專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種提高動(dòng)物繁殖力的抑制素dna疫苗及制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物抑制素DM疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用，特別是涉及一種無(wú)抗生素基因殘留的提高動(dòng)物繁殖力的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抑制素(inhibin—INH)是由卵巢分泌的糖蛋白質(zhì)激素，能抑制垂體促卵泡素(FSH)的分泌，對(duì)于卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)具有重要作用。許多實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用INH主動(dòng)或被動(dòng)免疫動(dòng)物，均能促進(jìn)卵泡發(fā)育、誘導(dǎo)多排卵、提高產(chǎn)仔數(shù)，并能誘導(dǎo)單胎動(dòng)物孿生(MedanMS，等.Theeffectofactiveimmunizationagainstinhibinongonadotropinsecretionsandfolliculardynamicsduringtheestrouscycleincows.JReprodDev.2006，52(1):107-13;MedanMS等.EffectofactiveimmunizationagainstinhibinonhormonalconcentrationsandsemencharacteristicsinShibabucks.Theriogenology-2006,65(4):691-702;MedanMS等.Passivei鵬uno-neutralizationofendogenousinhibinincreasesovulationrateinminiatureShibagoats.JR印rodDev.2004,50(6〉705-10)。眾所周知免疫原制備很困難對(duì)于天然的免疫原，目前仍存在分離純化困難的問(wèn)題；人工合成或重組的抑制素免疫原存在工作量大，成本高的難題。為解決這些困難，申請(qǐng)人自1998年開(kāi)始，開(kāi)始了抑制素DNA疫苗的研究，先后構(gòu)建了7種I朋真核表達(dá)質(zhì)粒，并比較了各種疫苗的免疫效果和安全性(姜?jiǎng)灼剑?抑制素基因免疫對(duì)小鼠生殖的影響.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22(4):368-9;茆達(dá)干，等.抑制素a(1-32)基因免疫對(duì)大鼠卵泡發(fā)育和生殖激素的影響..中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003,36(12):1554-9:張德坤，等.抑制素基因免疫誘導(dǎo)單胎綿羊?qū)\生的研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，9(4):40-5參考文獻(xiàn))。但是，由于以前構(gòu)建的抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒(pCIS)中①含有卡那霉素基因或氨芐青霉素基因等抗性基因；②克隆后的質(zhì)粒DNA必須提取、純化才能用于免疫，提純的成本很高；③免疫途徑局限于肌肉注射，使用不太方便，只能用于實(shí)驗(yàn)研究，而不能用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。針對(duì)卵泡抑制素(INH)基因免疫和其他基因疫苗研究中存在的共性問(wèn)題，本項(xiàng)目利用天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因(asd)-減毒沙門(mén)氏菌載體-宿主平衡致死系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)平衡致死系統(tǒng))替換現(xiàn)有抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒中的抗性基因，構(gòu)建不含抗性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒得到一種新型抑制素咖A疫苗。本發(fā)明對(duì)于提高卵泡抑制素基因免疫的安全性和效果，降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化使用程序等，均具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務(wù)在于克服5見(jiàn)有技術(shù)的缺陷，研制一種提高動(dòng)物繁殖力的無(wú)抗生素基因殘留的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。本發(fā)明的目的還包括獲得一種無(wú)抗性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒和將上述DNA疫苗應(yīng)用于動(dòng)物(小鼠)上，以提高其繁殖力，其中包含產(chǎn)仔數(shù)'泌乳力以及仔鼠成活率等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的提高。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的申請(qǐng)人通過(guò)制備，獲得了一株含有抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PXAIS的豬霍亂沙門(mén)氏菌(5a/mweLae加erj'casv.OoJe2-ses"i59C500/pXAIS'該菌株于加08年10月30日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCCNO:M208195。申請(qǐng)人:利用上述保藏的菌株直接生產(chǎn)出豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，表達(dá)豬抑制素融合基因IS的表達(dá)質(zhì)粒pXAIS是這樣構(gòu)建的首先將質(zhì)粒pVAXl用pWII內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從質(zhì)粒PYA3493中擴(kuò)增得到天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質(zhì)粒中，得到不含卡那霉素的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pYAX—asd,將抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再將該融合基因插入到真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-asd中，得到抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS。申請(qǐng)人建立一種提高動(dòng)物繁殖力的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗的制備方法，其步驟如下(1)將質(zhì)粒pVAXl用pVUII內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從質(zhì)粒PYA3493中擴(kuò)增得到天冬氨酸P-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質(zhì)粒中，得到不含卡那霉素的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd;(2)將抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，將該融合基因插入到真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVM—asd中，得到抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS;(3)用抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門(mén)氏菌C500，得到保藏號(hào)為CCTCCNO:M208195豬霍亂沙門(mén)氏菌(5a^o"e/7ae/JfericaC力o7eraesu/s^C500/pXAIS;(4)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟(3)的豬霍亂沙門(mén)氏菌，得到豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式》。本發(fā)明的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗不含卡那霉素基因，在應(yīng)用上比現(xiàn)有的抑制素DNA疫苗具有更好的安全性，其制備工藝簡(jiǎn)單，不需要經(jīng)過(guò)純化等制備步驟。圖l:是本發(fā)明所克隆的天冬氨酸半乳糖脫氫酶基因(asd)的基因片段的擴(kuò)增圖譜，圖中M:250bp的DNAmarker;l—4:以PYA3493為模板用asd的primers擴(kuò)增得到的目的片段；5:以水為模板用asd的primers擴(kuò)增得到的結(jié)果。圖2:是真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd酶切鑒定圖譜，圖中M:250bp的DNAmarker;1:真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd通過(guò)pVUII進(jìn)行酶切的結(jié)果。圖3:是本發(fā)明抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS的構(gòu)建圖譜。圖4:是抑制素融合基因IS回收后的圖譜lanel—5:從抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒PCIS上用Me/和ffi/w!Z7/進(jìn)行雙酶切回收后的結(jié)果；M:250bp的DNAmarker。圖5:是抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS酶切鑒定圖譜M:250bp的DMmarker;1:pXAIS通過(guò)MeJ和ffi"^JJJ雙酶切得到的結(jié)果。圖6:添加抗生素對(duì)以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的影響圖左側(cè)為在添加卡那霉素抗生素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗；圖右側(cè)為在不添加任何抗生素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗。圖7:是抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PXAIS在PK15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過(guò)RT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果泳道l:無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞；泳道2:真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd轉(zhuǎn)染后RT-PCR結(jié)果；泳道3-5:抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PXAIS轉(zhuǎn)染后的RT-PCR結(jié)果。圖8:是抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS在PK15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的蛋白表達(dá)間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖8A:抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS在PK15細(xì)胞中表達(dá)情況檢測(cè)有熒光，顯示該融合蛋白有免疫活性；圖8B:真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd在PK15細(xì)胞中表達(dá)情況檢測(cè)無(wú)熒光；圖8C:無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢測(cè)為無(wú)熒光(空白對(duì)照)。圖9:昆明鼠免疫后不同時(shí)間的抗抑制素IgG抗體滴度檢測(cè)免疫后兩周試驗(yàn)組的IgG抗體水平明顯高于其他對(duì)照組，而在加強(qiáng)免疫后抗體水平?jīng)]有顯著差異。圖10:是昆明鼠免疫后不同時(shí)間段的抗抑制素IgG分型抗體水平檢測(cè)免疫后兩周試驗(yàn)組的IgGl和IgG2a的抗體水平均高丁其他免疫組的，且lgG2a的0D值高于IgGl，而在4、6周兩種分型的OD值幾乎無(wú)差異。具體實(shí)施方式實(shí)施例1真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd的構(gòu)建1、天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因(asd)基因克隆及序列分析采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GenBank(AF015781)登錄的沙門(mén)氏菌asd基因序列，設(shè)計(jì)了引物對(duì)(正向引物PIATGCAGCTGGCACATCTCTTTGCAGG;反向引物P2TTACAGCTGCTACGCCMCTGGCGCA)，以PYA3493質(zhì)粒(KangHY等,I咖imeresponsestorecombinantpneumococcalPspAantigendeliveredbyliveattenuatedSalmonellaentericaserovartyphimuriumvaccine.InfectImmuti,2002,70(4):1739-49.)為模板，通過(guò)PCR方法克隆鼠傷寒沙門(mén)氏菌的asd基因片段。鼠傷寒沙門(mén)氏菌與豬霍亂沙門(mén)氏菌的asd基因同源性為100%，其cDNA開(kāi)放閱讀框?yàn)?107bp，編碼368個(gè)氨基酸。以PYA3493質(zhì)粒為模板，對(duì)asd基因片段盡行擴(kuò)增；反應(yīng)總體積20HL，其中含MgCl2(購(gòu)自Toyobo公司)2uL引物(lOpmol/iiL上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)各0.5uLdNTPMixture(各lOmM,購(gòu)自Toyobo公司)1ixLTaq酶(40U/PL，購(gòu)自Toyobo公司)0.5uL模板0.5uL10XTaq緩沖液(購(gòu)自Toyobo公司)1nL雙蒸水使反應(yīng)總體積20uL。按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94'C變性4min，然后94。C變性lrain、60°。退火45sec、"72。C延伸1min，35個(gè)循環(huán)后72'C再延伸7min。最后，將PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，觀察電泳結(jié)果。(見(jiàn)圖1)2、酶切和連接用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)，參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收和純化。純化后的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載體PVAX分別用"K"http://內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切體系10XH緩沖液(購(gòu)自Toyobo公司)5uLasd(或pVAX)20uLp吸Z7(購(gòu)自Toyobo公司)為2nL雙蒸水至總體積50uL，37°C，反應(yīng)3-5h,酶切后用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離回收1107bp的asd目的片段和2640bp的pVAX片段。然后按如下體系進(jìn)行連接反應(yīng)，連接目的片段和載體，連接體系為10Xligase緩沖艱(購(gòu)自Toyobo公司)2jiLssd6"pVAX2uLT4DNA連接酶(購(gòu)自Toyobo公司)1nL雙蒸水至總體積20yL，16。C過(guò)夜。連接產(chǎn)物-2(TC保存，備用。3、感受態(tài)細(xì)菌的制備和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌1)采用常規(guī)的CaCl2法(J,薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版，北京科學(xué)出版杜，2002)制備新鮮感受態(tài)細(xì)菌大腸桿菌6097(NakayamaK等，ConstructionofanAsd+expression-cloningvector:stablemaintenanceandhighlevelexpressionofclonedgenesinaSalmonellavaccinestrain.Bio/Technology1988.6:693-697)。具體步驟如下(1)從含二氨基庚二酸MP(DAP終濃度為50ug/mL)的LB平板上(1LLB固體培養(yǎng)基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，15g瓊脂粉，PH7.0)挑取新活化的缺失asd基因的fsc力e2"ic力j'acWi單菌落，接種于10mLLB液體培養(yǎng)基中(DAP終濃度為50ug/mL)(1LLB液體培養(yǎng)基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，pH7.0),37'C下振蕩培養(yǎng)12h左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期即0D6。。>0.5時(shí)。將該菌懸液以1:100(體積比)接種于100mLLB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2.5h至0DM。=0.5左右。(2)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置lOmin,然后于4'C下3000g離心lOmin。(3)去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置30min后，4'C下3000g離心lOmin。(4)棄去上清,加入4mL預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置lOmin,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。(5)將感受態(tài)細(xì)胞分裝成100ixL的小份,可以立刻用于轉(zhuǎn)化，或者將其貯存于-70'C下，備用。2)用熱休克法(J.薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版，北京科學(xué)出版社,2002)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，步驟如下(1)從-7(TC冰箱中取100wL感受態(tài)細(xì)胞懸液,置于冰上融解。(2)加入連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕搖勻，冰上放置30min后。(3)42'C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3min。(4)向管中加入400uLLB液體培養(yǎng)基，混勻后37。C振蕩培養(yǎng)lh,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)DNA編碼的氨芐抗生素抗性基因。(5)將上述菌液搖勻后取100ul涂布于不含DAP(DAP終濃度為50ug/mL)的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37'C培養(yǎng)16-24h。4、陽(yáng)性克隆的篩選、鑒定與測(cè)序從上述(5)的平板中挑取陽(yáng)性克隆，接種于不含DAP的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)抽提質(zhì)粒(參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)〉，/^〃//酶切，酶切體系為10XH緩沖液(購(gòu)自Toyobo公司)1.6uL，提取的重組質(zhì)粒9uL,p吸Z7為0.8uL，力卩ddH20至總體積16uL,37'C，反應(yīng)2-3h，觀察酶切結(jié)果，電泳條帶與目的條帶大小相符，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。獲得真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd。(見(jiàn)圖2)實(shí)施例2抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS的構(gòu)建(見(jiàn)圖3)1、真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd提取與純化從LB平板上挑取新活化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd單菌落，接種至lOmLLB液體培養(yǎng)基中，37'C、240rpra培養(yǎng)過(guò)夜，按體積比1:250的比例稀釋到適當(dāng)體積LB中，繼續(xù)培養(yǎng)12h，離心收集菌體，抽提純化真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd。2、抑制素融合基因片段制備采用本申請(qǐng)人以前構(gòu)建的抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒PCIS(HanL等，DevelopmentandevaluationofanovelDNAvaccineexpressinginhibinalpha(1-32)fragmentforimprovingthefertilityinratsandshe印.Animalreproductionscience,2008，109(1-4):251-65)通過(guò)Afteif卩A7"oT77雙酶切可以得到858bp的抑制素與乙肝表面抗原(Davis等，DM-basedimmunizationforHepatitisBinducescontinuoussecretion269ofantigenandhighlevelsofcirculatingantibody,Hum.Mol.Genet.1993(2):1847-1851)融合基因片段IS(見(jiàn)圖4)。3、抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒的連接將純化、回收得到的抑制素融合基因片段IS和真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd分別按如下體系進(jìn)行池e/J和ffi/K/JJ/雙酶切。反應(yīng)體系為10XH緩沖液(購(gòu)自Toyobo公司)5uL、IS15uL(或真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd20uL)、順e//和^//^///分別為1.5uL、加雙蒸水至總體積50uL，37°C,反應(yīng)3-5h，酶切后，用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離回收858bp的抑制素融合基因片段IS和3780bp的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd大片段。然后按如下體系進(jìn)行連接反應(yīng)10X連接緩沖液(購(gòu)自Toyobo公司)2uL、IS6uL、真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd大片段3"L、T4DNA連接酶(購(gòu)自Toyobo公司)1wL、加雙蒸水至總體積20uL,4°C過(guò)夜。4、參照通用的甘油法(J.薩姆布魯克，D.W.拉賽爾，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版，北京科學(xué)出版杜，2002)制備新鮮感受態(tài)豬霍亂沙門(mén)氏菌C500，具體步驟如下1)將豬霍亂沙門(mén)氏菌C500置于LB培養(yǎng)基上，在37'C下過(guò)夜培養(yǎng)；2)將過(guò)夜培養(yǎng)液按1:100體積比接種50ralLB液體培養(yǎng)基；3)37°C下200r/min培養(yǎng)至OD6。。達(dá)0.3-0.4，一般需要2.5-3小時(shí);4)細(xì)胞在4。C5000g下離心15分鐘，棄上清液；5)用預(yù)冷的50ml去離子水輕輕懸浮菌體；6)重復(fù)上步驟2次，去離子水體積分別為25ml和12.5ml;7)細(xì)胞在4°C5000g下離心15分鐘，棄上清液收集菌體；8)用50ml滅菌的、冰冷后的10%甘油輕輕懸浮細(xì)胞；9)細(xì)胞在4。C5000g下離心15分鐘，棄上清液；10)照上面步驟重復(fù)三次，10%甘油體積分別為50,25,12.5ml;11)最后于4°C7500r/min離心15rain收獲細(xì)胞；11)沉淀細(xì)胞中加入0.25ml冰預(yù)冷的10%甘油重懸；12)將細(xì)胞按40ul等份裝入微量離心管，于-80'C保存?zhèn)溆谩?、將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入豬霍亂沙門(mén)氏菌的感受態(tài)細(xì)胞，方法如下1)在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞，冰上培育約5分鐘；2)添加10lil連接產(chǎn)物，冰上培育約5分鐘；3)轉(zhuǎn)移混合物至冷卻后的電轉(zhuǎn)杯中；4)對(duì)電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行脈沖，時(shí)間4秒(脈沖電阻200Q，電容25uFd，電壓2.0千伏)；5)立即添加1000u1的SOC培養(yǎng)基(蛋白胨20g，酵母提取物5g,氯化鈉0.5g,1mol/L氯化鉀2.5tnl，溶于1L水中高壓滅菌，只是在培養(yǎng)基冷卻到室溫后，除了加10ml滅過(guò)菌的lnrol/L氯化鎂外，再加20ml滅菌的lmol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足夠水中，再用水補(bǔ)足到100ml，用0.22um的濾膜過(guò)濾除菌)。6)37°C下培養(yǎng)1小時(shí)以復(fù)原；7)轉(zhuǎn)移細(xì)胞至相應(yīng)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。6、抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒(pXAIS)和以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的篩選和鑒定挑取陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DM,迸行酶切鑒定，分別用Nhel和Hi/riin、雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切體系為10XHbuffer2wL、提取的重組質(zhì)粒9"L、N力el和Hi/jdlII分別為0.5uL、加ddH20至總體積20wL,37°C,反應(yīng)3-5h，1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳條帶與目的條帶大小相符(見(jiàn)圖5)，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到鑒定正確的抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS和以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗。7、以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗的卡那霉素抗性檢測(cè)將篩選鑒定正確的豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗分別進(jìn)行添加和不添加卡那霉素培養(yǎng)，結(jié)果顯示，添加了卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中的豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗沒(méi)有生長(zhǎng)，而沒(méi)有添加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中的豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗則正常生長(zhǎng)(見(jiàn)圖6)。實(shí)施例4:抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS質(zhì)粒在體外蛋白表達(dá)的檢測(cè)1、抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)染細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)抽提質(zhì)粒，待PK15細(xì)胞(野豬正常腎臟的細(xì)胞)單層長(zhǎng)至60%-70%時(shí)按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞48h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞。按照Trizol(購(gòu)自Invitrogen公司)使用說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞的mRM'反轉(zhuǎn)錄獲得cDM,根據(jù)抑制素引物進(jìn)行擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用INHprimers(INHP1:TGCTGGATATCTGCAGAATTCCCT，INHP2:CTTCTCGAGATCTGTGGCAGTCGG。這引物是由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)進(jìn)行INH目的片段的擴(kuò)增。經(jīng)r/6瓊脂糖電泳檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)一條858bp左右的片段(見(jiàn)圖7),經(jīng)上海生丄生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定該片段為抑制素目的片段，片段全長(zhǎng)為858bp。2、抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS體外表達(dá)的檢測(cè)將待檢測(cè)細(xì)胞(瞬吋轉(zhuǎn)染細(xì)胞)用PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶于800ml蒸餾水中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可)洗滌3次，100%甲醇室溫固定10min,PBS緩沖液洗滌3次，用含10%牛血清的PBS封閉30min，然后依次分別與鼠抑制素單克隆抗體(購(gòu)自Thermo公司，貨號(hào)為MS-1863-S0)和FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(購(gòu)自武漢博士得生物工程有限公司)37'C作用各30rain,其間用PBS緩沖液洗滌，與二抗反應(yīng)后在用PBS緩沖液洗滌3次，直接于熒光顯微鏡下鏡檢(型號(hào)Olympus，1X70)。抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS在轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞48h后，通過(guò)間接免疫熒光方法檢測(cè)質(zhì)粒是否在真核細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明PBS緩沖液及真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd質(zhì)粒轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞用抑制素抗體檢測(cè)后通過(guò)熒光顯微鏡沒(méi)有發(fā)現(xiàn)綠色熒光，而抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)綠色熒光(見(jiàn)圖8)。這結(jié)果表明抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后表達(dá)的融合蛋白具有抑制素免疫活性。3、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性包被待測(cè)樣每孔100nL,用PH9.6,0.05M碳酸鹽包被緩沖(Na2C031.59克，NaHC(h2.93克，加蒸餾水至1000ral)液稀釋的抑制素抗原濃度為100ng/100uL包被作陽(yáng)性對(duì)照，4匯過(guò)夜；自動(dòng)洗板機(jī)上用PBST緩沖液(KH2P04-0.2克，Na2HP04■12H20-2.9克，NaCl-8.0克，KC1-0.2克，TVeen-200.05%_0.5ml，加蒸餾水至1000ml)洗6次，然后每孔加封閉液(牛血清白蛋白-BSA0.1克加洗滌緩沖液至100ml)200uL,37'C反應(yīng)lh;洗滌，加鼠抑制素單克隆抗體100uL，37'C反應(yīng)lh;洗滌，加兔抗鼠IgG-HRP(1:5000,購(gòu)自武漢博士德公司)100ul/孔，反應(yīng)l小時(shí)；洗滌，加入150uLT肥底物液(0.2MNa2HP0-(28.4g/L)25.7ml，0.1M檸檬酸(19.2g/L)24.3ml，加蒸餾水50ml即為100ml的底物緩沖液；0.75%TMB即稱(chēng)取37.5呢溶于5ral無(wú)水乙醇；A液:0.75mlTMB0.75%+6.75ralddH20—7.5ml;B液:7.5ral底物緩沖液+45ul過(guò)氧化脲一7.5ral)顯色，37。C反應(yīng)25分鐘；力[]50uL2raol/L1^04終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測(cè)0D站。值。收集抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PXAIS轉(zhuǎn)染48h后的PK15細(xì)胞制備待測(cè)樣，包被待測(cè)樣每孔100UL，包被抑制素100ng/100uL作陽(yáng)性對(duì)照，OD咖值PBS〈抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS〈抑制素抗原100ng,抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS與抑制素抗原所測(cè)得的OD值差異較小，且大于PBS及真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX—asd對(duì)照組2倍以上，提示抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS均具有抑制素的免疫學(xué)活性(表1)。表l轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過(guò)ELISA方法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況的OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例4本發(fā)明在昆明鼠上對(duì)其繁殖性能以及免疫應(yīng)答的影響1、疫苗制備-以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素DNA疫苗和豬霍亂沙門(mén)氏菌C500空菌分別接種LB液體培養(yǎng)基中，于37。C、150rpm振搖培養(yǎng)至0D咖0.3-0.4，4°C、1500g離心10min,棄上清，用滅菌的PBS緩沖液調(diào)整細(xì)菌濃度至10"CFU/mL，得到試驗(yàn)的備用疫苗。2、試驗(yàn)動(dòng)物免疫試驗(yàn)選50日齡的昆明小鼠共45只，分為3組，每組15只，購(gòu)自湖北省疾病控制中心提供，在本申請(qǐng)人所在的動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一周后進(jìn)入試驗(yàn)，各組試驗(yàn)小鼠年齡和體重基本一致。這三組分別為試驗(yàn)組T1(口服以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗)，豬霍亂沙門(mén)氏菌C500空菌對(duì)照組T2(口服豬霍亂沙門(mén)氏菌C500〉，PBS對(duì)照組T3(只口服PBS緩沖液)；在發(fā)情期放入公鼠進(jìn)行交配，直至產(chǎn)仔，觀察其產(chǎn)仔數(shù)，泌乳力，仔鼠成活率的變化T12，T22，T32在加強(qiáng)免疫一次后上組進(jìn)行相同處理T13,T23,T33在加強(qiáng)免疫二次后進(jìn)行相同處理。3、免疫方法受免疫的動(dòng)物(50日齡性成熟昆明小鼠)免疫前12小時(shí)禁食，免前4小時(shí)禁水，免疫前30分鐘，預(yù)先口服7.5^的NaHC03(200uL/頭)以中和胃酸，免疫劑量為1X1(TCFU/頭。每個(gè)試驗(yàn)組中的三個(gè)小組分別免疫不同次數(shù)，一組一免，兩外兩組初次免疫后2周以相同劑量、相同方法加強(qiáng)免疫一次，同樣，最后一組以相同劑量、相同方法加強(qiáng)免疫一次。4、飼養(yǎng)管理試驗(yàn)用昆明小鼠為每5只/籠，室內(nèi)溫度一直保持在28度左右。試驗(yàn)期期內(nèi)動(dòng)物房一直保持清潔、衛(wèi)生，及時(shí)清除舍內(nèi)糞尿，保持舍內(nèi)干燥。5、血漿制備以初次免疫為0周，分別在第0、2、4、6、8周進(jìn)行尾靜脈采取血樣，肝素鈉抗凝，制備血漿，-20°C保存，用以抗體的檢測(cè)(參照楊利國(guó)等，酶免疫測(cè)定技術(shù)M南京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，南京，1998:138-139)。6、測(cè)定指標(biāo)(1)小鼠產(chǎn)仔數(shù)，泌乳力，以及仔鼠成活率記錄每個(gè)試驗(yàn)組小鼠產(chǎn)仔數(shù)，泌乳力，以及仔鼠成活率。以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗對(duì)昆明小鼠繁殖性能的影響如表2所述，本發(fā)明Tl組試驗(yàn)鼠平均產(chǎn)仔數(shù)，泌乳力均高于空菌組和對(duì)照組，但是在試驗(yàn)組與各對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。(2)抑制素抗體檢測(cè)采用間接ELISA方法檢測(cè)血漿中抑制素抗體。步驟如下包被抑制素抗原每孔100ng/100pL，4'C反應(yīng)12h,棄反應(yīng)液，于自動(dòng)洗板機(jī)上洗滌6次，每次30秒；加封閉液(5%的脫脂牛奶溶液)200nL/孔，37'C反應(yīng)1.5h,棄反應(yīng)液，洗滌6次'每次30秒；將昆明小鼠血漿依次稀釋l:2,1:4，1:5，1-10,1:20，1:40,1:50，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔，每個(gè)樣本三個(gè)重復(fù)，37。C反應(yīng)lh，棄反應(yīng)液，洗滌6次'每次30秒；加羊抗鼠IgG-朋P1:5000稀釋(購(gòu)自武漢博士德公司)，每孔100uL，37。C反應(yīng)lh,棄反應(yīng)液，洗滌6次'每次30秒；加TMB底物液，每孔150uL，37'C反應(yīng)25min;加2mol/L硫酸終止反應(yīng)，每孔50uL;OD450讀數(shù)。以P/N值》2判為最高抗體滴度，其中P為待測(cè)血樣的吸光值，N為陰性對(duì)照血樣吸光值，結(jié)果見(jiàn)表3和圖9。本發(fā)明的以豬霍亂沙門(mén)氏菌C500為載體的抑制素口服基因疫苗笫一次口服免疫后的第2周抑制素抗體滴度值就達(dá)高峰，且一免后試驗(yàn)組高于其它各組(P<0.05)，隨后各組的抗體滴度值都有所下降，但試驗(yàn)組均高于對(duì)照組(P〉0.05)。表3:本發(fā)明制備的口服DNA疫苗昆明小鼠血漿中抑制素的抗體滴度免疫次數(shù)\分組試驗(yàn)組T1空菌組T2PBS對(duì)照組一免后50±025±015±0二免后25±028.33±1.6718.33±1.67三免后13.33±0.834.17±0.8311.67±0.83(3)抗體水平分型檢測(cè)分型檢測(cè)與測(cè)定抗體的方法相同，只是在加入二抗時(shí)用羊抗小鼠IgGl-冊(cè)P和lgG2a-朋P替代羊抗小鼠lgG-HRP進(jìn)行免疫血清抗體IgGl和lgG2a的分型檢測(cè)?？贵w分型檢測(cè)顯示免疫后兩周IgG2a測(cè)定的0D值高于IgGl，而在加強(qiáng)免疫后兩種分型的OD值無(wú)顯著差異。結(jié)果見(jiàn)圖IO。表2免疫后昆明鼠繁殖力的比較(均值士方差,n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注在水平上比較，顯著水平pO.05用完全不同的字母顯示，而iX).05則用相同的字母表示200810197980.3轉(zhuǎn)溢齒被10/105t權(quán)利要求1、一株含有抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS的豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonellaentericasv.Choleraesuis)C500/pXAIS，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNOM208195。2、由權(quán)利要求1所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌制備的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。3、一種表達(dá)豬抑制素融合基因IS的表達(dá)質(zhì)粒pXAIS，其特征在于，將質(zhì)粒pVAXl用pVUII內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從質(zhì)粒PYA3493中擴(kuò)增得到天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質(zhì)粒中，得到不含卡那霉素的pVAX—asd質(zhì)粒，將抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再將該融合基因插入到pVAX一asd質(zhì)粒中，得到抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS。4、一種提高動(dòng)物繁殖力的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗的制備方法，其特征在于-(1)將質(zhì)粒pVAXl用pVUII內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從質(zhì)粒PYA3493中擴(kuò)增得到天冬氨酸e-半乳糖脫氫酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl質(zhì)粒中，得到不含卡那霉素的pVAX—asd質(zhì)粒；(2)將抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，將該融合基因插入到pVAX—asd質(zhì)粒中，得到抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS;(3)用質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門(mén)氏菌C500，得到保藏號(hào)為CCTCCNO:M208195豬霍舌L沙門(mén)氏菌(^5k/頂o"eJ7ae"ter/casr.C力o/erae5tA2.5^C500/pXAIS;(4)擴(kuò)大培養(yǎng)步驟(3)的豬霍亂沙門(mén)氏菌，得到豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。5、權(quán)利要求1所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌在制備提高動(dòng)物繁殖力的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種無(wú)抗生素基因殘留的提高動(dòng)物繁殖力的豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗及制備與應(yīng)用。將豬抑制素α(1-32)基因與乙肝表面抗原融和基因插入到缺失了卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體pVAX1中，得到抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS，將抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒pXAIS轉(zhuǎn)染入豬霍亂沙門(mén)氏菌C500中，構(gòu)建了豬霍亂沙門(mén)氏菌抑制素DNA疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本疫苗無(wú)抗生素基因殘留，具有運(yùn)動(dòng)效率高，免疫方法簡(jiǎn)單，免疫效果好。載體菌本身可作為免疫佐劑，能同時(shí)激活粘膜免疫和全身免疫，并可獲得對(duì)載體菌的免疫等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A61K39/00GK101407781SQ200810197980公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年12月1日優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日發(fā)明者楊利國(guó),梁愛(ài)心,王慶玲,甄艷紅,麗韓申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)