本發(fā)明涉及裸藻培養(yǎng)技術領域，特別涉及一種提高裸藻生物量及脂肪酸含量培養(yǎng)基。
背景技術：
裸藻是一種非常有潛力的食品和營養(yǎng)添加劑，因為沒有細胞壁，它所含的營養(yǎng)有著很高的可利用性。它不僅含有人體需要的豐富必需多不飽和脂肪酸PUFAs(預防心血管疾病)、蛋白質(提供多種必需氨基酸)和抗氧化成分，如β-胡蘿卜素、維生素C、維生素E，還能積累大量的裸藻特有的副淀粉產物(Pm)(增強免疫力)。Pm是一種β-1,3-葡聚糖，可以增強生物免疫力，硫酸化的Pm還對艾滋病HIV病毒有抵抗效果，Pm納入飲食后，可降低人體膽固醇。裸藻具有與人體被接近的脂肪酸組成以及相當高的生物活性物質如副淀粉，具有很好的市場前景。2013年10月30日，國家衛(wèi)生計生委發(fā)布公告，批準包括裸藻在內的8種物質為新食品原料。微藻中有許多天然藻種具有在脅迫下積累相對較多的油脂能力，是當前生物能源的最佳來源之一。
脅迫誘導最常用的是各種必需大量營養(yǎng)元素比如氮，磷，硫等，大多數(shù)條件下油脂的產量能有20-50％的增加。但是此類脅迫的缺點在于需要更換培養(yǎng)基，增加了生產成本和勞動力成本。除此之外，氧脅迫與微生物油脂積累之間的正相關關系在產油酵母和一部分綠藻里有所少量發(fā)現(xiàn)和報道，比如添加氧化鈦能夠誘導小球藻一定量的脂肪酸積累(Kang NK,et al.,Korean J Chem Eng,2014,31:861-867)，添加納米鐵顆?？梢蕴岣弋a油酵母的生物量及脂肪酸含量(Karolina et al.,Folia Microbiol.,2015,doi:10.1007/s12223-015-0442-7)。這種添加氧脅迫因子簡單易行、成本較低，因此具有很好的應用前景。
裸藻規(guī)?；a中有培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，然而，利用納米材料來促進細胞生長及脂肪酸的積累，在裸藻大規(guī)模培養(yǎng)及相應脂肪酸生產的過程中，相關應用未見發(fā)明及報道。
通常情況下，裸藻的培養(yǎng)方法有自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)兩種。自養(yǎng)培養(yǎng)生長速度緩慢，不利于生物量的提高生物活性物質的積累；異養(yǎng)培養(yǎng)目前多采用富含蛋白多糖等營養(yǎng)物質的人工培養(yǎng)基，其中包含酵母膏、牛肉膏和蛋白胨等有機物質，雖然在該培養(yǎng)基中裸藻生長速度較快，但原料價格高昂，在開放或大規(guī)模培養(yǎng)過程中極易受到細菌、雜菌藻和原生動物等微生物污染，使得裸藻產量大大下降，嚴重的時候可能導致整批大規(guī)模培養(yǎng)的失敗，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產。如何同時提高裸藻的生物量與生物活性物質的含量，也就成了裸藻實現(xiàn)工業(yè)化生產的主要難題。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對裸藻培養(yǎng)中生長和油脂積累的矛盾，采用合理添加痕量的納米鐵材料，發(fā)明了一種配方簡易、成本低廉的新型培養(yǎng)方法，從而達到保證低廉成本、生長速度以及提高油脂積累的理想裸藻大規(guī)模培養(yǎng)的目的。
本發(fā)明提供的一種提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法，包括步驟：1)取對數(shù)生長期的藻液，離心取上清；2)用傳統(tǒng)培養(yǎng)基重懸藻細胞，離心，去上清，然后用傳統(tǒng)培養(yǎng)基重懸藻細胞；3)用去離子水重懸納米鐵顆粒，加入到培養(yǎng)液中；4)25-30℃光照培養(yǎng)。
進一步地，本發(fā)明提供的一種提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法的步驟3)中納米鐵顆粒的顆粒的直徑范圍在25-50納米。
進一步地，本發(fā)明提供的一種提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法的步驟3)中的合適濃度為5-80mg/L。
本發(fā)明應用商業(yè)化的納米鐵顆粒Nanofer 25,水相未被包被的、平均顆粒大小在25-50納米左右的金屬鐵顆粒，新鮮懸浮顆?？梢灾苯討?。有效應用濃度范圍在5-80mg/L。裸藻可以在異養(yǎng)或裸藻培養(yǎng)基中，在25-30℃條件下生長到平臺前期(～1-5×106cells/mL)，當做種子液以1/10的接種比率轉接到新鮮的培養(yǎng)液中，同時往培養(yǎng)液中添加相應濃度的納米鐵顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)使細胞生長到平臺后期(～107cells/mL)，達到收獲期。
該處理能提高5-15％的生物量，20-30％的脂肪酸積累，說明簡單添加痕量的納米鐵不僅可以增加裸藻的生物量而且能刺激更多的脂肪酸積累。
與傳統(tǒng)的、以往的技術方法相比，本發(fā)明提供的提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法可以使裸藻生長速度加快，更多的生物量積累，油脂和不飽和脂肪酸的含量都有顯著性提高，起到大幅度降低生產成本和運行時間周期、以及提高活性物質的質量等等目的。
具體實施方式
實施例一：
微藻培養(yǎng)及痕量元素的添加：取生長至對數(shù)期的藻液，將其稀釋成到OD750為0.5，以傳統(tǒng)的裸藻培養(yǎng)基培養(yǎng)裸藻作為對照。
新鮮購買的納米鐵顆粒(產品型號Nanofer 25，平均顆粒直徑為25-50納米)，用去離子水重懸到合適濃度(本領域普通技術人員熟知的濃度)，在常溫下可以保證2個月的穩(wěn)定期。
往培養(yǎng)液中分別加入不同體積的納米鐵懸液(終濃度分別為1,3,5,8,13,17,50,120mg/L)；接種生長至對數(shù)期的藻細胞，培養(yǎng)溫度為23±1℃，光照培養(yǎng)。
本實施例中采用的裸藻培養(yǎng)基的配方如下表1所示。
表1：裸藻培養(yǎng)基配方(按照重量份的成分)。
生物量測量：分別于第4、7、9天同一時間取10mL藻液于預先稱重的15mL離心管中，8000rpm離心收集藻細胞，棄上清，置于-80℃保存。全部樣品采集完畢后，管口用保鮮膜封好，扎若干小孔，置于冷凍干燥機中-45℃干燥24h。干燥完畢后，再次稱重，計算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃長期保存。
脂肪酸及其組分分析：稱5-10mg冷凍干燥的藻粉于帶蓋玻璃離心管中，加入50μL C19:0內標工作液、1mL 2M NaOH-CH3OH溶液，在轉速為100rpm的搖床上放置1h。之后于75℃水浴15min進行皂化，皂化完全后冷卻，加入1mL4M HCl-CH3OH溶液，并用濃HCl調節(jié)pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷卻后加入1mL正己烷，渦旋震蕩10s兩次，使萃取完全。4000rpm離心2min促進分層，小心吸取上層清液至色譜小瓶中，完成后置于通風櫥中。待溶劑揮發(fā)完全后，準備加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面處劃線標記，-20℃保存，盡早上機檢測。儀器運行參數(shù)同標準品。
脂肪酸組分與含量的分析：采用Agilent公司的GC-MS儀器，通過保留時間和特征離子對脂肪酸甲酯進行定性，用內標法通過計算峰面積對各脂肪酸甲酯組分進行定量。
氣相色譜柱：實驗采用的氣相色譜柱為毛細管柱，型號為VF-23ms(Part No.:CP8827)，它屬于聚硅氧烷類氣相毛細管極性色譜柱，非常適合脂肪酸甲酯的分析。該色譜柱耐受的最高溫度為260℃，本實驗采用的規(guī)格為30.0m×320μm×0.25μm。運行參數(shù)：進樣口溫度為250℃；載氣為高純He(純度高于99.999％)，恒壓模式；進樣體積為1μL，分流比為10:1；柱溫箱升溫程度如下：70℃保持4min，以25℃/min速率升溫至195℃，再以3℃/min速率升溫至205℃，然后以8℃/min速率升溫至230℃，保持1min；傳輸線溫度為250℃；溶劑延遲為3min；質譜檢測模式為全掃描模式，質量數(shù)(m/z)檢測范圍為50-550；電離方式為EI(70eV)離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃。
樣品的收集及處理：分別于第3、5、7天同一時間取10mL藻液于預先稱重的15mL離心管中，8000rpm離心收集藻細胞，棄上清，置于-80℃保存。全部樣品采集完畢后，管口用保鮮膜封好，扎若干小孔，置于冷凍干燥機中-45℃干燥24h。干燥完畢后，再次稱重，計算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃長期保存。
脂肪酸甲酯上機樣品的制備：稱5-10mg冷凍干燥的藻粉于帶蓋玻璃離心管中，加入50μL C19:0內標工作液、1mL2M NaOH-CH3OH溶液，在轉速為100rpm的搖床上放置1h。之后于75℃水浴15min進行皂化，皂化完全后冷卻，加入1mL 4M HCl-CH3OH溶液，并用濃HCl調節(jié)pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷卻后加入1mL正己烷，渦旋震蕩10s兩次，使萃取完全。4000rpm離心2min促進分層，小心吸取上層清液至色譜小瓶中，完成后置于通風櫥中。待溶劑揮發(fā)完全后，準備加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面處劃線標記，-20℃保存，盡早上機檢測。后續(xù)根據(jù)標準樣作為對照進行定性定量分析各種脂肪酸組分的質與量。
實施例二：
微藻培養(yǎng)及痕量元素的添加：取生長至對數(shù)期的藻液，將其稀釋成到OD750為0.5，以傳統(tǒng)的裸藻培養(yǎng)基培養(yǎng)裸藻作為對照。
新鮮購買的納米鐵顆粒(產品型號Nanofer 25，平均顆粒直徑為25-50納米)，用去離子水重懸到合適濃度(本領域普通技術人員熟知的濃度)，在常溫下可以保證2個月的穩(wěn)定期。
往培養(yǎng)液中分別加入不同體積的納米鐵懸液(終濃度分別為1,3,5,8,13,17,50,120mg/L)；接種生長至對數(shù)期的藻細胞，培養(yǎng)溫度為23±1℃。
生物量測量：分別于第4、7、9天同一時間取10mL藻液于預先稱重的15mL離心管中，8000rpm離心收集藻細胞，棄上清，置于-80℃保存。全部樣品采集完畢后，管口用保鮮膜封好，扎若干小孔，置于冷凍干燥機中-45℃干燥24h。干燥完畢后，再次稱重，計算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃長期保存。
脂肪酸及其組分分析：稱5-10mg冷凍干燥的藻粉于帶蓋玻璃離心管中，加入50μL C19:0內標工作液、1mL 2M NaOH-CH3OH溶液，在轉速為100rpm的搖床上放置1h。之后于75℃水浴15min進行皂化，皂化完全后冷卻，加入1mL4M HCl-CH3OH溶液，并用濃HCl調節(jié)pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷卻后加入1mL正己烷，渦旋震蕩10s兩次，使萃取完全。4000rpm離心2min促進分層，小心吸取上層清液至色譜小瓶中，完成后置于通風櫥中。待溶劑揮發(fā)完全后，準備加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面處劃線標記，-20℃保存，盡早上機檢測。儀器運行參數(shù)同標準品。
脂肪酸組分與含量的分析：采用Agilent公司的GC-MS儀器，通過保留時間和特征離子對脂肪酸甲酯進行定性，用內標法通過計算峰面積對各脂肪酸甲酯組分進行定量。
氣相色譜柱：實驗采用的氣相色譜柱為毛細管柱，型號為VF-23ms(Part No.:CP8827)，它屬于聚硅氧烷類氣相毛細管極性色譜柱，非常適合脂肪酸甲酯的分析。該色譜柱耐受的最高溫度為260℃，本實驗采用的規(guī)格為30.0m×320μm×0.25μm。運行參數(shù)：進樣口溫度為250℃；載氣為高純He(純度高于99.999％)，恒壓模式；進樣體積為1μL，分流比為10:1；柱溫箱升溫程度如下：70℃保持4min，以25℃/min速率升溫至195℃，再以3℃/min速率升溫至205℃，然后以8℃/min速率升溫至230℃，保持1min；傳輸線溫度為250℃；溶劑延遲為3min；質譜檢測模式為全掃描模式，質量數(shù)(m/z)檢測范圍為50-550；電離方式為EI(70eV)離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃。
樣品的收集及處理：分別于第3、5、7天同一時間取10mL藻液于預先稱重的15mL離心管中，8000rpm離心收集藻細胞，棄上清，置于-80℃保存。全部樣品采集完畢后，管口用保鮮膜封好，扎若干小孔，置于冷凍干燥機中-45℃干燥24h。干燥完畢后，再次稱重，計算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃長期保存。
脂肪酸甲酯上機樣品的制備：稱5-10mg冷凍干燥的藻粉于帶蓋玻璃離心管中，加入50μL C19:0內標工作液、1mL2M NaOH-CH3OH溶液，在轉速為100rpm的搖床上放置1h。之后于75℃水浴15min進行皂化，皂化完全后冷卻，加入1mL 4M HCl-CH3OH溶液，并用濃HCl調節(jié)pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷卻后加入1mL正己烷，渦旋震蕩10s兩次，使萃取完全。4000rpm離心2min促進分層，小心吸取上層清液至色譜小瓶中，完成后置于通風櫥中。待溶劑揮發(fā)完全后，準備加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面處劃線標記，-20℃保存，盡早上機檢測。后續(xù)根據(jù)標準樣作為對照進行定性定量分析各種脂肪酸組分的質與量。
如表一和表二所示，實施例1生物量有一定程度的提高(比如添加痕量納米鐵元素生物量(3-7天生長培養(yǎng)的10.53-23.1g/L，)比對照生物量(3-7天生長培養(yǎng)的9.12-19.38g/L)),飽和脂肪酸的量有所顯著下降(添加組3-7天生長培養(yǎng)的28.6-22.5ug/mg干重對比70.3-108.5ug/mg)，但是，具有高附加值的不飽和脂肪酸的量卻顯著的有了提升。比如，單不飽和脂肪酸的量從對照組的3-7天生長培養(yǎng)的4.3-8.3ug/mg到添加組的5.6-9.7ug/mg，多不飽和脂肪酸從對照組的3-7天生長培養(yǎng)的73.9-104.5ug/mg到添加組的26.7-44.9ug/mg，DHA含量則從對照組的3-7天生長培養(yǎng)的9.9-15.3ug/mg到添加組的73.9-104.5ug/mg。因此與傳統(tǒng)的、以往的技術方法相比，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)裸藻的高效、簡易添加衡量元素，從而可以使裸藻生長速度加快，更多的生物量積累，油脂和不飽和脂肪酸的含量都有顯著性提高，起到大幅度降低生產成本和運行時間周期、以及提高活性物質的質量等等目的。
異養(yǎng)培養(yǎng)基配方，按照重量份的成分：
a)準確稱量0.084g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，溶于10mL去離子水，現(xiàn)用現(xiàn)配。
b)“Metals 60A”配方，按照重量份的成分：
c)Vitamin B1：準確稱量0.1g Vitamin B1，溶于100mL去離子水，過濾除菌，存于4℃冰箱。
d)Vitamin B12：避光準確稱量0.02g Vitamin B12，溶于1000mL去離子水，取得到的溶液1mL稀釋至100mL，過濾除菌，存于4℃冰箱。
表1添加納米金顆粒(8mg/L)之后在異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間間隔(3,5,7天)生物量的比較,納米鐵-培養(yǎng)三天(nFe-3d)，對照組-培養(yǎng)后三天(CN-3d)
表2添加納米金顆粒(8mg/L)之后異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間間隔(3,5,7天)脂肪酸主要組分的比較,納米鐵-培養(yǎng)三天(nFe-3d)，對照組-培養(yǎng)后三天(CN-3d)，SFA，MUFA，PUFA分別是飽和脂肪酸，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸；