一種基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌及其構建方法與流程

文檔序號：12097029閱讀：651來源：國知局

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌的研究和應用領域。

背景技術：

基因工程方法致弱的鼠傷寒沙門氏菌作為載體表達外源基因，廣泛用于腫瘤、病毒病、細菌病、寄生蟲病等的治療研究，已取得了良好效果。但是在許多研究報道中的沙門氏菌載體，要么使減毒載體過度減毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是載體菌株卻減毒不夠，缺乏安全性而不能作為疫苗。因此迫切需要研制這樣的一種疫苗載體，既要使疫苗載體足夠減毒，保證動物完全的安全，又要使疫苗載體和其攜帶的外源抗原能夠誘導出優(yōu)秀的保護性抗體，抗擊相關病原的感染。

豬霍亂沙門氏菌是豬的重要病原菌，關于以豬霍亂沙門氏菌為載體遞送豬的其他病原抗原的研究，在國內外已有少量報道。而用阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌毒力基因的表達和缺失的報道卻是鮮少。發(fā)明人在前期研究過程中發(fā)現，用阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌的crp毒力基因所產生的載體菌可以誘導出對成年Balb/c小鼠較好的免疫原性，但是疫苗株的減毒不夠，作為疫苗株的安全性可能存在一定的風險，如中國專利文獻CN104498418A。

豬鏈球菌病是一種重要人畜共患傳染病，不僅影響著養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，還嚴重危害著人類的健康。目前我國的豬用商品化鏈球菌疫苗還存在著諸多不完善的方面，因此我們選擇大多數豬鏈球菌血清型菌株都有的的Sao（surface antigen one)）作為減毒株的異源抗原，對本研究中構建的可調控的延遲減毒的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株的相關特性和免疫效率進行了評價，以其為豬病的防控提供新的思路。

重組減毒沙門氏菌疫苗可以誘導機體產生顯著的粘膜免疫和細胞免疫，因此具備遞送外源抗原的載體特性。已有明確的研究顯示沙門氏菌載體對其所攜帶的外源基因有較多有利作用，例如，可以誘導出針對沙門氏菌本身和外源蛋白的細胞和黏膜免疫應答。研究還發(fā)現，有很多減毒沙門氏菌載體因為宿主的免疫壓力或者自身有限的定植能力，很難達到野生型菌株那樣的免疫原性；而一些減毒沙門氏菌雖然獲得足夠的免疫應答，但是菌株本身減毒不夠，不能作為疫苗載體。此外,沙門氏菌載體作為胞內菌誘導的免疫應答主要是以細胞和黏膜免疫為主，對于大多數病原感染所需要的體液免疫應答顯得蒼白無力。

沙門氏菌crp基因編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白，是細菌在哺乳動物宿主中攝取cAMP的唯一途徑；如果使沙門氏菌缺失crp基因，就使其喪失了代謝碳水化合物、氨基酸和小肽能力從而降低其毒力。在前期研究過程中發(fā)現（如CN104498418A），用阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌的crp毒力基因所產生的載體菌可以誘導出對成年BALB/c小鼠較好的細胞和黏膜免疫原性，但是疫苗株的減毒不夠，誘導的體液免疫應答偏弱，作為對仔豬疫苗株的安全性可能依然存在一定的風險，需要繼續(xù)篩選更加減毒的基因，構建安全的豬霍亂沙門菌疫苗載體。而沙門氏菌誘導的以細胞免疫為主的特性，對于需要體液免疫應答的病原仍然是一個缺陷，迫切需要尋找到平衡細胞免疫和體液免疫的技術和方法。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種安全性較高、較平衡的細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應答的基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌。

本發(fā)明所述豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌是缺失ΔmanA、ΔP_fur::TT araC P_BADfur、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA四種基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌，命名為rSC0012。

rSC0012(ΔmanA、ΔP_fur::TT araC P_BADfur、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA)保藏在位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號為CGMCC NO.12644，該生物材料的分類命名為：減毒豬霍亂沙門氏菌，拉丁文學名為:Salmonella choleraesuis。

本發(fā)明優(yōu)越性體現在：

1、減毒株的安全性更高：rSC0012株比擁有ΔP_crp::TT araCP_BADcrp突變的rSC0011減毒株更加減毒，作為幼齡動物疫苗載體具有更高的安全性。

2、減毒株誘導出平衡的細胞和體液免疫應答：攜帶豬鏈球菌2型的SaoA蛋白的rSC0012(pS-SaoA)可以誘導出更加平衡的細胞、體液和黏膜免疫應答，并可以100%抵抗野生型豬鏈球菌2型的攻擊。結果證明延遲缺失fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體對于幼齡動物的疫苗開發(fā)具有實踐意義。本發(fā)明可在制備遞送豬病原的疫苗載體方面應用。

本發(fā)明另一目的是提出以上豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌rSC0012的構建方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

1）構建在fur毒力基因的啟動子中插入araC P_BAD結構的自殺載體：

以減毒豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，分別使用引物P1和P2、P3和P4、以及P5和P6進行PCR擴增后，得到擴增產物片段1、片段2以及片段3，將片段1依次與片段3和片段2連接，產生ΔP_fur::TT araC P_BADfur 結構序列；再將ΔP_fur::TT araC P_BADfur 結構序列連接至自殺載體pRE112，獲得自殺載體質粒；然后將自殺載體質粒轉化至大腸桿菌χ7213中，取得fur毒力基因的啟動子中插入araC P_BAD結構的自殺載體，命名為χ7213(pS005)；

所述的引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分別如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’；

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’；

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’；

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’；

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’；

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’；

2）構建減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008：

在豬霍亂沙門氏菌C78-3中分別插入突變ΔmanA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT，得減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008；

3）構建rSC0009突變株：

將減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008引入所述fur毒力基因的啟動子中插入araC P_BAD結構的自殺載體，得rSC0009突變株；

4）構建基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌：

將rSC0009突變株中引入Δasd 突變基因，得基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌。

本發(fā)明利用阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌的鐵吸收調節(jié)蛋白(ferric uptake regulator, Fur)延遲缺失，控制豬霍亂沙門氏菌毒力基因缺失的時機，使豬霍亂沙門氏菌對鐵的代謝發(fā)生紊亂而減毒，同時影響沙門氏菌在淋巴系統(tǒng)的定居能力，導致缺失Fur蛋白的減毒沙門氏菌誘導的細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫的水平發(fā)生變化，以其獲得足夠減毒，最終使減毒株能夠像野生型豬霍亂沙門氏菌那樣高效率入侵宿主淋巴系統(tǒng)，誘導出比較平衡的細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應答，獲得足夠安全和平衡的免疫應答的仔豬霍亂沙門氏菌載體菌。

本發(fā)明是在豬霍亂沙門氏菌C78-3上構建的，使用araC P_BAD激活啟動子技術在豬霍亂沙門氏菌的編碼鐵吸收調節(jié)蛋白(ferric uptake regulator, Fur)的fur 基因的啟動子序列中引入araC P_BAD基因，使基因fur在菌體染色體中的表達受到阿拉伯糖的調控，以使得沙門氏菌毒力基因延遲缺失和表達，構建豬霍亂沙門氏菌fur 基因的含有ΔP_fur::TTaraC P_BADfur 結構序列的自殺載體。本發(fā)明使豬霍亂沙門氏菌C78-3獲得ΔmanA、ΔrelA::araC P_BAD lacI TT、ΔP_fur::TT araCP_BADfur 和ΔasdA 突變（優(yōu)選地，通過同源重組方法獲得這些突變），構建成含有ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araCP_BADfur 和ΔasdA 突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體rSC0012。

本發(fā)明的構建技術的有益效果：

1、本發(fā)明在構建載體的設計中是使用阿拉伯糖啟動子基因araC P_BAD調控豬霍亂沙門氏菌fur毒力基因的表達，即：利用動物體內沒有阿拉伯糖的特性，在體外人工培養(yǎng)載體菌時可以人為加入一定濃度的阿拉伯糖，載體菌的fur毒力基因能完全被表達，使載體菌在入侵宿主的初期具有像野生型菌株一樣的入侵能力，定植在宿主的淋巴系統(tǒng)，誘導出像野生菌誘導的免疫應答；而在載體菌進入宿主體內，隨著細菌的復制，體外人工加入的阿拉伯糖濃度不斷被稀釋，載體菌表達的Fur蛋白濃度也不斷減少，使細菌逐漸減毒獲得作為疫苗載體的安全性；本方法是首次用于豬霍亂沙門氏菌fur毒力基因的構建。

2、本發(fā)明采用無抗性標記的自殺載體作為構建豬霍亂沙門氏菌載體的方法，可以避免使用抗生素標記的載體，避免減毒載體產生耐藥性。

3、本發(fā)明還采用了平衡-致死的細菌/載體系統(tǒng)法。其中平衡-致死的細菌/載體系統(tǒng)法是刪除了細菌的asd基因，強制性地使細菌的生長需要人為加入二氨基庚二酸（是細菌細胞壁肽聚糖層的一種基本成分），同時在表達外源抗原質粒載體上加入野生型細菌的asd基因。然后將asd⁺的質粒電轉化到asd^-的細菌載體上形成互補，可以保證只有攜帶外源抗原的疫苗株才能在生產疫苗和免疫的宿主體內存活，提高疫苗的免疫效率。

附圖說明

圖1是ΔP_fur::TT araCP_BADfur基因缺失構建圖。

圖2是ΔP_fur::TT araCP_BADfur自殺載體圖。

圖3是ΔmanA缺失株陽性菌的表型鑒定的LPS膠銀染色圖。圖中，泳道A：ΔmanA缺失株無甘露糖；泳道B：ΔmanA缺失株有甘露糖；泳道C：C78-3野毒株。

圖4是阿拉伯糖調控LacI蛋白的表達的Western blot圖。圖中，泳道1～5分別為χ0008在營養(yǎng)培養(yǎng)液中傳的代次，LacI.38 kD；泳道M為蛋白marker。

圖5是ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株陽性菌的PCR電泳圖鑒定的電泳圖。泳道M：DL2000 DNA marker；泳道1～5：陽性結果（即：鑒定為突變陽性的樣品進一步純化后隨機抽取菌落的PCR電泳圖；以下出現的“陽性結果”，除非特殊說明，均為這種情況）。

圖6是ΔasdA突變株的PCR電泳圖鑒定的電泳圖。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1～6Δasd陽性結果。

圖7是rSC0012(ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur，ΔasdA)的PCR電泳圖鑒定。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1：ΔP_fur::TT araC P_BADfur陽性結果；泳道2：ΔmanA陽性結果；泳道3、4：ΔrelA::araC P_BADlacI TT 前后單交換陽性結果；泳道5：Δ asdA陽性結果。

圖8是無甘露糖時rSC0012失去O抗原，有甘露糖時恢復O抗原的電泳圖。泳道A：C78-3強毒株；泳道B：rSC0018弱毒株；泳道C：rSC0012菌株(-mannose)；泳道D：rSC0012菌株(+mannose)。

圖9是阿拉伯糖調控SaoA蛋白的表達的Western blot圖。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的代次。

圖10是阿拉伯糖調控Fur蛋白的表達的Western blot圖。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的代次。

圖11是rSC0012在含DAP和不含DAP的LB液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)的比較圖。左側試瓶：rSC0012在不含DAP的LB液體培養(yǎng)基中不生長；右側試瓶：rSC0012在含DAP的LB液體培養(yǎng)基中正常生長。

圖12是SaoA基因的擴增電泳圖。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1、2：SaoA基因。

圖13是純化SaoA蛋白的Western Blot鑒定圖。泳道M：蛋白Marker；泳道1：純化SaoA蛋白；泳道2：BL21(pET28a-SaoA)菌體蛋白。

圖14是asd⁺的未插入外源基因的質粒pYA3493的結構示意圖。

圖15是asd⁺的插入SaoA基因的質粒pS-SaoA的結構示意圖。

圖16是減毒株在6周齡BALB/c小鼠肝臟中定植能力比較圖。

圖17是減毒株在6周齡BALB/c小鼠脾臟中定植能力比較圖。

圖18是減毒株在6周齡BALB/c小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結中定植能力比較圖。

圖19是減毒株在21d BALB/c小鼠肝臟中的定植能力比較圖。

圖20是減毒株在21d BALB/c小鼠脾臟中的定植能力比較圖。

圖21是減毒株在21d BALB/c小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結中定植能力比較圖。

圖22是pS-SaoA質粒在rSC0012(pS-SaoA)中傳10-50代PCR結果的鑒定電泳圖。泳道M：DL10000 DNA marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)的第10～50代。

圖23是pS-SaoA質粒在rSC0012(pS-SaoA)中傳 10-50代酶切結果結果的鑒定電泳圖。泳道M：DL10000 DNA marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA) 的第10～50代。

圖24是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導的抗SaoA 的IgG圖。

圖25是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導的抗沙門氏菌減毒株外膜蛋白OMPs的IgG圖。

圖26是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導的抗SaoA IgA水平圖。

圖27是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導IFN-γ水平圖。

圖28是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導IL-4水平圖。

圖29是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導的抗SaoA IgG圖。

圖30是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導的抗沙門氏菌減毒株OMPs的IgG圖。

圖31是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導的抗SaoA IgA的圖。

圖32是減毒株免疫21d BALB/c小鼠誘導IFN-γ水平的圖。

圖33是減毒株免疫21d BALB/c小鼠誘導IL-4水平的圖。

具體實施方式

為了闡明本發(fā)明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做進一步的介紹。

一、構建減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012。

1、構建在fur毒力基因的啟動子中插入araC P_BAD結構的自殺載體（ΔP_fur::TT araCP_BADfur）：

在Genbank中搜索豬霍亂沙門氏菌的全基因序列，找到豬霍亂沙門氏菌的fur基因及其上游啟動子序列，在fur基因啟動子的左右側設計同源臂引物序列，刪除fur基因啟動子區(qū)的238個核苷酸，然后插入轉錄終止子（TT）和araC P_BAD激活啟動子序列1335bp，其刪除和插入的系統(tǒng)為：fur基因上游fldA部分序列、刪除fur基因啟動子區(qū)238bp后右側的序列、插入的轉錄終止子（TT）和araC P_BAD激活啟動子序列1335bp、刪除fur基因啟動子238bp后左側序列，全稱為ΔP_fur::TT araCP_BADfur（P表示啟動子，TT表示轉錄終止子）（如圖1所示。

具體步驟如下：

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P1和P2經PCR擴增得到fldA同源臂區(qū)，命名為片段1(330 bp)。

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P3和P4經PCR擴增得到刪除fur基因啟動子區(qū)的238 bp核苷酸后其余的fur基因中的同源臂，命名為片段2(356 bp)。

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P5和P6經PCR擴增得到TT araC P_BAD結構序列，命名為為片段3。

取22.8 μL 滅菌蒸餾水（SW）、0.6 μL上游引物、0.6 μL 下游引物、1 μL模板和25 μL Supermix組成總體積為50 μL的PCR反應體系，反應條件為：94 ℃預變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

隨后，將片段1與片段3經平端連接，再將連接產物連接至pGEM-TEasyVector克隆載體（promega公司）；將連接產物酶切后，再與片段2經平端連接；將連接產物再連接至pGEM-TEasyVector克隆載體，產生ΔP_fur::TT araC P_BADfur結構序列，經Takara公司測序，證明已獲得正確的ΔP_fur::TT araC P_BADfur結構陽性質粒序列。

將上述陽性質粒經SphI和Xmal酶切，酶切產物連接至具有氯霉素和蔗糖篩選標記的自殺載體pRE112 （由Dr.Curtiss Roy III惠贈，Arizona State University）中，獲得的質粒稱為pS005；通過酶切和測序雙重鑒定，將含有正確的ΔP_fur::TT araC P_BADfur結構的自殺載體質粒pS005通過電轉化至大腸桿菌χ7213中，取得在fur毒力基因的啟動子中插入araC P_BAD結構的自殺載體，如圖2所示，命名為χ7213(pS005)，保存于-20℃環(huán)境中。

引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分別如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’。

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’。

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’。

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’。

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’。

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’。

2、構建rSC0008（ΔmanA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT）及其表型的鑒定：

在豬霍亂沙門氏菌C78-3中分別插入突變ΔmanA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT，稱為減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008（Ji Z, Shang J, Li Y, Wang S, Shi H. Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccine vector displaying regulated delayed attenuation and regulated delayed antigen synthesis to confer protection against Streptococcus suis in mice. Vaccine. 2015 Sep 11;33(38):4858-67）。其中manA基因缺失后，在沙門氏菌的代謝過程中，6-磷酸果糖生成6-磷酸甘露糖的過程中缺少了磷酸甘露糖異構酶，manA基因缺失菌就不能合成LPS O-抗原的側鏈，在LPS中O-抗原就會變成光滑的條帶；但是在體外培養(yǎng)時，人工加入甘露糖后，具有ΔmanA突變的細菌可以合成LPS O-抗原，見圖3所示：ΔmanA缺失株無甘露糖時失去O抗原。

在ΔrelA::araC P_BAD lacI TT突變的結構中，由阿拉伯糖控制lacI基因的表達。即當有阿拉伯糖存在時，lacI基因被表達，表達的lacI蛋白就抑制沙門氏菌突變株攜帶的原核表達載體表達外源蛋白；反之，當在沒有阿拉伯糖存在的動物機體內，lacI基因不能被表達，沙門氏菌突變株攜帶的原核表達載體就能更高效地表達外源蛋白。因此在培養(yǎng)突變株χ0008第一代時，加入0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖；從第二代培養(yǎng)開始，就不加阿拉伯糖和甘露糖，這樣連續(xù)傳代培養(yǎng)10代。隨著傳代代數的增加，細菌中阿拉伯糖的含量逐漸減少，lacI基因表達成蛋白的量就不斷減少，見圖4阿拉伯糖調控LacI蛋白的表達。

3、構建含有ΔP_fur::TT araC P_BADfur突變的rSC0009突變株（C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur）：

在受體菌rSC0008(C78-3ΔmanA, ΔrelA::araC P_BADlacI TT)中引入步驟1.1中所獲得的含有ΔP_fur::TT araC P_BADfur結構的自殺載體χ7213(pS005)，構建rSC0009突變株：

具體步驟如下：

1）供體菌和受體菌的結合：

受體菌液的制備：在1mL LB培養(yǎng)基中加入rSC0008（C78-3ΔmanA, ΔrelA::araCP_BADlacI TT），37℃培養(yǎng)10-12小時，得受體菌液。

供體菌的制備：在含有50mg/mL的2,6-二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelic acid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培養(yǎng)液中加入自殺載體χ7213（pS005）37℃培養(yǎng)10-12小時，得供體菌液。

然后將受體菌液和供體菌液混合，使受體菌和供體菌發(fā)生結合，取得結合的菌落。

2）ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株的篩選：

將結合的菌落在含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃單菌落；取生長的單菌落在1mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃搖震培養(yǎng)至菌液濃度混濁；每個菌液按照10倍稀釋至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)出單菌落，并將其命名為rSC0009突變株。

3）rSC0009(C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur)突變株的PCR鑒定：

將在5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上長出的菌落，分別在LB固體培養(yǎng)板上和含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃線；將在LB固體培養(yǎng)板上生長，但是在含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上不生長的菌落，用引物P1和P4進行PCR鑒定，ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株陽性菌的PCR片段大小為2015 bp，陰性菌的PCR片段大小為919 bp。PCR鑒定結果如圖5所示：在泳道1～5上可見陽性結果，說明已制得了rSC0009突變株。

4、構建豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012。

在rSC0009突變株（ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur）中引入Δasd突變，具體步驟如下：

1）供體菌和受體菌的結合：

受體菌液的制備：在1mL LB培養(yǎng)基中加入受體菌rSC0009（C78-3ΔmanA, ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araCP_BADfur ），37℃培養(yǎng)10-12小時，得受體菌液。

供體菌液的制備：在含有50 mg/mL的2,6- 二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelic acid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培養(yǎng)液中加入χ7213（pS004）(Δasd的自殺載體，由本實驗室構建，具體方法見Ji Z, Shang J, Li Y, Wang S, Shi H. Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccine vector displaying regulated delayed attenuation and regulated delayed antigen synthesis to confer protection against Streptococcus suis in mice. Vaccine. 2015 Sep 11;33(38):4858-67)，37℃培養(yǎng)10-12小時，得供體菌液。

將受體菌液和供體菌液混合，使受體菌和供體菌發(fā)生結合，取得結合的菌落。

2）Δasd缺失株的篩選：

將結合的菌落在含氯霉素和DAP的LB固體培養(yǎng)板上劃單菌落；取生長的單菌落在含有DAP的1mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃搖震培養(yǎng)至菌液濃度混濁；每個菌液按照10倍稀釋至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)出單菌落。

3）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012 (C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur，Δasd)突變株的PCR鑒定：

將在5%蔗糖和DAP的LB固體培養(yǎng)板上長出的菌落，分別在LB固體培養(yǎng)板、含有DAP的LB固體培養(yǎng)板，和同時含有DAP和氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃線；將只在含有DAP得LB固體培養(yǎng)板上生長，但是在LB固體培養(yǎng)板、同時含有DAP和氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上不生長的菌落，用引物P7（5’-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3’）和P8（5’-TCCCCCGGG TATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3’）進行PCR鑒定，Δasd陽性菌的PCR片段大小633bp，陰性菌的PCR片段大小為1719bp。如圖6所示。

將rSC0009（ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur）+Δasd突變株命名為減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012。

減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012保藏在位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號為CGMCC NO.12644，該生物材料的分類命名為：減毒豬霍亂沙門氏菌，拉丁文學名為:Salmonella choleraesuis。

二、對構建的含fur基因啟動子修飾的減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012進行表型鑒定：

1、PCR鑒定rSC0012減毒豬霍亂沙門氏菌中的突變：

由引物P9（ΔmanA）和P10（ΔmanA）對rSC0012株中的ΔmanA突變進行PCR擴增。

由引物P11（ΔrelA）和P12（ΔrelA）對rSC0012株中的ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變進行PCR擴增。

由引物P13（ΔP_fur）和P14（ΔP_fur）對rSC0012株中的ΔP_fur::TT araCP_BADfur突變進行PCR擴增。

由引物P15（ΔasdA）和P16（ΔasdA）對rSC0012株中的ΔasdA突變進行PCR擴增。

以上各引物序列見下：

P9（ΔmanA）：5’-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3’。

P10（ΔmanA）：5’- GGGGGTACCTACGGCGACGGACACATGTTCGCT-3’。

P11（ΔrelA）：5’- CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3’。

P12（ΔrelA）：5’- CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3’。

P13（ΔP_fur）：5’- ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG-3’。

P14（ΔP_fur）：5’- TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG-3’。

P15（ΔasdA）：5’- TGCTCTAGATGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3’。

P16（ΔasdA）：5’- TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3’。

其中，每個突變片段的PCR的反應體系和條件分別如下：

1）ΔmanA PCR擴增體系的總體積為 25μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3ul MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P9、0.3μL 引物P10、2μL 模板和0.2μL Taq DNA聚合酶；其反應條件為：95℃預變性2min；95℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 1min，共25個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

2）ΔrelA::araC P_BADlacI TT PCR擴增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P11、0.3μL 引物P12、2μL模板和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應條件為：95℃預變性2min；95℃變性30s，退火溫度為60℃ 2 min，72℃延伸 3min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

3）ΔP_fur::TT araCP_BADfur PCR擴增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P13、0.3μL 引物P14、2μL 模板和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

4）ΔasdA PCR擴增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P15、0.3μL 引物P16、2μL 模板和和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

圖7反映了4個突變的PCR片段的結果，可見：該菌株上的4個突變的PCR片段大小與預期的結果完全符合。

2、rSC0012突變株的表型鑒定：

1）ΔmanA突變的表型鑒定：

將野生型豬霍亂沙門氏菌C78-3（購自中監(jiān)所）、中國豬霍亂沙門氏菌標準弱毒疫苗株C500（購自中監(jiān)所）作為對照；設rSC0012中加入和不加入甘露糖（mannose）組，進行銀染色實驗。由于ΔmanA導致突變株的LPS-O抗原側鏈缺失，LPS膠呈現光滑性(如圖8中泳道C所示)。而在培養(yǎng)基中添加甘露糖后，突變株能夠正常合成LPS-O抗原，LPS膠恢復條帶(如圖8中泳道D所示)。而對照組C78-3、C500的LPS膠皆呈現有條帶，且C78-3的條帶顏色更深。圖8顯示，泳道A為C78-3株，泳道B為C500株（rSC0018弱毒株），泳道C為沒有加甘露糖的rSC0012株，泳道D為加入甘露糖的rSC001株的LPS銀染色圖。

2）ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的表型鑒定：

在ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的結構中，是由阿拉伯糖控制lacI基因的表達。即當有阿拉伯糖存在時，lacI基因被表達，表達的lacI蛋白就抑制沙門氏菌突變株攜帶的原核表達載體表達外源蛋白；反之，當在沒有阿拉伯糖存在的動物機體內，lacI基因不能被表達，沙門氏菌突變株攜帶的原核表達載體就能更高效地表達外源蛋白。因此本實驗需要突變菌株攜帶能表達外源蛋白原核表達載體的配合，因此使用rSC0012(pS-SaoA)作為驗證ΔrelA::araC P_BADlacI TT表型的菌株。

rSC0012(pS-SaoA)隨著阿拉伯糖濃度的稀釋，原核載體pS-SaoA表達的外源蛋白SaoA逐漸增加。具體方法如下：

取rSC0012(pS-SaoA)單菌落于2mL NB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床220rpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)時間12h為一代，將菌液按體積比1:100接種5mL NB培養(yǎng)基傳單培養(yǎng)。在培養(yǎng)第一代時，向正常情況下不含阿拉伯糖的NB培養(yǎng)基中添加0.2 %阿拉伯糖，而從第二代培養(yǎng)開始不添加阿拉伯糖，如此盲傳10代。經過蛋白表達最佳條件的摸索后，挑取每代單菌落于含有LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過夜；按1:50接種50mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(含25 μg/mL Kan)，于37℃恒溫搖床220 rpm培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6～1.0，加入1% IPTG誘導4h，4℃ 6000rpm離心8min，棄去上清，加4mL PBS重懸沉淀，再次4 ℃離心收集菌體沉淀，加入4mL PBS，經超聲波細胞裂解儀裂解細菌細胞(工作時間1s，工作間隙3s)直至溶液透亮，離心后分別收集上清和沉淀。經SDS-PAGE檢測蛋白條帶大小；以兔抗SaoA血清為一抗溶液，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗溶液，用Western Blot方法檢測SaoA蛋白表達的情況。

在ΔrelA::araC P_BADlacI TT中，lacI基因的表達受到阿拉伯糖的控制。如果培養(yǎng)條件中有阿拉伯糖，菌株就會表達lacI基因，而沙門氏菌突變株所攜帶原核表達載體的外源蛋白的表達則受到抑制。相反，如果培養(yǎng)條件是動物機體內（這里沒有阿拉伯糖），lacI基因就不能被表達，沙門氏菌突變株就能表達所攜帶原核表達載體的外源蛋白。

隨著盲傳代數的增加，培養(yǎng)基中首次加入的阿拉伯糖的含量逐漸減少，lacI基因的表達受到抑制，沙門氏菌突變株攜帶原核表達載體的外源抗原SaoA蛋白的表達量就逐漸增高。Western Blot 的實驗結果見圖9所示，其中泳道1～5分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的1～5代，由圖9可見，隨盲傳代數的增加，SaoA蛋白(35 kD)的表達量逐漸增加。

3）ΔP_fur::TT araC P_BADfur 突變的表型鑒定：

fur基因是沙門氏菌對鐵進行代謝的調控基因。在實驗設計時在fur基因的啟動子中加入了araC P_BAD基因（由阿拉伯糖調控），使fur基因所表達的蛋白受到阿拉伯糖的調控。因此對fur基因缺失的表型鑒定也可以用以上rSC0012突變株的表型鑒定中對ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的表型鑒定的方法，即在體外培養(yǎng)第一代rSC0012菌株的NB培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖，隨后的連續(xù)傳代培養(yǎng)，都不加阿拉伯糖。隨著菌株的分裂，培養(yǎng)基中可利用的阿拉伯糖濃度逐漸下降，而隨著培養(yǎng)基中阿拉伯糖濃度逐漸下降，菌株中的fur基因所表達的蛋白也就逐漸減少，直至缺失。圖10中泳道1～5分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳至1～5代時的阿拉伯糖調控Fur蛋白的表達條帶，由圖10可知，隨之菌株傳代次數的增多，阿拉伯糖的濃度逐漸減少，Fur蛋白的表達量也逐漸減少。

4）ΔasdA 的表型鑒定：

挑取rSC0012單菌落分別接種5mL LB液體培養(yǎng)基和含DAP的LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL DAP)中，于37 ℃恒溫搖床220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，觀察該菌在兩種不同營養(yǎng)條件中培養(yǎng)的生長狀態(tài)。

二氨基庚二酸(DAP)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。asd基因編碼的天冬氨酸脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必須酶。所以Δasd突變株的生長依賴于在培養(yǎng)條件下額外添加DAP。結果表明，rSC0012菌株在含有DAP的LB液體培養(yǎng)基中可以正常生長（見圖11中右側試瓶），而在普通LB液體培養(yǎng)基中無法生長（見圖11中左側試瓶）。

三、選擇大多數豬鏈球菌血清型菌株都有的SaoA（surface antigen one)蛋白作為減毒株的異源抗原，對本研究中構建的可調控的延遲減毒的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株的相關特性（如：毒力（LD₅₀）、定植能力和穩(wěn)定性等）進行了評價，以其為豬病的防控提供新的思路。

1、構建遞送豬鏈球菌SaoA蛋白的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012平衡-致死系統(tǒng)：

1）豬鏈球菌2型saoA基因的克隆和表達：

豬鏈球菌2型是豬的重要疫病，為檢測本申請中構建的延遲缺失fur基因豬霍亂沙門氏菌的免疫效率，選擇豬鏈球菌2型SaoA蛋白作為減毒豬霍亂沙門氏菌遞送的異源抗原。經SaoA-F（ATGGATCGCAACCTGATGGAAGAC）、SaoA-R（GGGTCGAGCATTGCTACCTTAGAG）引物PCR，經過膠回收、BamHI和SalI雙酶切處理，在T4連接酶作用下與同樣經過雙酶切處理的原核表達載體pET-28a相連接，化學轉化法轉化至表達菌株BL21中，得到BL21(pET28a-SaoA)菌株。將酶切鑒定陽性的菌株送南京金斯瑞測序。結果可知，酶切后獲得了5639bp的載體pET28a的片段和777bp的SaoA片段，長度為789bp，測序后獲得的基因序列見下：

ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

gtagtacgac tatttggtcg tgagcttcta gaaaatgaat ttaaatttga gcttagagaa 120

gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

agatttaaaa atctatcatt cgataagcct ggcaaatact ggtatacaat ttcagaagta 240

aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

aaagagggaa cctataccta cactgtttca gaagttgatg gtggacttgg cgatattatc 600

tatgacaaat cagatattaa ggccactgtt actgtgaaag ataacaatca cggacaacta 660

gtctcaacag tgacttatga aaatagcgat caaatcttcg agaatatttt gaatcctggg 720

aagttaatag cgccaaccac ggatagcgtt attactgata atgaagtctc taaggaagca 780

ctggtcgac 。

將以上酶切產物777bp的SaoA片段測序后獲得的基因序列與標準豬鏈球菌的SaoA序列比較，證明酶切的777bp的SaoA序列完全正確。

檢測BL21(pET28a-SaoA)中的SaoA蛋白表達結果見圖13所示：BL21(pET28a-SaoA)能夠有效表達外源插入的SaoA蛋白片段，條帶大小為35kD），與預期相符。

2）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012平衡-致死系統(tǒng)的構建：

為避免使用含抗性基因的質粒載體，保證減毒沙門氏菌中的質粒載體在宿主體內的穩(wěn)定性，本專利中我們構建的減毒豬霍亂沙門氏菌載體rSC0012是缺失了asd基因的（asd^-），這是為了使asd^-的載體與asd⁺的原核表達載體（pYA3493）形成互補。即：當缺失asd基因的菌株在體外培養(yǎng)時可以通過加入二氨基庚二酸（diaminopimelic acid，DAP），彌補由于缺失asd基因后細菌不能生長的缺陷。但是由于動物機體內沒有二氨基庚二酸，缺失asd基因的沙門氏菌在動物體內就不能存活，而原核表達載體pYA3493為asd⁺的質粒，在pYA3493中插入豬鏈球菌2型的SaoA基因后的pS-SaoA也是asd⁺的質粒（見圖14和圖15所示）；然后將pYA3493或pS-SaoA轉化入asd^-的減毒沙門氏菌rSC0012中，asd⁺的質粒與asd^-的細菌就形成互補，從而使缺失asd基因的沙門氏菌在動物體內可以存活的同時，避免因使用抗性基因質粒載體而造成載體菌的耐藥。

因此本實施首先將突變菌株rSC0012（C78-3 ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur Δasd）制作成感受態(tài)。具體步驟是：挑取單菌落rSC0012用含有50mg/mL DAP的2mL的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜；次日按1:100比例，將過夜培養(yǎng)的菌液接種至20 mL的LB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀≈0.6，冰浴10 min，4℃、1500rpm離心10min收集細菌，沉淀細菌用冰浴預冷的10%甘油洗3遍，用25μl預冷的10%甘油重懸，即為rSC0012的感受態(tài)細胞。獲得rSC0012的感受態(tài)細胞后，用氯化鈣法，取1μL的質粒pYA3493（由Dr.Curiss Roy III惠贈，Arizona State University）或者pS-SaoA轉化至rSC0012的感受態(tài)細胞中；將轉化產物涂布于含有0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜（不含DAP）；取長出的單個菌落繼續(xù)培養(yǎng)提取質粒（pYA3493或者pS-SaoA），經EcoRI單酶切，獲得3113bp條帶的菌株即為攜帶質粒pYA3493的rSC0012，稱為rSC0012（pYA3493）；或者單酶切后獲得3890bp條帶的菌株為攜帶pS-SaoA的rSC0012，成為rSC0012(pS-SaoA)；rSC0012（pYA3493）或rSC0012(pS-SaoA)能夠在不加DAP的培養(yǎng)條件或在沒有DAP的動物體內復制生長。

3）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011或rSC0018平衡-致死系統(tǒng)的構建：

以公布于2015年(Zhenying Jib, Jing Shangb, Yuan Li, Shifeng Wang, Huoying Shi, Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccinevector displaying regulated delayed attenuation and regulateddelayed antigen synthesis to confer protection againstStreptococcus suis in mice, Vaccine 33 (2015) 4858–4867)的不含有ΔsopB 的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA）和rSC0018（C500ΔasdA）作為對照減毒株的準備：

豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0018平衡-致死系統(tǒng)的構建：

rSC0018（C500ΔasdA）菌株是本實驗室在前期的研究中，以中國豬霍亂沙門氏菌標準弱毒疫苗株C500為模板，引入ΔasdA突變，命名為rSC0018株。然后挑取單菌落rSC0018用含有50mg/mL DAP的2mL的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜；次日按1:100比例，將過夜培養(yǎng)的菌液接種至20 mL的LB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6，冰浴10 min，4℃、1500rpm離心10min收集細菌，沉淀細菌用冰浴預冷的10%甘油洗3遍，用25μl預冷的10%甘油重懸，即為rSC0018的感受態(tài)細胞。獲得rSC0018的感受態(tài)細胞后，用氯化鈣法，取1μL的質粒pYA3493（由Dr.Curiss Roy III惠贈, Arizona State University）或者pS-SaoA轉化至rSC0018的感受態(tài)細胞中；將轉化產物涂布于含有0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜（不含DAP）；取長出的單個菌落繼續(xù)培養(yǎng)提取質粒（pYA3493或者pS-SaoA），經EcoRI單酶切，獲得3113bp條帶的菌株即為攜帶質粒pYA3493的rSC0018，稱為rSC0018（pYA3493）；或者單酶切后獲得3890bp條帶的菌株為攜帶pS-SaoA的rSC0018，成為rSC0018(pS-SaoA)；rSC0018（pYA3493）或rSC0018(pS-SaoA)能夠在不加DAP的培養(yǎng)條件或在沒有DAP的動物體內復制生長。

2、豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)與野毒株C78-3、減毒株rSC0011(pS- SaoA)、弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)的毒力比較：

為測定豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的毒力，取豬霍亂沙門氏菌野毒株C78-3，中國現用豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)、含有crp基因缺失的減毒株rSC0011(pS-SaoA)和含有fur基因缺失的減毒株rSC0012(pS-SaoA)株進行半數致死量（LD₅₀）的測定和比較。

1）在6周齡BALB/c 小鼠中的LD₅₀的測定：

具體實施為，從-70℃超低溫冰箱中取出實驗菌株，無菌劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)平板上，37℃靜置培養(yǎng)過夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培養(yǎng)液中；用于培養(yǎng)突變株的LB培養(yǎng)液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等細菌濃度達到OD值為0.8～0.9時，取出菌株培養(yǎng)液，離心，將細菌濃度調節(jié)到10¹⁰CFU/ml后，用PBS 10倍稀釋到不同的稀釋濃度。

首先用腹腔注射途徑進行攻毒。120只雌性6周齡 BALB/c鼠隨機分成12小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-1，10^-2和10^-3；3小組用于中國現用弱毒疫苗株rSC0018的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7 和10^-8 ；3小組用于豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7和10^-8；3小組用于豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7和10^-8；每只小鼠用100μL細菌懸液腹腔注射，連續(xù)觀察30日，計算小鼠的死亡數。實驗結果顯示野毒株C78-3的LD₅₀是2.2×10²；疫苗株rSC0018的LD₅₀是2.6×10⁷；減毒株rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀是1.4×10⁷, 減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀是1.1×10⁸（見下表）。結果表明，減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀比強毒株C78-3降低了5×10⁵倍，比商用中國沙門氏菌疫苗株rSC0018的LD₅₀低4.2倍，比含有ΔP_crp::TT araC P_BADcrp突變的減毒沙門氏菌rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀低7.9倍。證明豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)比中國現用弱毒疫苗株rSC0018和rSC0011(pS-SaoA)還要減毒。

通過口服方式進行LD₅₀的測定。70只雌性6周齡 BALB/c鼠隨機分成7小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-3，10^-4和10^-5；而中國現用弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)，豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)和豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)分別使用2小組，稀釋度為10^-8和10^-9；以上各組小鼠經口服途徑攻毒，攻毒后連續(xù)觀察30日，每日記錄死亡小鼠。結果顯示，C78-3的LD₅₀為5.5×10⁴；rSC0018(pS-SaoA)，rSC0011(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒劑量大于10⁹時，小鼠都存活。說明口服途徑這3株減毒株都不能致死6周齡 BALB/c小鼠（見下表）。下表中，口服和腹腔接種途徑，rSC0012(pS-SaoA)株和rSC0011(pS-SaoA)株的LD₅₀與C78-3比較差異顯著（ **： p<0.01 ）；通過腹腔接種途徑，rSC0012(pS-SaoA)株的LD₅₀比rSC0011(pS-SaoA)株的LD₅₀減毒7.8倍，差異顯著（##： p<0.01）。

2）在21日齡BALB/c 小鼠中的LD₅₀的測定：

通過口服方式進行LD50的測定。120只雌性21日齡 BALB/c鼠隨機分成9小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測定，稀釋度分別是10^-3，10^-4和10^-5；而中國現用弱毒疫苗株rSC0018，豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)和豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的分別使用3小組，稀釋度為10^-7、10^-8和10^-9；以上各組小鼠經口服途徑攻毒，攻毒后連續(xù)觀察30日，每日記錄死亡小鼠。結果顯示，C78-3的LD₅₀為9.5×10²；rSC0018(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒劑量大于10⁹時，小鼠都存活（見下表）。說明口服途徑這2株減毒株都不能致死小鼠，而rSC0011(pS-SaoA)組的小鼠在口服劑量為1.0×10⁹ 時小鼠開始出現皮毛粗糙，精神恍惚的癥狀，但是在攻毒后7d，這些癥狀消失，而在rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠未出現任何病理癥狀。說明rSC0012(pS-SaoA)對幼鼠的毒力明顯小于rSC0011(pS-SaoA)株。

實驗菌株在不同年齡段BALB/c鼠中的LD₅₀對比表：

3、豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012的定植能力評價：

在前期研究中發(fā)現，含有crp基因延遲缺失的減毒豬霍亂沙門氏菌毒株rSC0011(pS-SaoA)經口服21日齡仔豬時，可引起部分仔豬飲食下降，說明rSC0011的減毒能力不夠，因此我們設計了基因調控延遲缺失豬霍亂沙門氏菌毒力基因fur的減毒株rSC0012，擬使其成為更加安全的疫苗候選株。因此本實施比較了含有fur基因缺失的減毒株rSC0012（pYA3493），和含有crp基因缺失的減毒株rSC0011（pYA3493），中國商用弱毒疫苗株rSC0018（pYA3493）（弱毒的對照組）和野毒株C78-3在6周齡和21d BALB/c小鼠的肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結（payer`s patches）的定植能力。

1）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012在6周齡BALB/c小鼠中的定植能力：

從-70℃超低溫冰箱中取出實驗菌株，無菌劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)平板上，37℃靜置培養(yǎng)過夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培養(yǎng)液中；用于培養(yǎng)突變株的LB培養(yǎng)液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等細菌濃度達到OD值為0.8～0.9時，取出菌株培養(yǎng)液，離心，將細菌濃度調節(jié)到10¹⁰CFU。

60只6周齡BALB/c小鼠隨機分成20小組，每小組3只小鼠。5小組用于野毒株C78-3的定植實驗；5小組用于疫苗株rSC0018的定植實驗；5小組用于含有crp基因缺失的減毒株rSC0011（pYA3493）的定植實驗；5小組用于含有fur基因缺失的減毒株rSC0012（pYA3493）的定植實驗；每只小鼠口服10⁹ CFU/20ul細菌懸液；每菌株分別在接種后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝臟、脾臟和腸道的派伊爾氏淋巴小結（payer s patches），經稱重和無菌研磨，涂布于麥康凱培養(yǎng)基中分離細菌，計算組織的細菌量。本實驗重復3次，結果為3次實驗的平均值。

實驗結果顯示，由于豬霍亂野毒株C78-3是強毒株，BALB/c小鼠在口服10⁹ CFU的C78-3后的第3d就有大批小鼠死亡，無法將C78-3的定植實驗進行下去，口服C78-3后第3d在小鼠肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結的定植菌量顯著高于rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）的定植菌量（見圖16、17、18，$$，p<0.01）；而疫苗株rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）在口服10⁹ CFU菌量后28d的時間內，小鼠沒有發(fā)生死亡。

在肝臟，rSC0012（pYA3493）株只在攻毒后第3d能分離到，rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分離到，但是rSC0011（pYA3493）株卻是在攻毒后第3-21d都能分離到，并且在接種rSC0011（pYA3493）株后第7-21d，其分離到的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖16，##，p<0.01）；rSC0018（pYA3493）株在第7d的定植菌量也顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖16，**，p<0.01）；表明含有fur缺失的菌株rSC0012的毒力顯著弱于含有crp缺失菌株rSC0011。

在脾臟，rSC0012（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分離到，rSC0018（pYA3493）株只在攻毒后第3 d能分離到，但是rSC0011（pYA3493）株卻是在攻毒后第3-21d分離到,并且在接種rSC0011（pYA3493）株后第3-21d，其分離到的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖17，##，p<0.01）；結果表明，含有fur基因缺失的rSC0012（pYA3493）株對6周齡小鼠脾臟的入侵能力顯著弱于含有crp基因缺失的rSC0011（pYA3493）株，但是強于化學致弱毒株rSC0018（pYA3493）的入侵能力。表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0011（pYA3493）株，強于rSC0018（pYA3493）株。

在腸道派伊爾氏淋巴小結，在攻毒后第3-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力沒有差異；但是在攻毒后第7,21d ,28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都顯著高于化學致弱株rSC0018（pYA3493）株的定植能力（見圖18，**，P<0.01）；表明在腸道派伊爾氏淋巴小結，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力相似；并在感染后期都顯著強于化學致弱株rSC0018（pYA3493）株。

2）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠中的定植能力：

復蘇和擴增菌株方法同豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012在6周齡BALB/c小鼠中的定植能力。

將60只21日齡BALB/c小鼠隨機分成20小組，每小組3只小鼠。5小組用于野毒株C78-3的定植實驗；5小組用于疫苗株rSC0018的定植實驗；5小組用于減毒株rSC0011（pYA3493）的定植實驗；5小組用于減毒株rSC0012（pYA3493）的定植實驗。每只小鼠口服10⁹CFU/20μL（當劑量為10⁹CFU/20μL時，接種rSC0011（pYA3493）組小鼠出現顫抖，被毛粗糙等癥狀）；每菌株分別在接種后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝臟、脾臟和腸道的派伊爾小結（payer s patches），經稱重和無菌研磨，涂布于麥康凱培養(yǎng)基中分離細菌。實驗結果顯示，由于豬霍亂野毒株C78-3是強毒株，BALB/c小鼠在口服10⁹ CFU的C78-3后的第2d就有大批小鼠死亡，無法將C78-3的定植實驗進行下去，口服C78-3后第3d在小鼠肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結的定植菌量顯著高于rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）的定植菌量（見圖19、20、21，$$,p<0.01）；而疫苗株rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）在口服10⁹ CFU菌量后28d的時間內，小鼠沒有發(fā)生死亡。

在肝臟，rSC0012（pYA3493）只在攻毒后第3-7d能分離到； rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-14d分離到；而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的第3-21d都能分離到菌株，且分離的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株（圖19， #，P<0.05;##, P<0.01）；表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0018（pYA3493）株(圖19， **,P<0.01)，更弱于rSC0011（pYA3493）株。

在脾臟，rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株一樣，都只在攻毒后第3d能分離到，二者的分離菌量沒有差異，攻毒后第7-28d就分離不到菌株，而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的3-28d都能分離到菌株，分離的菌量顯著高于rSC0012（pYA3493）株（圖20，##，p<0.01）；表明rSC0011（pYA3493）株對21d小鼠的入侵能力顯著強于rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株。

但是在腸道派伊爾氏淋巴小結中，只在接種后第7d，rSC0011（pYA3493）株的定植能力高于rSC0012（pYA3493）（圖21，#，p<0.05），其余時間段沒有差異；在接種后第14-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都顯著高于rSC0018（pYA3493）株（圖21，**：P< 0.01）；表明在21d的BALB/c小鼠中，含有fur的基因缺失株在21d的小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結的入侵能力與含有crp基因缺失株rSC0011（pYA3493）的侵襲能力相似，無顯著差異。

4、遞呈異源抗原pS-SaoA的減毒豬霍亂沙門氏菌株載體rSC0012的穩(wěn)定性：

挑取經過PCR、雙酶切、測序鑒定完全正確的rSC0012(pS-SaoA)單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)。按培養(yǎng)12h為一代，將菌液按照1:100接種新鮮的LB液體培養(yǎng)基，如此連續(xù)傳至50代。取整10代單菌落進行PCR鑒定，結果顯示有777 bp的SaoA基因的陽性條帶（如圖22所示）。對菌株rSC0012(pS-SaoA)進行抽提質粒，經雙酶切后出現原核表達載體pYA3493和目的基因SaoA的條帶（777 bp）（如圖23所示）。檢測結果表明，pS-SaoA重組質粒能在rSC0012中穩(wěn)定傳代。

四、對攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)進行在BALB/c小鼠中的免疫效果評價：

1、攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周齡BALB/c小鼠的免疫保護性實驗：

為檢測rSC0012和rSC0011、rSC0018在遞送異源抗原誘導免疫原性能力的差異，用6周齡BALB/c小鼠比較了rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)作為豬鏈球菌疫苗抵抗野毒株豬鏈球菌2型（SS2）攻擊的保護性差異。本實驗重復2次，實驗結果為2次結果的綜合。

挑取實驗株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS- SaoA)、rSC0011(pYA3493)和rSC0011(pS-SaoA)于5 mL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)8h，按體積比1:100接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)至菌液的OD₆₀₀值為0.9左右，離心收集菌體，加入PBS重懸沉淀，連續(xù)10倍稀釋。取100μL連續(xù)10倍稀釋至合適的稀釋度并于麥康凱培養(yǎng)基上計數，另外一部分菌液用于免疫小鼠。

用105只雌性6周齡BALB/c小鼠分成7組，每組15只小鼠。其中1組口服PBS作為陰性對照組，另外6組分別口服免疫10⁹CFU/20μL的疫苗株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)菌液。首免后3周加強免疫一次。在加強免疫后7d，每組取5只小鼠撲殺，取小鼠脾臟，肺臟制成勻漿，離心取上清，經雙抗夾心ELISA法檢測上述樣品中抗豬鏈球菌SaoA蛋白的細胞因子的IFN-γ及IL-4含量；在首免后3周、5周，分別從小鼠的頜下靜脈采血，將收集到的血液于4℃過夜制得血清；同時用PBS沖洗陰道，收集陰道黏膜沖洗液。用間接ELISA檢測血清和陰道粘膜沖洗液中抗體效價；最后在加強免疫后2周，用野生型SS2經腹腔注射攻毒，檢測各毒株的免疫保護效率。

結果顯示，除了PBS對照組(control)，首次免疫和加強免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的血清抗體IgG都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（如圖24，**，P＜0.01）；各免疫組的小鼠均產生抗豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗體，且加強免疫后抗體水平顯著增加，各組無明顯差異（如圖25所示）；首次免疫和加強免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（如圖26，**，P＜0.01）；在首免后第3周，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（如圖26，**，P＜0.01），但是到加強免疫后2周，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠和免疫rSC0011(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA沒有區(qū)別（如圖26所示）。

細胞因子檢測結果顯示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫組肺臟和脾臟中細胞因子IFN-γ及IL-4的濃度均顯著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫組（如圖27、28所示，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IFN-γ水平均顯著高于rSC0012(pS-SaoA)（圖27，*，P＜0.05），而rSC0012(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IL-4水平均顯著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫組（圖28，*，P＜0.05；**，P＜0.01），表明含有延遲減毒fur突變比含有延遲減毒的crp突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體能誘導出更好的體液免疫水平應答。

在加強免疫后2周，通過腹腔注射，對實驗鼠進行SS2的攻毒。結果表明，在rSC0011(pS- SaoA)接種組，經5×LD₅₀，或者15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，在攻毒后的96h內，有部分小鼠的皮毛蓬亂，但隨后恢復正常，連續(xù)觀察28天后，實驗小鼠的存活率為100%（見下表：不同攻毒劑量下疫苗對6周齡BABL/C小鼠的保護效率比較表）。在rSC0012(pS-SaoA)接種組，用5×LD₅₀的SS2攻毒后，連續(xù)觀察28d，小鼠表現為健康，存活率為100%；而當用15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率為90%；在rSC0018(pS-SaoA)接種組，用5×LD₅₀的 SS2攻毒后，在攻毒后第3d，有6/20只小鼠死亡，連續(xù)觀察28d，存活率為30%；而當用15×LD₅₀的SS2攻毒后，小鼠精神萎靡，在攻毒后第5d，所有小鼠死亡，小鼠存活率為0%；而空載體組rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）、rSC0018（pYA3493）以及PBS對照組，在攻毒后96小時內所有小鼠死亡。結果表明（見表4），rSC0012(pS-SaoA)加強免疫后能誘導小鼠產生更高的體液免疫應答（IL-4）。

不同攻毒劑量下疫苗對6周齡BABL/C小鼠的保護效率比較表：

**：與PBS免疫組和空載體免疫組的比較，差異顯著。

2、攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠的免疫保護性實驗：

為檢測rSC0012、rSC0011和rSC0018遞送豬鏈球菌SaoA蛋白在幼鼠體內誘導免疫原性的差異，本實施比較了用rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)株在21d小鼠中的免疫應答。本實驗重復2次，實驗結果為2次結果的綜合。

具體實施方法同攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周齡BALB/c小鼠的免疫保護性實驗，區(qū)別是實驗動物使用21日齡的BALB/c小鼠。結果顯示，除了PBS對照組（control），首次免疫和加強免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的血清抗體IgG都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（圖29，*，P＜0.05；**，P＜0.01）,并且首免后rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的血清抗體IgG顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（圖29，*，P＜0.05）；各免疫組的小鼠均產生抗豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗體，且加強免疫后抗體水平顯著增加，各組無明顯差異（圖30）；首次免疫和加強免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（圖31，**，P＜0.01）；首次免疫和加強免疫后，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA均顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（圖31，**，P＜0.01），表明在21d BALB/c小鼠中，缺失fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒株比缺失crp基因的減毒株能誘導出更強大的黏膜免疫應答。

細胞因子檢測結果顯示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫組肺臟和脾臟中細胞因子IFN-γ及IL-4的濃度均顯著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫組（如圖32、33，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IFN-γ水平均與免疫rSC0012(pS-SaoA)組沒有顯著差異（見圖32），而rSC0012(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IL-4水平均顯著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫組（圖33，**，P＜0.01），表明在21d小鼠中，含有延遲減毒fur突變比含有延遲減毒的crp突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體能誘導出更好的體液免疫水平應答。

在加強免疫后2周，通過腹腔注射，對實驗鼠進行SS2的攻毒。結果表明，在rSC0011(pS-SaoA)接種組，經10×LD₅₀，或者15×LD₅₀的SS2菌攻毒后，在攻毒后的96h內，有部分小鼠的皮毛蓬亂，但隨后恢復正常，連續(xù)觀察28天后，實驗小鼠的存活率為100%（見下表：不同攻毒劑量下疫苗對21日齡BABL/C小鼠的保護效率對比表）。在rSC0012(pS-SaoA)接種組，用10×LD₅₀的SS2攻毒后，連續(xù)觀察28d，小鼠表現為健康，存活率為100%；而當用15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率為90%；而空載體組rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）試驗以及空白對照組在攻毒后96小時內所有小鼠死亡。結果表明，在用10×LD₅₀劑量的SS2攻毒后，免疫rSC0012(pS-SaoA)與rSC0011(pS-SaoA)提供的保護效率相同；當加大SS2的攻毒劑量后，免疫rSC0012(pS-SaoA)提供的保護效率要稍低于rSC0011(pS-SaoA) 提供的保護效率，但是二者沒有顯著差異。

不同攻毒劑量下疫苗對21日齡BABL/C小鼠的保護效率對比表：

**：與PBS免疫組和空載體免疫組的比較，差異顯著。

綜上所述，本申請利用延遲減毒豬霍亂沙門氏菌的毒力基因fur的方法，成功地獲得了一株豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012（C78-3 ΔmanA ΔrelA::araC P_BAD lacI TTΔP_fur33::TT araC P_BAD fur ΔasdA）。動物實驗證明，本申請的減毒菌株rSC0012在BALB/c小鼠上的LD₅₀比減毒菌株rSC0011（ΔmanA，ΔP_crp::TT araCP_BADcrp，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔasdA）要低7.9倍，比現有的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗標準株低4.2倍，而比野生型菌株 C78-3低5×10⁵倍；結果表明，在相同基因背景的減毒菌株下，fur延遲缺失的菌株要比crp延遲缺失的菌株毒力低7.9倍。在6周齡BALB/c小鼠的定植實驗結果顯示，在接種菌株后28d，rSC0012株在派伊爾氏淋巴小結中的定植能力與減毒株rSC0011株的定植能力沒有顯著差異；而在21d BALB/c小鼠的定植實驗結果顯示，在接種菌株后7d，rSC0012株在派伊爾淋巴小結中的定植能力比減毒株rSC0011株低6倍，在肝臟和脾臟中細菌清除的時間顯著提前到接種第7d，相反在接種菌株21d，接種rSC0011株的6周齡和21d BALB/c小鼠的肝臟和脾臟中都可以分離到沙門氏菌；證明阿拉伯糖調控的fur基因缺失的毒株的毒力顯著低于阿拉伯糖調控的crp基因缺失的毒株的毒力。動物保護性實驗結果顯示，攜帶豬鏈球菌2型SaoA蛋白的fur基因缺失減毒株rSC0012(pS-SaoA)株在6周齡21d的的BALB/c小鼠的肺臟和脾臟中，能誘導出更好的體液免疫應答水平，同時能獲得很高的保護效率。

<110> 揚州大學

<120> 一種基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌及其構建方法

<160> 15

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcgagctcg tgtaaatctt tcgaagagcc aa

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagctcgaga gtcatgcgga atctgtcctg

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcccccgggc acttttccgc aatcaaggca g

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctggtacct aggcctctag ataaataaaa gcagtttaca actcctagaa ttgt

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaggtaccc tcgaggctag cccaaaaaaa cggg

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggagctcc gctggtagtt ttgataactt aa

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggggtacct acggcgacgg acacatgttc gct

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaagcttg agctcgaggg cgttccggcg ctggtagaa

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggtacccc agatattttc cagatcttca c

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcccccgggc acttttccgc aatcaaggca g

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgctctagat gtgcatggca atcgcccaac

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcccccgggt atctgcgtcg tcctaccttc

<210> 15

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工合成的SaoA片段

<400> 15