一步地，所述熱激處理的時間為不超過8分鐘。

更進(jìn)一步地，所述熱激處理的溫度為30-60℃。

優(yōu)選地，所述熱激處理的溫度為42℃或60℃。

更優(yōu)選地，所述熱激處理為溫度60℃烘箱熱激處理5分鐘。

可選地，所述預(yù)處理還包括超聲波處理。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述轉(zhuǎn)化玉米的方法包括：

所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)以獲得預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

所述預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)處理以獲得預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

侵染后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)以獲得共培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植物的方法，包括：

所述誘導(dǎo)玉米愈傷組織的方法獲得的所述初生愈傷組織，采用所述獲得玉米懸浮細(xì)胞系的方法以獲得玉米懸浮細(xì)胞系；

農(nóng)桿菌侵染所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

侵染后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；

在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇抗性愈傷組織；

所述抗性愈傷組織再生為玉米植物。

所述農(nóng)桿菌侵染所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)具體為農(nóng)桿菌侵染預(yù)處理后的所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)，所述預(yù)處理包括熱激處理。

進(jìn)一步地，所述熱激處理的時間為不超過8分鐘。

更進(jìn)一步地，所述熱激處理的溫度為30-60℃。

優(yōu)選地，所述熱激處理的溫度為42℃或60℃。

更優(yōu)選地，所述熱激處理為溫度60℃烘箱熱激處理5分鐘。

可選地，所述預(yù)處理還包括超聲波處理。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植物的方法包括：

所述玉米懸浮細(xì)胞系中的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)以獲得預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

所述預(yù)培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過預(yù)處理以獲得預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)；

農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述選擇劑為抗生素、除草劑或糖類。

所述在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇抗性愈傷組織具體為將共培養(yǎng)后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)在含有雙丙氨膦的第一篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，再在含有雙丙氨膦的第二篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，選擇抗性愈傷組織。

優(yōu)選地，所述第二篩選培養(yǎng)基中雙丙氨膦的濃度為50-100mg/L。

進(jìn)一步地，所述第二篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麥草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激動素0.01-5mg/L和雙丙氨膦50-100mg/L。

優(yōu)選地，所述第二篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦100mg/L。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述第一篩選培養(yǎng)基中雙丙氨膦的濃度為3-5mg/L。

優(yōu)選地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麥草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激動素0.01-5mg/L和雙丙氨膦3-5mg/L。

可選擇地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦3mg/L。

可選擇地，所述第一篩選培養(yǎng)基包括MS鹽、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麥草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激動素0.2mg/L和雙丙氨膦5mg/L。

本發(fā)明中的克隆基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞核植物均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。

本發(fā)明可用于在玉米植物中表達(dá)任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲基因，或者是選擇或評價標(biāo)記，并含有植物可操作的啟動子、編碼區(qū)和終止子區(qū)。耐除草劑基因包括對咪唑啉酮或磺酰脲除草劑耐受的AHAS基因、對草丁膦除草劑耐受的PAT或bar基因、對草甘膦除草劑耐受的EPSPS基因等?？共』虬股睾铣擅富颍缦踹量┚睾铣擅富?，植物來源的抗性基因等?？瓜x基因包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因。目的基因也可以編碼與生物化學(xué)途徑有關(guān)的酶，該酶的表達(dá)可改變食物、飼料、營養(yǎng)藥和/或藥物生產(chǎn)中重要的性狀。目的基因可以位于質(zhì)粒上。適合本發(fā)明使用的質(zhì)?？梢院幸粋€以上目的基因和/或農(nóng)桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。

本發(fā)明中所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，所述方法是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因傳輸?shù)接衩讘腋〖?xì)胞團(tuán)，之后再生為轉(zhuǎn)化的玉米植物為基礎(chǔ)的。

在選擇劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞。優(yōu)選地，用草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的基因在雙丙氨磷存在的情況下培養(yǎng)。在含有雙丙氨磷為選擇劑的培養(yǎng)基中，PAT基因轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞選擇性生長。

含有異源核酸(即含有按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)的轉(zhuǎn)基因植物以及通過該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代是本發(fā)明所涉及的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成有用栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。植物組織體外培養(yǎng)技術(shù)和整個植株再生技術(shù)也是公知的。相應(yīng)的，所述“種子”包括這些轉(zhuǎn)化植物的種子以及轉(zhuǎn)化植物后代產(chǎn)生的種子。所述“植物”不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，還包括通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生植物的后代。

可以從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中篩選成功的轉(zhuǎn)化植物。為了開發(fā)改良的植物和種子品系，可以持續(xù)地篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物以使轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列持續(xù)存在。因此，可以將所需要的轉(zhuǎn)基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業(yè)上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進(jìn)入遺傳植物品系的方法可通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來實現(xiàn)，包括通過傳統(tǒng)的育種、原生質(zhì)體融合、細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以及染色體轉(zhuǎn)移。育種方法和技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和自交系可用于生產(chǎn)商業(yè)上有價值的雜交植物和農(nóng)作物。

本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化玉米的方法，具有以下優(yōu)點：

1、穩(wěn)定。本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法在實驗室條件下即可大量繁殖懸浮細(xì)胞系，克服了大田材料受天氣條件限制，無法準(zhǔn)確的預(yù)計外植體收獲情況的缺陷，從而使得玉米遺傳轉(zhuǎn)化不受季節(jié)性的影響，滿足周年穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的需求。

2、周期短。本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法中可由玉米幼胚誘導(dǎo)的初生愈傷組織快速獲得懸浮細(xì)胞系，而無需在固體培養(yǎng)基上長時間繼代獲得TypeII型愈傷組織，再由TypeII型愈傷組織獲得懸浮細(xì)胞系，故實驗周期由6個月縮短至40-50天，且操作簡單方便，重復(fù)性好。

3、本發(fā)明首次由玉米幼胚獲得懸浮細(xì)胞系，優(yōu)選地選擇愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-D獲得的愈傷組織表面突起明顯、顏色鮮嫩，并且生長速度明顯提高，有利于直接制備玉米懸浮細(xì)胞系；再利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系，優(yōu)選地，經(jīng)預(yù)處理(即60℃熱處理5分鐘)的玉米懸浮細(xì)胞系可以顯著提高農(nóng)桿菌侵染效率；經(jīng)過篩選的玉米懸浮細(xì)胞系再生成苗，優(yōu)選地，當(dāng)篩選培養(yǎng)基S2中雙丙氨磷濃度達(dá)到100mg/L時，陽性率和轉(zhuǎn)化效率最高。

4、轉(zhuǎn)化效率高。本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到30％左右，轉(zhuǎn)基因陽性率可達(dá)90％左右，其中單拷貝率約40％。

5、轉(zhuǎn)化成本低。由于本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法可以提供大量優(yōu)良的玉米懸浮細(xì)胞系，所以顯著降低了對玉米外植體(幼胚)供應(yīng)的壓力，進(jìn)而大大減小了培養(yǎng)外植體所需的人力和物力消耗，可進(jìn)行規(guī)?；z傳轉(zhuǎn)化。

下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的重組克隆載體DBN01-T構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的重組表達(dá)載體DBN100001構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)圖；

圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的多個玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)效果圖；

圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的玉米懸浮細(xì)胞系效果圖；

圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)中紅色熒光蛋白DsRed的瞬時表達(dá)效果圖；

圖7為本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的轉(zhuǎn)基因陽性玉米植株效果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法的技術(shù)方案。

第一實施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、構(gòu)建含有目的基因的重組克隆載體

將PAT核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；PAT為草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；MCS為多克隆位點)。

然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μL大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μL質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(200r/min轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μL冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入200μL新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μL冰冷的溶液III(3M醋酸鉀，5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000r/min條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000r/min條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的PAT核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將DsRed核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中插入的DsRed核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2、構(gòu)建含有目的基因的重組表達(dá)載體

用限制性內(nèi)切酶KpnI和PvuI分別酶切重組克隆載體DBN02-T和DBNBC-01(載體骨架：基于pCAMBIA3300改造(CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的DsRed核苷酸序列插入到表達(dá)載體DBNBC-01中，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBNBC-01-DsRed；進(jìn)而用限制性內(nèi)切酶SacI和SnaBI分別酶切DBN01-T和前面所述重組表達(dá)載體DBNBC-01-DsRed，將切下的PAT核苷酸序列插入到表達(dá)載體DBNBC-01-DsRed中，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100001，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan：卡那霉素基因序列；RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子序列(SEQ ID NO:3)；DsRed：紅色熒光蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子序列(SEQ ID NO:4)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子序列(SEQ ID NO:5)；PAT：草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子序列(SEQ ID NO:6)；LB：左邊界)。

將重組表達(dá)載體DBN100001用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為：50μL大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μL質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體DBN100001)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切后鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明PAT核苷酸序列和DsRed核苷酸序列均正確插入到重組表達(dá)載體DBN100001中。

3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100001用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μL農(nóng)桿菌LBA4404、3μL質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37℃溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB固體平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，酶切驗證結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100001結(jié)構(gòu)完全正確。

第二實施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得

1、玉米幼胚的剝?nèi)?/p>

將玉米品種齊319(Q319)的種子播種于溫室或大田中，待玉米植株長成授粉后7-12天，收獲玉米雌穗，用濃度為75％(v/v)的酒精浸泡5min后剝?nèi)∮着撸暨x長度為0.6-1.2mm的透明幼胚備用。

2、篩選愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基

將上述剝?nèi)〉挠衩子着呓臃N到下述5種不同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，于溫度28℃的條件下暗培養(yǎng)10-14天，優(yōu)選為14天，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率并觀察愈傷組織形態(tài)，結(jié)果如表2所示。每種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)三次重復(fù)，每個重復(fù)接種100個幼胚。所述5種不同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在愈傷基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.5mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)的基礎(chǔ)上，設(shè)計了不同種類和不同濃度激素的組合處理，具體信息如表1所示。

表1、5種不同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的具體信息表

表2、5種不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織形態(tài)的實驗結(jié)果

上述表1和表2的結(jié)果表明，常規(guī)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM中含有濃度為1.5mg/L的2,4-D，但培養(yǎng)基CIM誘導(dǎo)效率低，長勢慢，胚性差，無法滿足實驗需求；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-A為在所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM基礎(chǔ)上添加了濃度為2mg/L的麥草畏(Dicamba)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-A可以顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但愈傷長勢仍比較慢，并且表面光滑突起較少，無法制備懸浮細(xì)胞系；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-B為在所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-A基礎(chǔ)上添加了濃度為2.2mg/L的毒莠定(Picloram)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-B雖然不能顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但是可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)質(zhì)量，誘導(dǎo)培養(yǎng)后逐漸形成表面突起的胚性愈傷組織；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-C為在所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-B基礎(chǔ)上添加了濃度為0.3mg/L激動素(KT)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-C可以顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到較多可用于制備懸浮細(xì)胞系的胚性愈傷組織；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-D為在所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-C基礎(chǔ)上添加了0.02mg/L芐氨基嘌呤(BAP)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-D的愈傷組織誘導(dǎo)率可高達(dá)97.66％，顯著高于其他4個處理，且如圖3所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷表面突起明顯，顏色鮮嫩，生長速度明顯提高，可用于制備玉米懸浮細(xì)胞系。

根據(jù)篩選結(jié)果，選擇所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-D(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、Dicamba2mg/L、2,4-D 1.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、KT 0.3mg/L、BAP 0.02mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)對玉米幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)已獲得初生愈傷組織。

在本實施例的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，水解酪蛋白的濃度可以為0.1-5g/L，天冬氨酸的濃度可以為0.1-5g/L、蔗糖的濃度可以為5-100g/L，Dicamba的濃度可以為0.2-10mg/L，2,4-D的濃度可以為0.1-5mg/L，Picloram的濃度可以為0.2-10mg/L，KT的濃度可以為0.01-5mg/L，BAP的濃度可以為0-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM-D(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2mg/L、2,4-D 1.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、KT 0.3mg/L、BAP 0.02mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)為優(yōu)選。

3、制備玉米懸浮細(xì)胞系

玉米懸浮細(xì)胞系的起始：將獲得的表面突起明顯且色澤鮮黃的所述初生愈傷組織轉(zhuǎn)移至裝有75mL懸浮培養(yǎng)液SUS-1(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、Dicamba 1.5mg/L、2,4-D 1mg/L，pH5.8)的無菌三角瓶(150mL)中，每個三角瓶中接種5-8粒所述初生愈傷組織，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)。

在本實施例上述懸浮培養(yǎng)液SUS-1中，MS鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，水解酪蛋白的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，Dicamba的濃度可以為0.2-10mg/L，2,4-D的濃度可以為0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述懸浮培養(yǎng)液SUS-1(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、Dicamba 1.5mg/L、2,4-D 1mg/L，pH5.8)為優(yōu)選。

玉米懸浮細(xì)胞系的獲得：所述初生愈傷組織懸浮培養(yǎng)10-25天后進(jìn)行第一次繼代，優(yōu)選為20天，繼代時剔除褐化死亡的細(xì)胞組織，在原三角瓶中保留生長旺盛、質(zhì)地堅硬、色澤鮮黃的新生細(xì)胞組織，且在保留一半原有懸浮培養(yǎng)液SUS-1的基礎(chǔ)上，加入新的玉米懸浮培養(yǎng)液SUS-1至三角瓶75mL刻度處，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)，以便獲得大量的細(xì)胞組織；之后每周繼代一次，每次繼代均需剔除褐化死亡的細(xì)胞組織，保留新生細(xì)胞組織，且每次繼代均保留一半原有懸浮培養(yǎng)液SUS-1，并加入新的懸浮培養(yǎng)液SUS-1至三角瓶75mL刻度處，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將所述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)。所述初生愈傷組織懸浮培養(yǎng)35-45天后，優(yōu)選為40天，逐漸產(chǎn)生結(jié)構(gòu)松散的多個懸浮細(xì)胞團(tuán)(如圖4所示)，將所述懸浮細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至裝有75mL懸浮培養(yǎng)液SUS-2(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 1.5mg/L，pH5.8)新的無菌三角瓶(150mL)中，每個三角瓶中接種20-30粒所述懸浮細(xì)胞團(tuán)，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)5-7天后，多個所述懸浮細(xì)胞團(tuán)即可形成分散良好、增值迅速的玉米懸浮細(xì)胞系(如圖5所示)，即整個玉米懸浮細(xì)胞系的制備周期為40-50天。

玉米懸浮細(xì)胞系的繼代：將制備的所述玉米懸浮細(xì)胞系每周繼代一次，每次繼代時將每個三角瓶中的所述懸浮細(xì)胞系平均轉(zhuǎn)移至三個分別裝有75mL懸浮培養(yǎng)液SUS-2新的無菌三角瓶中，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的所述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)，以便獲得幾何式擴增的玉米懸浮細(xì)胞系留存?zhèn)溆谩?/p>

在本實施例的懸浮培養(yǎng)液SUS-2中，MS鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，水解酪蛋白的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，Dicamba的濃度可以為0.2-10mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述懸浮培養(yǎng)液SUS-2(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 1.5mg/L，pH5.8)為優(yōu)選。

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米懸浮細(xì)胞系遺傳轉(zhuǎn)化

預(yù)培養(yǎng)：將所述玉米懸浮細(xì)胞系中制備的所述懸浮細(xì)胞團(tuán)接種到PRE培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.79g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下預(yù)培養(yǎng)4-7天備用，優(yōu)選為5天。預(yù)培養(yǎng)后的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)活力增強，有助于克服褐化死亡的趨勢。

在本實施例上述PRE培養(yǎng)基中，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，水解酪蛋白的濃度可以為0.1-5g/L，天冬氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，2,4-D的濃度可以為0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述PRE培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.79g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)為優(yōu)選。

預(yù)處理：將預(yù)培養(yǎng)后的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)分別進(jìn)行6種不同的農(nóng)桿菌侵染前預(yù)處理，分別為：預(yù)處理1(無預(yù)處理)、預(yù)處理2(42℃水浴鍋熱處理5分鐘)、預(yù)處理3(60℃烘箱熱處理5分鐘)，每個預(yù)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)進(jìn)行預(yù)處理的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量如表3所示，3種預(yù)處理后的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)用于后續(xù)農(nóng)桿菌侵染。用于后續(xù)農(nóng)桿菌侵染的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)具有較強的活性，即使在農(nóng)桿菌侵染過程中產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)且有釋放活性氧，仍然能恢復(fù)生長。

農(nóng)桿菌菌液的制備：挑取含有DBN100001的農(nóng)桿菌單菌落，用槍頭在含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的固體YP培養(yǎng)板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、卡那霉素50mg/L、瓊脂粉15g/L)上劃線，在溫度28℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。刮取所述固體YP培養(yǎng)板上的菌斑，在新的固體YP培養(yǎng)板上再培養(yǎng)1天，刮取共計培養(yǎng)3-4天的菌落，懸浮在5mL液體INF侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、Dicamba 1.5mg/L、脯氨酸0.5mg/L、蔗糖30g/L、肌醇0.1g/L、乙酰丁香酮(AS)50mg/L，pH5.4)中，將農(nóng)桿菌菌液混勻，將其濃度調(diào)整為OD₆₆₀＝0.5-0.6。

農(nóng)桿菌侵染玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)：將上述3種預(yù)處理后的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)分別浸泡于所述農(nóng)桿菌菌液(20-30mL)中5-25min，優(yōu)選25min；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，然后將3種所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)分別轉(zhuǎn)移至濾紙上，并在超凈工作臺中風(fēng)干5-20min。

農(nóng)桿菌與玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)共培養(yǎng)：將侵染風(fēng)干后的3種所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)分別轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、乙酰丁香酮50mg/L、山梨醇36g/L、植物凝膠3g/L，pH5.4)上，在溫度20-28℃條件下暗培養(yǎng)至少2天，優(yōu)選為5天。共培養(yǎng)5天后，用熒光顯微鏡分別觀察共培養(yǎng)后的3種所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)中紅色熒光蛋白DsRed的瞬時表達(dá)情況，實驗結(jié)果如表3和圖6所示。

表3、共培養(yǎng)后3種不同預(yù)處理的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)中DsRed蛋白瞬時表達(dá)的實驗結(jié)果

表3的實驗結(jié)果表明：預(yù)處理3(即60℃烘箱熱處理5分鐘)的紅色熒光蛋白DsRed的瞬時表達(dá)率顯著高于其它2種預(yù)處理，瞬時表達(dá)率可高達(dá)75％左右，即農(nóng)桿菌侵染效率最高。因此根據(jù)篩選結(jié)果，選擇共培養(yǎng)后預(yù)處理3獲得的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行下述實驗。

在本實施例上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，2,4-D的濃度可以為0.1-5mg/L，乙酰丁香酮的濃度可以為10-100g/L，山梨醇的濃度可以為5-60g/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、乙酰丁香酮50mg/L、山梨醇36g/L、植物凝膠3g/L，pH5.4)為優(yōu)選。

玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)的篩選：將共培養(yǎng)后預(yù)處理3獲得的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)依次轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基S1和篩選培養(yǎng)基S2上進(jìn)行兩次雙丙氨磷耐受性篩選，其中篩選培養(yǎng)基S1(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝膠3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)中分別含有濃度為3mg/L和5mg/L的雙丙氨磷，篩選培養(yǎng)基S2(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram2.2mg/L、植物凝膠3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)中分別含有濃度為5mg/L、10mg/L、50mg/L和100mg/L的雙丙氨磷，8種處理的具體組合信息如表4所示，每個處理進(jìn)行篩選的所述玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量如表5所示。

表4、對玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行8種不同篩選處理的具體組合信息

篩選分兩個階段：將共培養(yǎng)后預(yù)處理3獲得的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)先轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基S1上，在溫度28-30℃條件下暗培養(yǎng)7-10天，優(yōu)選為10天；將經(jīng)過篩選培養(yǎng)基S1篩選后的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)再轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基S2上，在溫度28-30℃條件下暗培養(yǎng)25-35天，優(yōu)選為30天，兩個階段的篩選導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。按照表4的篩選處理組合，篩選后獲得8種玉米抗性愈傷組織。

玉米抗性愈傷組織再生成植物：將8種所述玉米抗性愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、N6有機成分、水解酪蛋白0.5g/L、蔗糖30g/L、KT 2.5mg/L、肌醇0.1g/L、植物凝膠3g/L、萘乙酸(NAA)0.25mg/L、BAP 0.5mg/L、特美汀200mg/L，pH5.8)上，在溫度25-30℃光照培養(yǎng)(光/暗＝16:8)分化1個月；分化出來的8種小苗分別轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維生素、蔗糖15g/L、吲哚-3-乙酸(IAA)0.5mg/L、NAA 1mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，溫度25-30℃光照培養(yǎng)(光/暗＝16:8)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)16小時，再于20℃下培養(yǎng)8小時，可以獲得8種轉(zhuǎn)基因植株。

在上述再生培養(yǎng)基中N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽和N6有機成分的濃度均為1倍量。N6大量元素包括2.83g/L KNO₃、0.463g/L(NH₄)₂SO₄、0.166g/L CaCl₂·2H₂O、0.185g/L MgSO₄·7H₂O和0.4g/L KH₂PO₄；B5微量元素包括0.75mg/L KI、3.0mg/L H₃BO₃、10mg/L MnSO₄·4H₂O、2.0mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoSO₄·2H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O和0.025mg/L CuSO₄·5H₂O；MS鐵鹽包括37.3mg/L Na₂-EDTA和27.8mg/L FeSO₄·7H₂O；N6有機成分包括2mg/L甘氨酸、0.5mg/L煙酸、1mg/L維生素B1和0.5mg/L維生素B6。

在本實施例上述再生培養(yǎng)基中，水解酪蛋白的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，KT的濃度可以為0.01-5mg/L，特美汀的濃度可以為20-500mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以所述再生培養(yǎng)基(N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、N6有機成分、水解酪蛋白0.5g/L、蔗糖30g/L、KT 2.5mg/L、肌醇0.1g/L、植物凝膠3g/L、萘乙酸(NAA)0.25mg/L、BAP 0.5mg/L、特美汀200mg/L，pH5.8)為優(yōu)選。

第三實施例、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)基因的玉米植株

分別取8種轉(zhuǎn)基因玉米植株的葉片各約100mg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測PAT基因的拷貝數(shù)。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

檢測PAT基因拷貝數(shù)的具體方法如下：

步驟11、分別取8種轉(zhuǎn)基因玉米植株和野生型玉米植株的葉片各100mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；

步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；

步驟13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；

步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80-100ng/μL；

步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是：

以下引物和探針用來檢測PAT基因：

引物1：CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQ ID NO:7所示；

引物2：TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQ ID NO:8所示；

探針1：CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQ ID NO:9所示；

PCR反應(yīng)體系為：

所述50×引物/探針混合物包含1mM濃度的每種引物各45μL，100μM濃度的探針50μL和1×TE緩沖液860μL，并且在4℃，貯藏在琥珀試管中。

PCR反應(yīng)條件為：

利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果表明：如圖7所示，PAT基因能夠整合到所檢測的玉米植株的染色體組中，即獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽性植株；如表5所示，篩選處理1和5、篩選處理2和6、篩選處理3和7與篩選處理4和8均呈現(xiàn)相同的規(guī)律，即在篩選培養(yǎng)基S2中雙丙氨磷濃度不變的情況下，篩選培養(yǎng)基S1中雙丙氨磷濃度(3mg/L和5mg/L)對陽性率和轉(zhuǎn)化效率沒有顯著影響，其中篩選處理1和篩選處理5的陽性率和轉(zhuǎn)化效率分別僅為5％和0.3％左右，說明濃度為5mg/L雙丙氨磷的篩選培養(yǎng)基S2無法有效篩選出抗性愈傷組織進(jìn)而獲得陽性植株；篩選處理1至4和篩選處理5至8的陽性率和轉(zhuǎn)化效率均呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，說明在篩選培養(yǎng)基S1中雙丙氨磷濃度不變的情況下，陽性率和轉(zhuǎn)化效率隨著篩選培養(yǎng)基S2中雙丙氨磷濃度的提高(5mg/L、10mg/L、50mg/L和100mg/L)而提高；當(dāng)篩選培養(yǎng)基S2中雙丙氨磷濃度達(dá)到100mg/L時，陽性率可達(dá)90％左右，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)30％左右。因此，整體上篩選培養(yǎng)基S1中雙丙氨磷濃度對陽性率和轉(zhuǎn)化效率沒有顯著影響，而篩選培養(yǎng)基S2中雙丙氨磷的濃度對陽性率和轉(zhuǎn)化效率具有顯著影響。

表5、8種不同篩選處理的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)獲得的轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)實驗結(jié)果

在表5中，篩選處理細(xì)胞團(tuán)數(shù)為共培養(yǎng)后預(yù)處理3獲得的用于篩選處理的玉米懸浮細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量，抗性愈傷總數(shù)為經(jīng)兩個階段的篩選處理后獲得的紅色熒光體積比不少于50％的抗性愈傷數(shù)量，出苗數(shù)為抗性愈傷組織再生獲得的植株的數(shù)量，陽性植株數(shù)為經(jīng)Taqman檢測后獲得的基因組中整合有T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量，Taqman單拷貝數(shù)為經(jīng)Taqman檢測后獲得的基因組中整合有1個拷貝數(shù)目T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量；成苗率、陽性率、單拷貝率和轉(zhuǎn)化效率的計算公式如下所示：

成苗率＝出苗數(shù)/抗性愈傷總數(shù)×100％

陽性率＝陽性植株數(shù)/出苗數(shù)×100％

單拷貝率＝Taqman單拷貝數(shù)/陽性植株數(shù)×100％

轉(zhuǎn)化效率＝陽性植株數(shù)/篩選處理細(xì)胞團(tuán)數(shù)×100％

在第二實施例和第三實施例的篩選培養(yǎng)基S1中，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，Dicamba的濃度可以為0.2-10mg/L，Picloram的濃度可以為0.2-10mg/L，特美汀的濃度可以為20-500mg/L，KT的濃度可以為0.01-5mg/L，雙丙氨膦的濃度可以為3-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以含有濃度為3mg/L或5mg/L的雙丙氨磷的所述篩選培養(yǎng)基S1(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝膠3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)為優(yōu)選。

在第二實施例和第三實施例的篩選培養(yǎng)基S2中，脯氨酸的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，Dicamba的濃度可以為0.2-10mg/L，Picloram的濃度可以為0.2-10mg/L，特美汀的濃度可以為20-500mg/L，KT的濃度可以為0.01-5mg/L，雙丙氨膦的濃度可以為50-100mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進(jìn)行任意組合，但以含有濃度為100mg/L的雙丙氨磷的所述篩選培養(yǎng)基S2(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝膠3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)為優(yōu)選。

綜上所述，本發(fā)明轉(zhuǎn)化玉米的方法在實驗室條件下即可大量繁殖懸浮細(xì)胞系，從而使得玉米遺傳轉(zhuǎn)化不受季節(jié)性的影響，滿足周年穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的需求；且可由玉米幼胚快速獲得懸浮細(xì)胞系，實驗周期由6個月縮短至40-50天，操作簡單方便，重復(fù)性好；同時本發(fā)明首次由玉米幼胚快速獲得懸浮細(xì)胞系，再利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系，再生成苗；轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到30％左右，轉(zhuǎn)基因陽性率可達(dá)90％左右，其中單拷貝率約50％；由于顯著降低了對玉米外植體(幼胚)供應(yīng)的壓力，進(jìn)而大大減小了培養(yǎng)外植體所需的人力和物力消耗。

最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。