背景

細(xì)胞培養(yǎng)基提供了在受控、人工和體外環(huán)境中維持和生長(zhǎng)細(xì)胞所必需的營(yíng)養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)配方(nutrient formulation)、pH和重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)隨參數(shù)例如細(xì)胞類型、細(xì)胞密度和使用的培養(yǎng)系統(tǒng)的變化而變化。

培養(yǎng)基制劑已被用于培養(yǎng)許多細(xì)胞類型，包括動(dòng)物、植物和細(xì)菌細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞具有許多用途，包括用于生理過(guò)程的研究和有用的生物學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生。此類有用的產(chǎn)物的實(shí)例包括多肽，例如單克隆抗體、激素、生長(zhǎng)因子、酶和其它目標(biāo)多肽。此類產(chǎn)物具有許多商業(yè)和治療性應(yīng)用，并且隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造以產(chǎn)生大量的此類產(chǎn)物。培養(yǎng)的細(xì)胞還常規(guī)地用于分離、鑒定和生長(zhǎng)可被用作載體和/或疫苗的病毒。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞的能力不僅對(duì)于細(xì)胞生理學(xué)的研究是重要的，而且對(duì)于否則不能以具有成本效益的方法獲得的有用物質(zhì)的產(chǎn)生是必需的。

細(xì)胞培養(yǎng)基制劑已良好地公開于文獻(xiàn)中，并且許多培養(yǎng)基是商購(gòu)可得的。在早期細(xì)胞培養(yǎng)工作中，培養(yǎng)基制劑基于血液的化學(xué)成分和物理化學(xué)性質(zhì)(例如，重量摩爾滲透壓濃度、pH等)并且被稱為“生理溶液”Ringer,S.,J.Physiol.3:380-393(1980)；Waymouth,C.,In:Cells and Tissues in Culture,第1卷,Academic Press,London,pp.99-142(1965)；Waymouth,C.,InVitro 6:109-127(1970)。然而，在氧/二氧化碳分壓以及營(yíng)養(yǎng)物、維生素和痕量元素的濃度方面，哺乳動(dòng)物身體的不同組織中的細(xì)胞暴露于不同的微環(huán)境，因此，不同細(xì)胞類型的成功體外培養(yǎng)通常需要使用不同的培養(yǎng)基制劑。細(xì)胞培養(yǎng)基的典型組分包括氨基酸、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽、維生素、礦物質(zhì)、痕量金屬、糖、脂質(zhì)和核酸，其類型和量可取決于給定的細(xì)胞或組織類型的具體要求而變化。

谷氨酰胺通常用于細(xì)胞培養(yǎng)基，因?yàn)橐扬@示其為培養(yǎng)的細(xì)胞的主要能量來(lái)源。在1959年，Eagle顯示，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的最佳生長(zhǎng)所必需的谷氨酰胺的量為其它氨基酸的量的3至10倍。Eagle等人,Science 130:432-37(1959)。然而，谷氨酰胺在水溶液中和在升高的溫度下不穩(wěn)定，形成焦谷氨酸鹽和氨，這對(duì)某些細(xì)胞可具有毒性。Roth等人,In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7):696-98(1988)。因此，通常在即將使用時(shí)將谷氨酰胺添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。

或者，為了避免有毒物質(zhì)如焦谷氨酸鹽和氨的形成，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用含谷氨酰胺的二肽(例如丙氨酰-谷氨酰胺或甘氨酰-谷氨酰胺)替代谷氨酰胺Roth等人,In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7):696-98(1988)。還已使用谷氨酸來(lái)替代谷氨酰胺，以減少氨在細(xì)胞培養(yǎng)基中的積累，參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,52,Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor和Francis Group(2006)。

其它人已提出?；睦绫滨９弱０罚允苟脑诩訜釡缇鷹l件下更穩(wěn)定。例如，美國(guó)專利No.5,534,538描述了用于腸道或胃腸外營(yíng)養(yǎng)的N-?；?，其中N-?；脑诩訜釡缇鷹l件下比相應(yīng)的非?；亩母€(wěn)定，并且其中N-?；欣卦谄涞竭_(dá)腎臟之前延遲了二肽的斷裂。美國(guó)專利No.5,534,538還發(fā)現(xiàn)，N-酰基丙氨酰谷酰胺是用于細(xì)胞培養(yǎng)基的適當(dāng)?shù)墓劝滨０穪?lái)源，與相應(yīng)的非?；亩?丙氨酰谷酰胺)相似，其為細(xì)胞培養(yǎng)基的已知組分(參見上文Roth等人)。美國(guó)專利No.5,534,538還描述，N-?；膬?yōu)于游離二肽，這至少部分因?yàn)镹-?；脑诩訜釡缇鷹l件下的增強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，美國(guó)專利No.5,534,538實(shí)際上教導(dǎo)，不要使用其中N-末端氨基酸具有游離氨基的二肽。

本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，某些氨基酸如酪氨酸在用以獲得最大細(xì)胞生長(zhǎng)或蛋白質(zhì)產(chǎn)量所期望的濃度上具有有限的溶解度。本申請(qǐng)人還已發(fā)現(xiàn)，其它氨基酸如半胱氨酸在含水細(xì)胞培養(yǎng)基中，特別地在濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不穩(wěn)定的并且易于隨時(shí)間過(guò)去發(fā)生沉淀。特別地，因?yàn)榘腚装彼峋哂辛蚧?，因此其易于進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，其中兩個(gè)半胱氨酸殘基通過(guò)二硫鍵連接在一起形成胱氨酸(SCH₂CH(NH₂)CO₂H)₂。胱氨酸在水中具有低溶解度并且易于從溶液中沉淀出來(lái)。因此，一直以來(lái)無(wú)法產(chǎn)生耐貯存的、包含最大細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)量所需濃度的酪氨酸和半胱氨酸的液體細(xì)胞培養(yǎng)基。

本申請(qǐng)人還嘗試通過(guò)在含水細(xì)胞培養(yǎng)基中使用低于期望濃度的酪氨酸或半胱氨酸來(lái)解決該問(wèn)題。這樣做時(shí)，能夠獲得可接受的含水貯存期。然而，這是在犧牲最佳細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)產(chǎn)生或病毒產(chǎn)生的情況下實(shí)現(xiàn)的。換句話說(shuō)，與具有最佳濃度的酪氨酸和半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基相比較，具有更低濃度的酪氨酸和半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基支持減少的細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生。

因此，目前存在對(duì)這樣的培養(yǎng)基、濃縮培養(yǎng)基或濃縮補(bǔ)料(feed supplement)的需要，其包含足以支持最大細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)或病毒產(chǎn)生的量的酪氨酸和半胱氨酸，同時(shí)避免因酪氨酸的有限溶解度或半胱氨酸的有限穩(wěn)定性(包括半胱氨酸隨時(shí)間過(guò)去易于從溶液中沉淀出來(lái)的傾向)引起的問(wèn)題。此外，還需要以濃縮形式存在的此類補(bǔ)料，以便其添加不會(huì)極大地增加終細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的體積。還存在這樣的需要：當(dāng)添加此類營(yíng)養(yǎng)給料時(shí)，所得的系統(tǒng)的pH和重量摩爾滲透壓濃度可自動(dòng)被平衡，并且培養(yǎng)基或濃縮的給料可以以液體或干燥形式獲得。最后，存在對(duì)這樣的單方案、濃縮補(bǔ)料的需要，其包含足以支持最大細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生和/或高質(zhì)量的蛋白質(zhì)表達(dá)的量的半胱氨酸和酪氨酸。

概述

本發(fā)明的組合物，部分涉及細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮培養(yǎng)基或濃縮補(bǔ)料，其包含支持最大細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)或病毒產(chǎn)生的濃度的半胱氨酸和酪氨酸，同時(shí)避免因它們有限的溶解度和穩(wěn)定性引起的問(wèn)題。在一個(gè)方面，培養(yǎng)基、濃縮補(bǔ)料或濃縮培養(yǎng)基可以是無(wú)血清組合物。在一個(gè)方面，組合物可包含人血清組分，如人血清白蛋白。在其它方面，人血清白蛋白可以是重組的(r-人血清白蛋白)，來(lái)源于重組來(lái)源，在一些優(yōu)選的情況下，來(lái)自植物來(lái)源如稻、玉米、小麥、馬鈴薯、或來(lái)自真菌來(lái)源，或來(lái)自酵母或公知用于本領(lǐng)域(無(wú)異物培養(yǎng)(xeno-free culture))的其它等同微生物。在另一個(gè)方面，培養(yǎng)基、濃縮補(bǔ)料或濃縮培養(yǎng)基可以為無(wú)蛋白質(zhì)的組合物。在另一個(gè)方面，培養(yǎng)基、濃縮補(bǔ)料或濃縮培養(yǎng)基可以為無(wú)蛋白質(zhì)-水解產(chǎn)物的組合物，并且還可以不含蛋白質(zhì)-水解產(chǎn)物的級(jí)分。在某些方面，培養(yǎng)基、濃縮補(bǔ)料或濃縮培養(yǎng)基可以為無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)和無(wú)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的組合物。在優(yōu)選方面，此類組合物可包含化學(xué)成分明確的、無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)和無(wú)任何蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或其級(jí)分的組分。在某些實(shí)施方案中，具有一種或多種小肽或一種或多種二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)料也不包含如下物質(zhì)的一種或多種：脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分、或生長(zhǎng)因子。

本發(fā)明還部分涉及，就包含半胱氨酸或酪氨酸的短肽的存在或不存在分析上述組合物的方法。利用任何本領(lǐng)域已知的方法，例如利用質(zhì)譜(LCMS)、毛細(xì)管電泳或HPLC進(jìn)行培養(yǎng)基的分析。

具體地，本公開內(nèi)容涉及細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物，其包含一種或多種具有2至6個(gè)氨基酸的小肽，如隨后在本申請(qǐng)中所定義的。因此，本公開內(nèi)容提供了細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物，其中所述培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物包含選自下述的一種或多種小肽或其鹽：X_1-5-酪氨酸、X_1-5-半胱氨酸、酪氨酸-X_1-5和半胱氨酸-X_1-5，或其中半胱氨酸或酪氨酸存在于1-6個(gè)氨基酸的短肽內(nèi)的任何位置的任何小肽(例如，X-半胱氨酸-X_1-4，X-酪氨酸-X_1-4等)，其中X為任意氨基酸，并且其中短肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在具體的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物，其中所述培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物包含選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X和半胱氨酸-X的一種或多種二肽或其鹽，其中X為任意氨基酸，并且其中二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種二肽為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸。細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物可以為液體溶液或干粉，例如干粉培養(yǎng)基(DPM)或團(tuán)聚粉(agglomerated powder)(AGT^TM)。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體溶液于2-8℃下貯存，且保持無(wú)沉淀12個(gè)月以上。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，酪氨酸(包含在小肽中)在溶液、培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物中的濃度可高于以單體存在時(shí)在相同溶液中保持可溶的酪氨酸的濃度(即，小肽中的酪氨酸可使得溶液“對(duì)于酪氨酸是過(guò)飽和的”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液可具有約1至至少約100倍，或約1至至少約25倍的以單體存在時(shí)能夠達(dá)到的可溶性酪氨酸濃度。例如，一些細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或補(bǔ)充物中小肽或二肽的濃度可以為以單體存在時(shí)能夠達(dá)到的可溶性酪氨酸濃度的約1至至少約5倍，約1至至少約10倍，約1至至少約15倍，約1至至少約20倍，約1至至少約30倍，約1至至少約40倍，約1至至少約50倍，約1至至少約60倍，約1至至少約70倍，約1至至少約80倍，約1至至少約90倍，約1至至少約100倍，約10至至少約20倍，約10至至少約30倍，約10至至少約40倍，約10至至少約50倍，約10至至少約60倍，約10至至少約70倍等等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，溶液、培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物中的半胱氨酸(包含在小肽中)的濃度比當(dāng)半胱氨酸以單體形式存在時(shí)在相同的溶液中保持可溶的半胱氨酸的濃度更高(即，小肽中的半胱氨酸可使得溶液“對(duì)于半胱氨酸是過(guò)飽和的”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，半胱氨酸的溶解度(或其缺乏)可包括例如，因半胱氨酸至胱氨酸的轉(zhuǎn)化而引起的可溶性的喪失。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液可包含至少約1至約25倍的當(dāng)以單體存在時(shí)能夠達(dá)到的可溶性半胱氨酸濃度。例如，小肽或二肽在一些細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或補(bǔ)充物中的濃度可以為以單體存在時(shí)能夠達(dá)到的可溶性半胱氨酸濃度的約1至至少約5倍、約1至至少約10倍、約1至至少約15倍、約1至至少約20倍、約1至至少約30倍、約1至至少約40倍、約1至至少約50倍、約1至至少約60倍、約1至至少約70倍、約1至至少約80倍、約1至至少約90倍、約1至至少約100倍、約1至至少約110倍、約10至至少約20倍、約10至至少約30倍、約10至至少約40倍、約10至至少約50倍、約10至至少約60倍、約10至至少約70倍、約10至至少約80倍、約10至至少約90倍、約10至至少約100倍、約10至至少約110倍等。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液對(duì)于酪氨酸和半胱氨酸都是過(guò)飽和的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液對(duì)于酪氨酸和半胱氨酸都是過(guò)飽和的，在例如上文對(duì)于酪氨酸或半胱氨酸各自描述的范圍內(nèi)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，上述濃縮給料、培養(yǎng)基或補(bǔ)充物的添加可減少對(duì)可能已在進(jìn)行中的培養(yǎng)系統(tǒng)(例如補(bǔ)料分批培養(yǎng))的補(bǔ)充的體積。培養(yǎng)可能已在進(jìn)行中數(shù)小時(shí)至數(shù)天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加小肽中包含的半胱氨酸和酪氨酸的溶解度使得能夠設(shè)計(jì)單部分濃縮給料，所述單部分濃縮給料還可以是pH中性的，這是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明部分涉及單方案濃縮給料、濃縮培養(yǎng)基和濃縮補(bǔ)充物，其含有包含在小肽內(nèi)的半胱氨酸和酪氨酸，以增加它們?cè)诮M合物中的溶解度和穩(wěn)定性。

具有一種或多種小肽或一種或多種二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物任選地包含如下物質(zhì)的一種或多種：碳水化合物、維生素、鹽、無(wú)機(jī)元素、緩沖劑和氨基酸或其鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，碳水化合物為己糖。或者，可使用戊糖、己糖或其衍生物或其它等同物。在一些情況下，可使用寡糖或其衍生物；或者，己糖可選自葡萄糖、半乳糖、果糖和麥芽糖。在具體的實(shí)施方案中，碳水化合物為葡萄糖。

在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸或其鹽為精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的一種或多種。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物包含1)第1二肽X-酪氨酸或其鹽，和第2二肽X-半胱氨酸或其鹽，其中X為丙氨酸或甘氨酸，并且其中丙氨酸或甘氨酸具有游離氨基，2)碳水化合物，例如葡萄糖，和3)氨基酸或其鹽。氨基酸或其鹽可包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的一種或多種。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物具有一種或多種小肽，或一種或多種二肽，其適合用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞(例如，果蠅(Drosophila)細(xì)胞、斜紋夜蛾細(xì)胞(Spodoptera)或粉紋夜蛾(Trichoplusia)細(xì)胞)、線蟲細(xì)胞(例如，秀麗隱桿線蟲(C.elegans)細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、AE-1細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、L5.1細(xì)胞、PerC6、雜交瘤細(xì)胞、HEK 293，包括人細(xì)胞)。

在某些實(shí)施方案中，具有一種或多種小肽或一種或多種二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基為1X制劑。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基被濃縮為2X或更高的制劑，如本申請(qǐng)中其它地方論述的。在某些實(shí)施方案中，一種或多種小肽或二肽，例如X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X或半胱氨酸-X以約1g/L至約16g/L、約1g/L至約10g/L、約1g/L至約5g/L、約2.5g/L至約16g/L、約2.5g/L至約10g/L、約2.5g/L至約5g/L或約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。

在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括在支持細(xì)胞的培養(yǎng)的條件下將細(xì)胞與本文中所述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸?？砂凑毡景l(fā)明的方法培養(yǎng)任何細(xì)胞，特別地細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞(例如，果蠅細(xì)胞、斜紋夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾細(xì)胞)、線蟲細(xì)胞(例如，秀麗隱桿線蟲細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞人、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、AE-1細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、L5.1細(xì)胞、PerC6、雜交瘤細(xì)胞、HEK 293，或其他人細(xì)胞)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞的方法包括在支持細(xì)胞的培養(yǎng)的條件下將細(xì)胞與基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基接觸，和用本文中描述的具有一種或多種小肽或一種或多種二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物或細(xì)胞培養(yǎng)給料補(bǔ)充基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種二肽選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X或半胱氨酸-X或其鹽，其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且其中一種或多種二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種二肽為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在超過(guò)一天上，用包含小肽中的半胱氨酸和酪氨酸的溶液補(bǔ)充基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，其中溶液可以是濃縮培養(yǎng)基或濃縮補(bǔ)料。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及包含小肽的培養(yǎng)基、給料、補(bǔ)充物或其它溶液(包括例如，包含含有至少一個(gè)酪氨酸或半胱氨酸殘基的二肽的溶液)的用途。事實(shí)上，本申請(qǐng)人的發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是此類溶液在培養(yǎng)細(xì)胞中的用途。在該方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文的某些敘述中，本申請(qǐng)所涉及的特定補(bǔ)充物、培養(yǎng)基、給料或溶液僅僅是可等同地應(yīng)用于本文中描述的任何類型的溶液的實(shí)施方案的實(shí)例。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，關(guān)于具有特定氨基酸組成的“補(bǔ)充物”的敘述可等同地描述具有相似組成的“給料”，并且反之亦然。

基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮培養(yǎng)基、濃縮給料或補(bǔ)充物可在開始細(xì)胞培養(yǎng)后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天包含含有小肽或二肽的培養(yǎng)基或給料，以及之后可每天進(jìn)行補(bǔ)充，直至經(jīng)過(guò)第13或14天或直至培養(yǎng)物的活力下降至低于預(yù)定水平(例如50％)。基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基任選地以約2％的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積補(bǔ)充含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)、肽、小RNA(例如，miRNA、siRNA等)。蛋白質(zhì)意指重組蛋白質(zhì)或天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)，無(wú)論是重組的還是天然的，也意指全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或其部分(如結(jié)構(gòu)域、基序、多肽鏈或多肽片段)。蛋白質(zhì)，無(wú)論是重組的還是天然的，也意指細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、細(xì)胞外蛋白質(zhì)、分泌型蛋白質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、受體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、免疫球蛋白或免疫球蛋白的部分、或其片段。優(yōu)選，在本發(fā)明的包含短肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物的情況下，蛋白質(zhì)產(chǎn)率可以更高。在具體方面，例如，免疫球蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)率可在培養(yǎng)至少14天后，大于3000mg/L的免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可產(chǎn)生病毒或VLP(病毒樣顆粒)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可產(chǎn)生期望的細(xì)胞產(chǎn)物例如維生素、代謝產(chǎn)物、糖蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)或脂蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞本身以收獲細(xì)胞。本發(fā)明的培養(yǎng)基和補(bǔ)料組合物包含這樣的濃度的半胱氨酸和酪氨酸，其支持最大細(xì)胞生長(zhǎng)(用于產(chǎn)生病毒或VLP)或最大維生素產(chǎn)生或糖蛋白或疫苗產(chǎn)生等，同時(shí)避免由半胱氨酸和酪氨酸的有限的溶解度引起的問(wèn)題。

可根據(jù)本方法培養(yǎng)任何細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本方法進(jìn)行培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞(例如，果蠅細(xì)胞、斜紋夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾細(xì)胞)、線蟲細(xì)胞(例如，秀麗隱桿線蟲細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞人、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、AE-1細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、L5.1細(xì)胞、PerC6、雜交瘤細(xì)胞、或其他人細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為CHO細(xì)胞。

另一個(gè)方面提供了制備細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，包括將本文中描述的一種或多種小肽或二肽與碳水化合物例如葡萄糖和至少一種氨基酸或其鹽組合，所述氨基酸例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種二肽選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X或半胱氨酸-X或其鹽，其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且其中所述一種或多種二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種二肽為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸。

在其它實(shí)施方案中，按照本方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)基被濃縮為2X或更濃的制劑，如在本申請(qǐng)中其它地方所論述的。在某些實(shí)施方案中，一種或多種小肽或二肽例如丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸存在于按照本方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)基中。

例如，在一些細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮培養(yǎng)基或給料中小肽或二肽的濃度可以為約0.5g/L至約30g/L、約0.5g/L至約25g/L、約0.5g/L至約20g/L、約0.5g/L至約16g/L、約0.5g/L至約10g/L、約0.5g/L至約5g/L、約0.5g/L至約4g/L、約1g/L至約30g/L、約1g/L至約20g/L、約1g/L至約16g/L、約1g/L至約10g/L、約1g/L至約5g/L、約2.5g/L至約30g/L、約2.5g/L至約20g/L、約2.5g/L至約16g/L、約2.5g/L至約10g/L、約2.5g/L至約5g/L或約2.5g/L至約4.5g/L、約5g/L至約30g/L、約5g/L至約25g/L、約5g/L至約20g/L、約5g/L至約16g/L、約5g/L至約10g/L、約5g/L至約5g/L、約5g/L至約4g/L等。

另一個(gè)方面提供了包含本文中所述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基和至少一種上述細(xì)胞的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種細(xì)胞為CHO細(xì)胞。

另一個(gè)方面涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒。試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)裝有本文中描述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基的容器。試劑盒任選地包括至少一種選自下述的另外的組分：至少一種生長(zhǎng)因子、至少一種動(dòng)物組織提取物、至少一種動(dòng)物器官提取物、至少一種動(dòng)物腺提取物、至少一種酶、至少一種蛋白質(zhì)、至少一種維生素、至少一種細(xì)胞因子、至少一種脂質(zhì)、至少一種痕量元素、至少一種細(xì)胞外基質(zhì)組分、至少一種緩沖劑、至少一種抗生素和至少一種病毒抑制劑。試劑盒還可包含一種或多種細(xì)胞或細(xì)胞類型。

另一個(gè)方面涉及使用本文中描述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)生病毒或VLP的方法。具體地，所述方法包括(a)在適合促進(jìn)病毒感染細(xì)胞的條件下將細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)與病毒接觸；和(b)在適用促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生病毒的條件下在本文中描述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生病毒或VLP的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)非哺乳動(dòng)物病毒或VLP進(jìn)行工程改造以便其可感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人細(xì)胞。

在另一個(gè)方面，本公內(nèi)容提供了使用本文中描述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)生多肽例如免疫球蛋白或其片段的方法。具體地，所述方法包括在適合于細(xì)胞表達(dá)多肽的條件下在含有二肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)歷基因工程改造以產(chǎn)生多肽的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含至少一種小肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料，所述肽包含至少兩個(gè)氨基酸，其中至少一個(gè)氨基酸為半胱氨酸或酪氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料，其中小肽的其余氨基酸中的至少一個(gè)選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面，小肽的其余氨基酸中的至少一個(gè)為丙氨酸或甘氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料，其中至少一種所述小肽為選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X和半胱氨酸-X或其鹽的二肽，并且其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，和/或，其中一種或多種小肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在一個(gè)方面，X為丙氨酸或甘氨酸。

在本發(fā)明的一些方面，小肽可以為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽；或者，小肽在長(zhǎng)度上可以為至少約2至10個(gè)氨基酸；或在一些方面，小肽在長(zhǎng)度上為至少約10個(gè)氨基酸。在一些方面，短肽可以包含2、3、4、5或6個(gè)氨基酸。

在其它方面，細(xì)胞培養(yǎng)基為液體溶液。

在上述細(xì)胞培養(yǎng)基之任一中，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料是干粉或顆粒性干粉。

在其它方面，上述細(xì)胞培養(yǎng)基之任一可包含碳水化合物和氨基酸或其鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，碳水化合物為己糖。在其它實(shí)施方案中，氨基酸或其鹽為精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸之任一種或多種。在其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含維生素、鹽、緩沖劑或無(wú)機(jī)元素。

在上述一些方面中，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料不包含脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分，或生長(zhǎng)因子。在上述其它方面，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料不包含蛋白質(zhì)。因此在一些優(yōu)選方面，包含小肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基可以不含血清、不含蛋白質(zhì)和/或不含水解產(chǎn)物。

在具體的方面，將細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料濃縮為2X或更濃的制劑。在優(yōu)選方面，上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或濃縮補(bǔ)料包含一種或多種二肽，其可以為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸和/或丙氨酰胱氨酸二聚體。在優(yōu)選方面，一種或多種二肽可以以約1g/L至約16g/L的濃度存在；或一種或多種二肽可以以約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在。在一個(gè)方面，于2-8℃下貯存的液體溶液可保持無(wú)沉淀12個(gè)月以上。

本發(fā)明還涉及培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括在支持細(xì)胞的培養(yǎng)的條件下將細(xì)胞與基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基接觸，和用上述濃縮給料或培養(yǎng)基補(bǔ)充基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基?？稍诜峙a(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)充；或在現(xiàn)有補(bǔ)料方案之外再進(jìn)行補(bǔ)充；或，與逐步的彈丸(bolus)添加不同，可連續(xù)進(jìn)行補(bǔ)充。在一些情況下，可在超過(guò)一天上用濃縮給料或培養(yǎng)基補(bǔ)充基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；或可用單次濃縮給料或用多次濃縮給料補(bǔ)充基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；或可從開始細(xì)胞培養(yǎng)后第0天，第1天，第2天，第3天，第4天或第5天開始進(jìn)行補(bǔ)充，以及之后每天進(jìn)行補(bǔ)充，直至第13或14天；或每一次補(bǔ)充可以為約1-10％，或約5-20％的基礎(chǔ)培細(xì)胞培養(yǎng)基的總起始體積。

在本文中的方法的所有方面，細(xì)胞可以是工程改造的細(xì)胞；或細(xì)胞可以是重組細(xì)胞；或細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，或細(xì)胞可以是動(dòng)物、植物、昆蟲、禽類、酵母、藻類或魚類細(xì)胞之任一種。動(dòng)物細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物、昆蟲、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或多潛能干細(xì)胞。在一個(gè)方面，動(dòng)物細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞)以及已建立的細(xì)胞系和其株系(例如，293胚腎細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa宮頸上皮細(xì)胞和PER-C6視網(wǎng)膜細(xì)胞、MDBK(NBL-1)細(xì)胞、911細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BeWo細(xì)胞、Chang細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞、HeLa 229細(xì)胞、HeLa S3細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞、KB細(xì)胞、LS180細(xì)胞、LS174T細(xì)胞、NCI-H-548細(xì)胞、RPMI 2650細(xì)胞、SW-13細(xì)胞、T24細(xì)胞、WI-28VA13,2RA細(xì)胞、WISH細(xì)胞、BS-C-I細(xì)胞、LLC-MK₂細(xì)胞、CloneM-3細(xì)胞、1-10細(xì)胞、RAG細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、Y-1細(xì)胞、LLC-PK₁細(xì)胞、PK(15)細(xì)胞、GH₁細(xì)胞、GH₃細(xì)胞、L2細(xì)胞、LLC-RC 256細(xì)胞、MH₁C₁細(xì)胞、XC細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、VSW細(xì)胞和TH-I,B1細(xì)胞或其衍生物)、來(lái)自任何組織或器官(包括但不限于心臟、肝、腎、結(jié)腸、腸、食道、胃、神經(jīng)組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)血管)、淋巴組織(淋巴腺、腺組織(adenoid)、扁桃體、骨髓和血液)、脾和成纖維細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系的成纖維細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞、TRG-2細(xì)胞、IMR-33細(xì)胞、Don細(xì)胞、GHK-21細(xì)胞、瓜氨酸血癥細(xì)胞、Dempsey細(xì)胞、Detroit 551細(xì)胞、Detroit 510細(xì)胞、Detroit 525細(xì)胞、Detroit 529細(xì)胞、Detroit 532細(xì)胞、Detroit 539細(xì)胞、Detroit 548細(xì)胞、Detroit 573細(xì)胞、HEL 299細(xì)胞、IMR-90細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、WI-26細(xì)胞、MiCl₁細(xì)胞、CHO細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、COS-3細(xì)胞、COS-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞、DBS-FrhL-2細(xì)胞、BALB/3T3細(xì)胞、F9細(xì)胞、SV-T2細(xì)胞、M-MSV-BALB/3T3細(xì)胞、K-BALB細(xì)胞、BLO-11細(xì)胞、NOR-10細(xì)胞、C₃H/IOTI/2細(xì)胞、HSDM₁C₃細(xì)胞、KLN₂O₅細(xì)胞、McCoy細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、株系2071(小鼠L)細(xì)胞、L-M株(小鼠L)細(xì)胞、L-MTK^-(小鼠L)細(xì)胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1細(xì)胞、Swiss/3T3細(xì)胞、印度黃麂(Indian muntjac)細(xì)胞、SIRC細(xì)胞、C_II細(xì)胞和Jensen細(xì)胞、Sp2/0、NS0、NS1細(xì)胞或其工程改造的細(xì)胞。在一個(gè)方面，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以為CHO細(xì)胞。

在本文中的方法的所有方面，細(xì)胞可產(chǎn)生免疫球蛋白或其片段；細(xì)胞可產(chǎn)生大于3000mg/L的免疫球蛋白或其片段。

或者，在本文中的方法的所有方面，細(xì)胞可產(chǎn)生病毒或病毒樣顆粒(VLP)；并且病毒可以為重組病毒。病毒可以為但不限于腺病毒、慢病毒、桿狀病毒、仙臺(tái)病毒、痘苗病毒或其工程改造的病毒衍生物。在本文描述的這些方面中，VLP可攜帶核酸，或其可攜帶RNA。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及制備細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物的方法，包括將一種或多種小肽與碳水化合物和至少一種氨基酸或其鹽組合，其中一種或多種小肽的每一種包含半胱氨酸或酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種小肽中除半胱氨酸或酪氨酸外的氨基酸(或稱為其余氨基酸)可選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，除半胱氨酸或酪氨酸外的氨基酸為丙氨酸或甘氨酸。在另一組中，其余氨基酸還可以是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一個(gè)或多個(gè)。在上述方法的另一個(gè)優(yōu)選方面，一種或多種二肽可選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X或半胱氨酸-X或其鹽，其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸或谷氨酸，并且其中一種或多種二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在最優(yōu)選方面，X為丙氨酸或甘氨酸。在最優(yōu)選方面，碳水化合物可以為葡萄糖。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基還可包含維生素、鹽、緩沖劑或無(wú)機(jī)元素；或，可以不包含脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分，或生長(zhǎng)因子；或可以不包含蛋白質(zhì)；或細(xì)胞培養(yǎng)基可被濃縮為2X或更濃的制劑；或，一種或多種二肽可以為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸；或一種或多種二肽以約1g/L至約16g/L的濃度存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中；或優(yōu)選，一種或多種二肽以約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在。在大多數(shù)方面，于2-8℃下貯存的細(xì)胞培養(yǎng)基保持無(wú)沉淀12個(gè)月以上。

本發(fā)明還涉及用于分析細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括測(cè)定包含半胱氨酸或酪氨酸的短肽在培養(yǎng)基中的存在或不存在。在一個(gè)方面，細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基可以不含血清、不含蛋白質(zhì)、不含水解產(chǎn)物，并且可利用但不限于質(zhì)譜法(LCMS)、毛細(xì)管電泳和HPLC來(lái)進(jìn)行分析。

本發(fā)明還涉及包含上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基以及細(xì)胞的組合物。

本發(fā)明還涉及在細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括：將細(xì)胞與上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基接觸；和在適合于所述細(xì)胞生長(zhǎng)和/或所述重組蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器，其中第一容器包含含有至少一種上述二肽的培養(yǎng)基，并且其中所述培養(yǎng)基支持培養(yǎng)物中的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/重組蛋白質(zhì)的表達(dá)?？梢詰腋∨囵B(yǎng)或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。生長(zhǎng)可以是高密度生長(zhǎng)。

本發(fā)明還涉及在上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基中產(chǎn)生病毒或病毒顆粒的方法，包括：在上述細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基在適合于所述病毒或病毒顆粒表達(dá)的條件下支持所述細(xì)胞生長(zhǎng)。

本發(fā)明還涉及利用上述方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)；或，利用上述方法產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒；或上述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基用于產(chǎn)生病毒或重組蛋白質(zhì)的用途；或利用上述方法產(chǎn)生的培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基。

附圖概述

包括在本說(shuō)明書中并且構(gòu)成本說(shuō)明書的一部分的附圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，并且與書面描述一起用于解釋本發(fā)明的某些原理。

圖1顯示在(i)補(bǔ)充有葡萄糖給料的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基(CD FortiCHO^TM)，和(ii)CD FortiCHO^TM+aa(具有低水平的半胱氨酸和酪氨酸的濃縮氨基酸混合物，和葡萄糖)+DP(二肽)給料方案2(FP2)或(iii)CD FortiCHO^TM+aa(具有低水平的半胱氨酸和酪氨酸的濃縮氨基酸混合物，和葡萄糖)+DP(二肽)給料方案3(FP3)中生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞的活細(xì)胞密度(x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL)(由曲線描述)和IgG滴度(mg/L)(由條塊描述)。參見實(shí)施例。

圖2顯示包含Ala-Tyr二肽的溶液的示例性色譜圖譜(profile chromatogram)，Ala-Tyr二肽由6.172分鐘處的峰表示(下圖)。

圖3顯示包含Ala-Cys二肽的溶液的示例性色譜圖譜，Ala-Cys二肽由6.631分鐘處的峰表示(下圖)。

圖4顯示包含Ala-Tyr二肽標(biāo)準(zhǔn)品(由8.8分鐘處的峰表示)的溶液的示例性提取離子色譜圖譜(profile extracted ion chromatogram)。

圖5顯示包含Ala-Cys二聚體標(biāo)準(zhǔn)品(由9.6分鐘處的峰表示)的溶液的示例性提取離子色譜圖譜。

圖6顯示包含Ala-Cys二聚體和Ala-Tyr二肽的示例性給料樣品的示例性總離子色譜圖譜(profile total ion chromatogram)。

圖7顯示包含Ala-Tyr二肽和Ala-Cys二聚體的示例性給料樣品的示例性提取離子色譜圖譜。

詳細(xì)描述

現(xiàn)詳細(xì)參考各種示例性實(shí)施方案。應(yīng)理解，提供下列詳細(xì)描述以給予讀者對(duì)本發(fā)明的方面的某些實(shí)施方案、特征和細(xì)節(jié)的更全面理解，并且下列詳細(xì)描述不應(yīng)當(dāng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。

1.定義

為了可更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。其它定義示于整個(gè)詳細(xì)描述中。

如本文中所使用的，“細(xì)胞培養(yǎng)”或“培養(yǎng)”是指在人工(例如，體外)環(huán)境中維持細(xì)胞。然而，應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”是概括性術(shù)語(yǔ)，其不僅可用于包括單獨(dú)的原核(例如，細(xì)菌)或真核(例如，動(dòng)物、植物和真菌)細(xì)胞的培養(yǎng)，而且可用于包括組織、器官、器官系統(tǒng)或完整生物體的培養(yǎng)，針對(duì)于此，術(shù)語(yǔ)“組織培養(yǎng)”、“器官培養(yǎng)”、“器官系統(tǒng)培養(yǎng)”或“器官型培養(yǎng)”在有些情況下可與術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”互換使用。

如本文中所使用的，“培育/培養(yǎng)”是指在有利于細(xì)胞在活躍或靜止?fàn)顟B(tài)中生長(zhǎng)、分化或連續(xù)存活的條件下在人工環(huán)境中維持細(xì)胞。因此，“培育/培養(yǎng)”可與“細(xì)胞培養(yǎng)”或任何其上述同義詞互換使用。

如本文中所使用的，“細(xì)胞培養(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”(和在每一種情況下的復(fù)數(shù)形式)是指，支持細(xì)胞的培養(yǎng)和/或生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)組合物。細(xì)胞培養(yǎng)基可以為完全制劑，即，不需要補(bǔ)充即可培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，可以為不完全制劑，即，需要補(bǔ)充的細(xì)胞培養(yǎng)基，或可以為這樣的培養(yǎng)基，其可補(bǔ)充不完全制劑或在完全制劑的情況下可改善培養(yǎng)或培養(yǎng)結(jié)果。除非上下文另外指出，否則術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”(和在每一種情況下的復(fù)數(shù)形式)是指，未曾與細(xì)胞一起溫育的非條件化的細(xì)胞培養(yǎng)基。由此，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”(和在每一種情況下的復(fù)數(shù)形式)與“消耗(spent)”培養(yǎng)基或“條件”培養(yǎng)基不同，所述消耗或條件培養(yǎng)基可包含該培養(yǎng)基的許多原始組分以及多種細(xì)胞代謝產(chǎn)物和分泌的蛋白質(zhì)。

如本文中所使用的，“小肽”是指通過(guò)一個(gè)或多個(gè)肽鍵或等同的鍵連接在一起的2至6個(gè)氨基酸的鏈，其中至少一個(gè)氨基酸為酪氨酸或半胱氨酸。優(yōu)選，小肽中的除酪氨酸或半胱氨酸外的氨基酸，在中性pH上顯示良好的溶解度性質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，小肽中的除酪氨酸或半胱氨酸外的氨基酸，選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和精氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，小肽可包含具有游離氨基(如乙醇胺)或游離羧基的非氨基酸，或類似化合物。

如本文中所使用的，“提取物”是指包含物質(zhì)的組分或物質(zhì)的亞組的濃縮制備物的組合物，其通常是通過(guò)機(jī)械(例如，通過(guò)壓力處理)或化學(xué)(例如，通過(guò)蒸餾、沉淀、酶促作用或高鹽處理)方法處理物質(zhì)形成的。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“成分”是指，可用于細(xì)胞培養(yǎng)基中以維持或促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖的任何化合物，無(wú)論是化學(xué)來(lái)源的還是生物學(xué)來(lái)源的。術(shù)語(yǔ)“組分”、“營(yíng)養(yǎng)物”和“成分”可互換使用并且全都指此類化合物。可用于細(xì)胞培養(yǎng)基的常見成分包括氨基酸、鹽、金屬、糖、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸、激素、維生素、脂肪酸、蛋白質(zhì)等。促進(jìn)或維持細(xì)胞的離體培養(yǎng)的其它成分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要來(lái)選擇。

“1X制劑”是指，以工作濃度包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一些或全部成分的任何水溶液?！?X制劑”可以指例如，細(xì)胞培養(yǎng)基或該培養(yǎng)基的成分的任何亞組。1X溶液中的成分的濃度與用于體外維持或培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)制劑中發(fā)現(xiàn)的該成分的濃度大致相同。用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基根據(jù)定義為1X制劑。當(dāng)存在許多成分時(shí)，1X制劑中的每一種成分具有與細(xì)胞培養(yǎng)基中的此類成分的濃度大致相等的濃度。例如，RPMI-1640培養(yǎng)基，除其它成分外，包含0.2g/L L-精氨酸、0.05g/L L-天冬酰胺和0.02g/L L-天冬氨酸。此類氨基酸的“1X制劑”在溶液中包含大致相同濃度的此類成分。因此，當(dāng)提及“1X制劑”時(shí)，意指溶液中的每一種成分具有與所描述的細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的濃度相同或大致相同的濃度。細(xì)胞培養(yǎng)基的1X制劑中的成分的濃度對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,42-50(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)，將其通過(guò)引用整體并入本文。然而，1X制劑的重量摩爾滲透壓濃度和/或pH與培養(yǎng)基相比較可以不同，特別是當(dāng)較少的成分包含在1X制劑中時(shí)。

“10X制劑”意指這樣的溶液，其中該溶液中的每一種成分的濃度約為細(xì)胞培養(yǎng)基中的相同成分的10倍。例如，RPMI-1640培養(yǎng)基的10X制劑，除其它成分外，可包含2.0g/L L-精氨酸、0.5g/L L-天冬酰胺和0.2g/L L-天冬氨酸(比較上文的1X制劑)。“10X制劑”可以以1X培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的濃度的約10倍的濃度包含許多另外的成分。很顯然的，“5X制劑”、“25X制劑”、“50X制劑”、“100X制劑”、“500X制劑”和“1000X制劑”是指，與1X細(xì)胞培養(yǎng)基相比較，分別以約5、25、50、100、500或1000倍的濃度包含成分的溶液。再次地，培養(yǎng)基制劑和濃縮液的重量摩爾滲透壓濃度和pH可發(fā)生變化。對(duì)于具體的細(xì)胞培養(yǎng)方案，制劑可以以1X包含組分或成分，但對(duì)于不同的培養(yǎng)方案或不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以以例如2、2.5、5、6.7、9、12X等的濃度包含所述組分或成分。

二聚體由兩個(gè)二肽組成。因此，例如，Ala-Cys的二聚體可包含Ala-Cys-Cys-Ala，其中cys-cys通過(guò)二硫鍵鍵合。Ala-Cys-Cys-Ala也可稱為N,N'-二-L-丙氨酰-L-胱氨酸。

1.小肽

本公開內(nèi)容涉及小肽包括二肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中的用途。本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，制備包含期望濃度的某些氨基酸例如酪氨酸和半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基因酪氨酸的低溶解度和半胱氨酸的低穩(wěn)定性而不可能實(shí)現(xiàn)。酪氨酸和半胱氨酸的溶解度和穩(wěn)定性問(wèn)題已通過(guò)下述得到解決：在含水細(xì)胞培養(yǎng)基中使用低于期望濃度的酪氨酸或半胱氨酸，從而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用時(shí)，這使得它們成為最佳細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的限速氨基酸。雖然使用低于期望濃度的酪氨酸和半胱氨酸可導(dǎo)致可接受的含水貯存期、溶解度和穩(wěn)定性，但其也可能需要在細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充過(guò)程中例如在分批補(bǔ)料培養(yǎng)系統(tǒng)中添加更大體積的培養(yǎng)基以獲得期望的生產(chǎn)率。這是不想要的，因?yàn)橄到y(tǒng)的化學(xué)計(jì)量平衡、pH和/或重量摩爾滲透壓濃度也需要重新調(diào)整。

由大體積補(bǔ)充導(dǎo)致的問(wèn)題可通過(guò)使用濃縮補(bǔ)料來(lái)解決。期望的濃縮補(bǔ)料是營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜、化學(xué)計(jì)量平衡的營(yíng)養(yǎng)添加劑，其在分批補(bǔ)料培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物耗竭的培養(yǎng)系統(tǒng)，其另外地以及期望地可具有自動(dòng)平衡pH和自動(dòng)平衡重量摩爾滲透壓濃度的特征。然而，由于酪氨酸的低溶解度和半胱氨酸的低穩(wěn)定性，具有高水平的半胱氨酸和酪氨酸的濃縮給料組合物已成為制備的挑戰(zhàn)。其通常導(dǎo)致半胱氨酸或酪氨酸隨時(shí)間過(guò)去從溶液中析出。因此，穩(wěn)定的單部分、pH中性、化學(xué)成分明確的濃縮給料一直難以合成。為了克服該問(wèn)題，已制備了酸性或堿性的多部分濃縮給料。

本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，可以用小肽，如二肽丙氨酰-酪氨酸、甘氨酰-酪氨酸、丙氨酰-半胱氨酸(其形成二硫化物二聚體，[AlaCys]₂)、或甘氨酰-半胱氨酸(其形成二硫化物二聚體，[GlyCys]₂)或包含一個(gè)或多個(gè)酪氨酸或半胱氨酸的其它小肽替代細(xì)胞培養(yǎng)基中的游離氨基酸，酪氨酸和半胱氨酸。包含此類二肽或其它小肽的細(xì)胞培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了足以支持最大細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的濃度的酪氨酸和/或半胱氨酸，同時(shí)避免了與游離酪氨酸和/或半胱氨酸相關(guān)的溶解度和穩(wěn)定性問(wèn)題。

本發(fā)明的小肽具有2至6個(gè)氨基酸，其中至少一個(gè)氨基酸為半胱氨酸或酪氨酸，并且其中其余氨基酸可以為任意氨基酸。優(yōu)選，小肽中的除酪氨酸或半胱氨酸外的氨基酸，在中性pH下顯示良好的溶解度性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，小肽中的除酪氨酸或半胱氨酸外的氨基酸，選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小肽的N末端氨基酸具有游離氨基。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，小肽(二、三、四、五或六個(gè)氨基酸)可包含具有游離胺基(如乙醇胺)或游離羧基的非氨基酸，或可促成肽鍵的類似化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小肽可包含通過(guò)二硫鍵二聚化的半胱氨酸。由于半胱氨酸-半胱氨酸二聚化(cys-cys)，雖然本發(fā)明的小肽被定義為具有2-6個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，但可能存在這樣的組合物，其因可能在本發(fā)明的培養(yǎng)基或給料中發(fā)生的自發(fā)半胱氨酸-半胱氨酸二聚化而導(dǎo)致更長(zhǎng)的肽。此類化合物也是可溶性的，即使是在高濃度下，因此，其完全在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在其它實(shí)施方案中，小肽為具有兩個(gè)氨基酸并且由式：X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X或半胱氨酸-X表示的二肽或其鹽，其中X為任意氨基酸，并且其中二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。因此，所述二肽與美國(guó)專利No.5,534,538中公開的N-酰基二肽明顯不同，所述N-?；男枰矁r(jià)鍵合于N-末端氨基酸的氨基的?；?。根據(jù)美國(guó)專利No.5,534,538，正是酰基的存在賦予了二肽更優(yōu)的穩(wěn)定性性質(zhì)。優(yōu)選，X為具有良好溶解度性質(zhì)的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，小肽為具有兩個(gè)氨基酸的二肽，并且本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)二肽選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X和半胱氨酸-X或其鹽，其中X為任意氨基酸，并且其中二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為任意氨基酸、氨基酸的衍生物、具有氨基的非氨基酸如乙醇胺。在本實(shí)施方案的方面，優(yōu)選的氨基酸選自：絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，小肽為具有3個(gè)氨基酸的三肽，包括下列三肽：X-X-酪氨酸、X-X-半胱氨酸、X-酪氨酸-X、X-半胱氨酸-X、酪氨酸-X-X、半胱氨酸-X-X或其鹽，其中X為任意氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，三肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。優(yōu)選，X為具有良好溶解度性質(zhì)的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸。在本發(fā)明的某些方面，包含在小肽中的半胱氨酸和酪氨酸的上述組合物用于增加細(xì)胞系的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，增加的蛋白質(zhì)為抗體，其以比在無(wú)所述小肽的培養(yǎng)基中更高的滴度產(chǎn)生。更高的抗體產(chǎn)量意指，約0.1g/L至約10g/L、約0.1g/L至約5g/L、約0.1g/L至約2.5g/L、約0.1g/L至約1g/L，優(yōu)選約1g/L至約10g/L，更優(yōu)選約2g/L至約8g/L等。

取決于細(xì)胞和細(xì)胞的期望的用途，細(xì)胞培養(yǎng)基、給料、濃縮培養(yǎng)基或給料等的一種或多種小肽或二肽可最佳地以化學(xué)計(jì)量平衡的濃度存在以最優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)性能。例如，一些細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料中的一種或多種小肽或二肽的濃度可以為約0.5g/L至約30g/L、約0.5g/L至約25g/L、約0.5g/L至約20g/L、約0.5g/L至約16g/L、約0.5g/L至約10g/L、約0.5g/L至約5g/L、約0.5g/L至約4g/L、約1g/L至約30g/L、約1g/L至約20g/L、約1g/L至約16g/L、約1g/L至約10g/L、約1g/L至約5g/L、約2.5g/L至約30g/L、約2.5g/L至約20g/L、約2.5g/L至約16g/L、約2.5g/L至約10g/L、約2.5g/L至約5g/L、約2.5g/L至約4.5g/L、約5g/L至約30g/L、約5g/L至約25g/L、約5g/L至約20g/L、約5g/L至約16g/L、約5g/L至約10g/L、約5g/L至約5g/L、約5g/L至約4g/L等。在一些培養(yǎng)基制劑或原型培養(yǎng)基制劑中，一種或多種小肽和/或一種或多種二肽可以以約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在于培養(yǎng)基或原型培養(yǎng)基中。此外，本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了制備在用溶劑再水化/重建時(shí)自動(dòng)地處于期望的pH上的“自動(dòng)-pH(auto-pH)培養(yǎng)基”或給料粉的方法。根據(jù)本發(fā)明，此類培養(yǎng)基或給料可以以粉劑形式(干粉(DPM)、高級(jí)粉劑(advanced powder)(APM)或高級(jí)顆?；夹g(shù)(AGT))或以液體形式存在。

通過(guò)本發(fā)明的方法制備的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基或給料在重建后優(yōu)選具有約6-8，或約7-8或約6.0-6.3(對(duì)于昆蟲細(xì)胞)，更優(yōu)選約7-7.5或約7.2-7.4，最優(yōu)選約7.0的pH；通過(guò)本發(fā)明的方法制備的植物細(xì)胞培養(yǎng)基或給料在重建后，優(yōu)選具有約4-8，優(yōu)選約4.5-7、5-6或5.5-6，或優(yōu)選約6.0至6.3的pH。當(dāng)然，待用于特定細(xì)胞類型的給定的培養(yǎng)基的最佳pH還可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的方法憑經(jīng)驗(yàn)確定。

2.細(xì)胞培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基包含許多成分，并且此類成分在不同培養(yǎng)基之間可發(fā)生變化。如上文中所指出的，細(xì)胞培養(yǎng)基可以為完全制劑，即不需要補(bǔ)充即可培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，可以為不完全制劑，即需要補(bǔ)充的細(xì)胞培養(yǎng)基，或可以為補(bǔ)充物，其可補(bǔ)充不完全制劑或在完全制劑的情況下可改善培養(yǎng)或培養(yǎng)結(jié)果。

通常，細(xì)胞培養(yǎng)基具有溶解在溶劑中的溶質(zhì)。溶質(zhì)提供了平衡跨細(xì)胞膜(或壁)的滲透壓的滲透力。此外，溶質(zhì)可給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物。一些營(yíng)養(yǎng)物為細(xì)胞運(yùn)行的化學(xué)燃料；一些營(yíng)養(yǎng)物可以為細(xì)胞用于合成代謝的原料；一些營(yíng)養(yǎng)物可以為促進(jìn)細(xì)胞代謝的工具，例如酶或載體；一些營(yíng)養(yǎng)物可以為結(jié)合劑，其結(jié)合和緩沖用于細(xì)胞使用的成分或結(jié)合或隔離有害細(xì)胞產(chǎn)物。

取決于細(xì)胞和細(xì)胞的期望的用途，細(xì)胞培養(yǎng)基的成分最佳地以經(jīng)平衡以最優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)性能的濃度存在?？筛鶕?jù)一個(gè)或多個(gè)期望的特征例如細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞質(zhì)量、細(xì)胞密度、O₂消耗、培養(yǎng)成分例如葡萄糖或核苷酸的消費(fèi)、生物分子的產(chǎn)生、生物分子的分泌、廢物或副產(chǎn)物例如代謝產(chǎn)物的形成、對(duì)指示劑或信號(hào)分子的活性等來(lái)測(cè)量性能。因此，每一種成分或選擇的成分優(yōu)選最優(yōu)化至用于期望目的的工作濃度。

本發(fā)明的培養(yǎng)基或補(bǔ)料可以以僅需添加溶劑例如水的干燥形式獲得。優(yōu)選，通過(guò)選自下述的至少一種方法制備干燥形式的粉劑：研磨、撞擊、擠出和切割或粉碎、濕法制粒、高剪力造粒、圓盤造粒和流化床團(tuán)聚。干燥形式包括但不限于干粉形式(DPM)、團(tuán)聚(AGT^TM)形式、高級(jí)粉末培養(yǎng)基(APM)或其它適當(dāng)?shù)母稍镄问?。?yōu)選，加水后，溶解應(yīng)當(dāng)快速發(fā)生，并且可過(guò)濾所得的液體，并將其直接添加至細(xì)胞而不進(jìn)行任何pH調(diào)整。重建的培養(yǎng)基或濃縮補(bǔ)充物可以以可變的大量的量制備，其易于滅菌，特別是通過(guò)離子化或紫外照射。

a.碳水化合物

細(xì)胞培養(yǎng)基成分通常包括碳水化合物、氨基酸、鹽、痕量元素和維生素。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的主要碳水化合物為葡萄糖，常規(guī)地以5至25nM補(bǔ)充。參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,51(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。除了葡萄糖外，還可使用任何己糖如半乳糖、果糖或甘露糖或此類糖的組合。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞還可將谷氨酰胺用作主要能源。通常以比其它氨基酸更高的濃度(2-8mM)包含谷氨酰胺。然而，如上文中所指出的，谷氨酰胺可自發(fā)地分解以形成氨，并且某些細(xì)胞系更快地產(chǎn)生氨，而氨是有毒的。因此，谷氨酸和谷氨酰胺二肽已被用作谷氨酰胺的替代物來(lái)減少有毒的氨在細(xì)胞培養(yǎng)基中的積累。

b.氨基酸

氨基酸在細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)于維持培養(yǎng)的細(xì)胞的代謝功能是非常重要的。細(xì)胞培養(yǎng)基通常包含必需氨基酸(即，通常不能由哺乳動(dòng)物在體內(nèi)合成的那些氨基酸)以及某些非必需氨基酸。非必需氨基酸通常包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中，如果細(xì)胞系不能合成該氨基酸或如果細(xì)胞系不能產(chǎn)生足夠量的該氨基酸來(lái)支持最大生長(zhǎng)的話。示例生氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羥脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。

c.鹽

將鹽添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中以維持等滲條件和防止?jié)B透不平衡。標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度為約300mOsm/kg，雖然許多細(xì)胞系可耐受該值的約10％的變化。一些昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物的重量摩爾滲透壓濃度傾向于高于300mOsm/kg，其可以比300mOsm/kg高0.5％、1％、2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％。細(xì)胞培養(yǎng)基中最常用的鹽包括Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cl^-、SO₄^2-、PO₄^3-和HCO₃^-(例如，CaCl₂、KCl、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄)。因此，用于培養(yǎng)特定細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)基的期望的重量摩爾滲透壓濃度還可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的方法憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行確定。

d.無(wú)機(jī)元素

以痕量存在于血清中的其它無(wú)機(jī)元素可包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中，如US2005/0287666(其通過(guò)引用整體并入本文)中所描述的。它們包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。已被添加至細(xì)胞培養(yǎng)基的其它無(wú)機(jī)元素，雖然不經(jīng)常，包括Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和Zr。此類元素中有許多參與酶促活性。它們可以以鹽的形式例如CaCl₂、Fe(N03)₃、MgCl₂、MgSO₄、MnCl₂、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄，以及痕量元素例如硒、釩和鋅的離子形式提供。此類痕量元素可以以多種形式，優(yōu)選以鹽的形式例如Na₂SeO₃、NH₄VO₃等提供。此類無(wú)機(jī)鹽和痕量元素可以例如從Sigma(Saint Louis,Missouri)商購(gòu)獲得。

e.維生素

維生素通常被細(xì)胞用作輔因子。各種細(xì)胞系的維生素需求變化極大，然而，如果細(xì)胞培養(yǎng)基幾乎不包含或不包含血清或如果細(xì)胞以高密度生長(zhǎng)，則通常需要額外的維生素。示例性維生素包括生物素、氯化膽堿、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、D-Ca⁺⁺-泛酸鹽、吡哆醛、核黃素、硫胺素、吡多辛、煙堿酰胺、A、B₆、B₁₂、C、D₃、E、K和對(duì)-氨基苯甲酸(PABA)。

f.血清

血清，凝固的血液的上清液，可用于細(xì)胞培養(yǎng)基以提供促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或生產(chǎn)率的組分。此類血清組分包括粘附因子、微量營(yíng)養(yǎng)物(例如，痕量元素)、生長(zhǎng)因子(例如，激素、蛋白酶)和保護(hù)性元素(例如，抗毒素、抗氧化劑、抗蛋白酶)。血清可從多種動(dòng)物來(lái)源包括?；蜇i獲得。當(dāng)被包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，通常以5-10％的濃度添加血清。某些細(xì)胞培養(yǎng)基是不含血清的。

g.生長(zhǎng)因子

為了在血清不存在或血清減少的培養(yǎng)基中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，可將下列多肽的一種或多種添加至細(xì)胞培養(yǎng)基：例如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，包括酸性FGF和堿性FGF、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，包括TGFα和TGFβ、任何細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素1、2、6、粒細(xì)胞刺激因子、白細(xì)胞抑制因子(LIF)等。

在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含生長(zhǎng)因子。在不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中，可用鋅或含鋅化合物替代胰島素，如WO 98/08934(其通過(guò)引用整體并入本文)中描述的。

h.脂質(zhì)

還可將一種或多種脂質(zhì)添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。血清通常包含脂質(zhì)，例如脂肪酸(例如，亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、棕櫚油酸、油酸、多烯酸和/或脂肪酸(具有12、14、16、18、20或24個(gè)碳原子，每一個(gè)碳原子是分支或不分支的))、磷脂、卵磷脂(磷脂酰膽堿)和膽固醇?；蛘撸蓪⒋祟愔|(zhì)的一種或多種作為補(bǔ)充物包含在無(wú)血清培養(yǎng)基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些貼壁依賴性細(xì)胞例如MDCK、小鼠上皮細(xì)胞和其它腎細(xì)胞系的生長(zhǎng)，然而磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激人成纖維細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。還已顯示乙醇胺和膽固醇促進(jìn)某些細(xì)胞系的生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含脂質(zhì)。

i.載體蛋白質(zhì)

還可將一種或多種載體蛋白質(zhì)例如牛血清白蛋白(BSA)或轉(zhuǎn)鐵蛋白添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。載體蛋白質(zhì)可幫助某些營(yíng)養(yǎng)物或痕量元素的轉(zhuǎn)運(yùn)。BSA通常用作脂質(zhì)例如亞油酸和油酸(其在水溶液中是不溶性的)的載體。此外，BSA還可用作某些金屬例如Fe、Cu和Ni的載體。在無(wú)蛋白質(zhì)制劑中，可將非動(dòng)物來(lái)源的BSA替代物例如環(huán)糊精用作脂質(zhì)載體。轉(zhuǎn)鐵蛋白參與將鐵運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜。在某些情況下，人血清白蛋白可以是期望產(chǎn)生用于下游治療用途的產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)(例如無(wú)異物(XF)培養(yǎng))所必需的。在其它情況下，重組人血清白蛋白可用于細(xì)胞培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)細(xì)胞。在具體情況下，重組人血清白蛋白可來(lái)源于植物、藻類或真菌來(lái)源例如稻、玉米、馬鈴薯、小麥、甚至酵母等，以提供細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源(animal-origin free，AOF)培養(yǎng)。在無(wú)蛋白質(zhì)制劑中，可用高鐵和/或亞鐵鹽(如WO 98/08934(其通過(guò)引用整體并入本文)中所描述的)，或羥基吡啶衍生物(如US 2007/0254358(其通過(guò)引用整體并入本文)中所描述的)替代轉(zhuǎn)鐵蛋白。此外，在無(wú)蛋白質(zhì)制劑中，胰島素可用鋅、釩或其它適當(dāng)?shù)亩r(jià)鹽替代。

j.粘附蛋白

還可將一種或多種粘附蛋白例如纖連蛋白、層粘連蛋白和pronectin添加至細(xì)胞培養(yǎng)基以幫助促進(jìn)貼壁依賴性細(xì)胞至基底的附著。

k.緩沖劑

細(xì)胞培養(yǎng)基可任選地包括一種或多種緩沖劑。適當(dāng)?shù)木彌_劑包括但不限于N-[2-羥乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸鹽、碳酸氫鹽及適用于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的其它緩沖劑。適當(dāng)?shù)木彌_劑為提供緩沖能力而無(wú)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞的明顯細(xì)胞毒性的緩沖劑。適當(dāng)?shù)木彌_劑的選擇在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

l.聚陰離子或聚陽(yáng)離子化合物

聚陰離子或聚陽(yáng)離子化合物可阻止細(xì)胞團(tuán)聚并且促進(jìn)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。參見WO 98/08934，其通過(guò)引用整體并入本文。示例性聚陰離子化合物包括多磺化(polysulfonated)或多硫酸化(polysulfated)化合物例如肝素、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、多硫酸戊聚糖酯、蛋白聚糖等。

除了本文中描述的小肽或二肽外，細(xì)胞培養(yǎng)基還包含一種或多種成分，例如上文所列的成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含一種或多種小肽或一種或多種二肽(如上文中描述的)，且任選地包含下列成分的一種或多種：乙醇胺、D-葡萄糖、HEPES、胰島素、細(xì)胞因子(例如，IL-6)、肝素、硫酸葡聚糖、亞油酸、硫辛酸、酚紅、F68、腐胺、丙酮酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、生物素、氯化膽堿、D-Ca⁺⁺-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、吡多辛、核黃素、硫胺素、維生素B₁₂、一種或多種鈣鹽、Fe(NO₃)₃、KCl、一種或多種鎂鹽、一種或多種錳鹽、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、一種或多種硒鹽、一種或多種釩鹽以及一種或多種鋅鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種二肽選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X和半胱氨酸-X或其鹽，其中X為任意氨基酸，并且其中二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，X為丙氨酸或甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X為絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。

本文中描述的培養(yǎng)基可以為1X制劑或可被濃縮為任何大于1X的制劑，例如2X、5X、10X、20X、50X、500X或1000X培養(yǎng)基制劑，只要單獨(dú)的組分的溶解度允許。如果將單獨(dú)的培養(yǎng)基成分制備為單獨(dú)的濃縮液，則將適當(dāng)(充足)量的每一種濃縮物與稀釋劑組合以產(chǎn)生1X培養(yǎng)基制劑。通常，所使用的稀釋劑為水，但也可使用其它溶液，包括含水緩沖液、含水鹽溶液或其它水溶液。

還可以以不同的形式例如干粉培養(yǎng)基、顆粒制劑(其需要添加水，但不需要其它處理，例如調(diào)節(jié)pH)、液體培養(yǎng)基或以培養(yǎng)基濃縮物的形式來(lái)制備本文中描述的培養(yǎng)基。

3.無(wú)血清培養(yǎng)基

與血清相關(guān)的潛在問(wèn)題，包括批次間的變化、高蛋白質(zhì)含量、污染物(例如，病毒、支原體、朊病毒)的風(fēng)險(xiǎn)、有限的可獲得性和高成本，已驅(qū)動(dòng)無(wú)血清培養(yǎng)基的生產(chǎn)。此外，與在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中觀察到的表達(dá)水平相比，可從在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞獲得升高水平的重組蛋白質(zhì)表達(dá)(Battista,P.J.等人,Am.Biotech Lab.12:64-68(1994))。

在此類無(wú)血清培養(yǎng)基中，血清可用確定的激素或激素混合物例如HITES或ITES(其包含氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鹽)來(lái)替代?；蛘撸瑹o(wú)血清培養(yǎng)基可包含來(lái)自內(nèi)分泌腺的生長(zhǎng)因子提取物，例如表皮生長(zhǎng)因子或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。無(wú)血清培養(yǎng)基還可包含其它組分作為血清的替代物，包括純化的蛋白質(zhì)(動(dòng)物或重組的)、胨類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽和動(dòng)物或植物水解產(chǎn)物(或其級(jí)分)。

無(wú)血清培養(yǎng)基可以是化學(xué)成分明確的或不明確的。在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中，組分的身份及其量是已知的，然而對(duì)于化學(xué)成分不明確的培養(yǎng)基而言，情況則相反。因此，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基部分被設(shè)計(jì)用于減少污染物的風(fēng)險(xiǎn)和減少批次間的變化?？杀惶砑又良?xì)胞培養(yǎng)基中的化學(xué)成分確定的補(bǔ)充物包括生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白質(zhì)和/或粘附因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與包含小肽的培養(yǎng)基或給料一起使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含小肽的本發(fā)明的濃縮細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料也為化學(xué)成分明確的組合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含含有半胱氨酸和酪氨酸的小肽的本發(fā)明的濃縮給料或培養(yǎng)基為單部分給料并且為化學(xué)成分明確的。在另一個(gè)方面，包含含有半胱氨酸和酪氨酸的小肽的所有上述組合物為自動(dòng)-pH和自動(dòng)-重量摩爾滲透壓濃度平衡的。在另一個(gè)方面，包含含有半胱氨酸和酪氨酸的小肽的所有上述組合物是化學(xué)計(jì)量平衡的。

4.無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基

無(wú)血清培養(yǎng)基與含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基相比，包含減少量的蛋白質(zhì)。然而，無(wú)血清培養(yǎng)基可能仍然包含多種動(dòng)物來(lái)源的組分(包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素和其它蛋白質(zhì))中的一種或多種。蛋白質(zhì)的存在使得重組蛋白質(zhì)的純化變得非常困難，耗時(shí)和昂貴，并且還可導(dǎo)致減少的產(chǎn)物得率和/或純度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基不含蛋白質(zhì)。

可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如通過(guò)從無(wú)血清培養(yǎng)基中除去任何殘留的蛋白質(zhì)來(lái)獲得無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。雖然從細(xì)胞培養(yǎng)基中除去此類蛋白質(zhì)可削弱培養(yǎng)基支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，但可將其它組分添加至培養(yǎng)基以緩解從培養(yǎng)基中除去蛋白質(zhì)的影響。例如，如上所論述的，環(huán)糊精可替代BSA，鐵鹽或羥基吡啶衍生物可替代轉(zhuǎn)鐵蛋白。在其它情況下，動(dòng)物組織或植物水解產(chǎn)物(或其級(jí)分)已被用于補(bǔ)充無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。

5.分批補(bǔ)料培養(yǎng)(Fed-Batch Cultivation)

細(xì)胞的分批補(bǔ)料培養(yǎng)通常用于生物分子例如蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)，以增加細(xì)胞濃度和延長(zhǎng)培養(yǎng)期限，獲得高產(chǎn)物濃度和容積生產(chǎn)率(volumetric productivity)。分批補(bǔ)料培養(yǎng)包括，以可包含被細(xì)胞快速利用的營(yíng)養(yǎng)物例如葡萄糖、氨基酸的給料的形式將一種或多種營(yíng)養(yǎng)物受控地添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)嘗試防止?fàn)I養(yǎng)物耗盡和副產(chǎn)物積累，使重要參數(shù)例如pH、重量摩爾滲透壓濃度和CO₂濃度在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或最小化細(xì)胞死亡(以進(jìn)行最佳產(chǎn)物表達(dá))的水平內(nèi)來(lái)幫助控制細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,349-386(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。盡管如此，分批補(bǔ)料培養(yǎng)通常導(dǎo)致最終與細(xì)胞生存不相容的高濃度的抑制性代謝產(chǎn)物和高重量摩爾滲透壓濃度。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的維持，并且可包括許多成分，包括氨基酸、維生素、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽、糖和其它組分，每一種成分以支持細(xì)胞體外培養(yǎng)的量存在。用于原核細(xì)胞培養(yǎng)包括細(xì)菌和古細(xì)菌(archebacterial)培養(yǎng)、病毒培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可與小肽一起使用?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括伊格爾基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)、伊格爾最小必需培養(yǎng)基(Eagle's minimal essential medium，EMEM)、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM)、格拉斯哥改良伊格爾培養(yǎng)基(Glasgow's modification of Eagle's medium，GMEM)、Joklik's改良伊格爾培養(yǎng)基、阿爾法改良伊格爾培養(yǎng)基(Alpha modified Eagle's medium)、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養(yǎng)基、Fischer's培養(yǎng)基、Leibovitz L-15培養(yǎng)基、Trowell's T-8培養(yǎng)基、Williams'培養(yǎng)基E、Biggers'培養(yǎng)基、Connaught Medical Research Laboratories(CMRL)1066培養(yǎng)基、Ham's F10培養(yǎng)基、Ham's F12培養(yǎng)基、Iscove'改良達(dá)爾伯克培養(yǎng)基(IMDM)、MCDB 104、MCDB 110、MCDB 153、培養(yǎng)基199、NCTC 135培養(yǎng)基和Waymouth's培養(yǎng)基MB 752/1。對(duì)于CHO細(xì)胞，優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括CD CHO、CD OptiCHO^TM和CD FortiCHO^TM(全都來(lái)自Life Technologies,Corp.,Carlsbad,CA)。CHO細(xì)胞的優(yōu)選濃縮補(bǔ)料包括但不限于CHO CD EfficientFeed^TM A(Invitrogen Cat.No.A1023401)、CHO CD EfficientFeed^TM B(Invitrogen Cat.No.A1024001)、CHO CD EfficientFeed^TM試劑盒(Invitrogen Cat.No.A1024101)、CD EfficientFeed^TM C AGT^TM(Invitrogen Cat.No.A1327501,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)。

在分批補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞通常使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基以分批模式生長(zhǎng)至某個(gè)時(shí)間點(diǎn)。隨后，添加包含單個(gè)或多個(gè)營(yíng)養(yǎng)物的濃縮液的培養(yǎng)基補(bǔ)充物(濃縮給料)以提供營(yíng)養(yǎng)物，同時(shí)使體積增加或培養(yǎng)物稀釋減小至最小。當(dāng)將培養(yǎng)基補(bǔ)充物添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)，如例如通過(guò)更快速的細(xì)胞生長(zhǎng)、減少的倍增時(shí)間、更高的細(xì)胞可達(dá)到的密度或更高的生物分子(例如蛋白質(zhì)例如抗體或其它具有治療益處的蛋白質(zhì))的產(chǎn)量或產(chǎn)率所顯示的。

適用于補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料包含一種或多種小肽(包括一種或多種二肽)，如本文中所描述的。包含半胱氨酸和酪氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料可以任選地與另一種給料，比如說(shuō)氨基酸的濃縮混合物結(jié)合使用，所述混合物可包含下列成分的一種或多種：腺嘌呤、乙醇胺、碳水化合物源(例如己糖如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或甚至其組合)、肝素、緩沖劑、氫化可的松、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲腺氨酸(tri-iodothyronine)、胸苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-羥基脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、N-乙?；?半胱氨酸、生物素、氯化膽堿、D-Ca⁺⁺-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、吡多辛、核黃素、硫胺素、維生素B₁₂、Pluronic F68、重組胰島素、鈣鹽、CuSO₄、FeSO₄、FeCl₃、Fe(NO₃)₃、KCl、鎂鹽、錳鹽、醋酸鈉、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、Na₂SO₄、硒鹽、硅鹽、鉬鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽、ZnCl₂、ZnSO₄或其它鋅鹽。

因此，用于補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氨基酸的濃縮混合物可由氨基酸的化學(xué)計(jì)量平衡的混合物組成，可以包含或可以不包含半胱氨酸和酪氨酸，并且可任選地包含如下物質(zhì)的一種或多種：碳源、維生素、痕量元素，并且還可以是化學(xué)成分明確的，其不包含任何脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或生長(zhǎng)因子。在一些情況下，氨基酸的濃縮混合物可包含非動(dòng)物源水解產(chǎn)物或水解產(chǎn)物的級(jí)分，例如植物水解產(chǎn)物?？墒褂萌魏紊藤?gòu)可得的氨基酸的濃縮混合物，例如，CHO CD EfficientFeed^TM A(Invitrogen Cat.No.A1023401)、CHO CD EfficientFeed^TM B(Invitrogen Cat.No.A1024001)、CHO CD EfficientFeed^TM試劑盒(Invitrogen Cat.No.A1024101)、CD EfficientFeed^TM C AGT^TM(Invitrogen Cat.No.A1327501,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，適用于補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基的包含半胱氨酸和酪氨酸的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料不含蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，適用于補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料不含蛋白質(zhì)，并且額外地不包含脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分、或生長(zhǎng)因子，從而被認(rèn)為是化學(xué)成分明確的(CD)。在本實(shí)施方案的一個(gè)方面，包含半胱氨酸和酪氨酸的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基或濃縮給料可任選地包含如下物質(zhì)的一種或多種：碳源、維生素、痕量元素，并且還可以是化學(xué)成分明確的，其不包含任何脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或生長(zhǎng)因子。

6.細(xì)胞

還可將本文中描述的包含含有半胱氨酸和酪氨酸的小肽或二肽的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)各種細(xì)胞。使用本文中描述的培養(yǎng)基和給料培養(yǎng)的細(xì)胞可來(lái)源于任何原核生物包括古細(xì)菌、藻類、酵母、真菌、植物、昆蟲、動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物和最優(yōu)選小鼠或人。在一個(gè)實(shí)施方案中，將培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真核細(xì)胞，包括植物或動(dòng)物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞。

可用本文中描述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括原代上皮細(xì)胞(例如，角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞)和已建立的細(xì)胞系及其株系(例如，293胚腎細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa宮頸上皮細(xì)胞和PER-C6視網(wǎng)膜細(xì)胞、MDBK(NBL-1)細(xì)胞、911細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BeWo細(xì)胞、Chang細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞、HeLa 229細(xì)胞、HeLa S3細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞、KB細(xì)胞、LS180細(xì)胞、LS174T細(xì)胞、NCI-H-548細(xì)胞、RPMI 2650細(xì)胞、SW-13細(xì)胞、T24細(xì)胞、WI-28VA13,2RA細(xì)胞、WISH細(xì)胞、BS-C-I細(xì)胞、LLC-MK₂細(xì)胞、Clone M-3細(xì)胞、1-10細(xì)胞、RAG細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、Y-1細(xì)胞、LLC-PK₁細(xì)胞、PK(15)細(xì)胞、GH₁細(xì)胞、GH₃細(xì)胞、L2細(xì)胞、LLC-RC 256細(xì)胞、MH₁C₁細(xì)胞、XC細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、VSW細(xì)胞和TH-I,B1細(xì)胞或其衍生物)、來(lái)自任何組織或器官的成纖維細(xì)胞(包括但不限于心臟、肝、腎、結(jié)腸、腸、食道、胃、神經(jīng)組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)血管)、淋巴組織(淋巴腺、腺組織、扁桃體、骨髓和血液)、脾和成纖維細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系(例如，CHO細(xì)胞、TRG-2細(xì)胞、IMR-33細(xì)胞、Don細(xì)胞、GHK-21細(xì)胞、瓜氨酸血癥細(xì)胞、Dempsey細(xì)胞、Detroit 551細(xì)胞、Detroit 510細(xì)胞、Detroit 525細(xì)胞、Detroit 529細(xì)胞、Detroit 532細(xì)胞、Detroit 539細(xì)胞、Detroit 548細(xì)胞、Detroit 573細(xì)胞、HEL 299細(xì)胞、IMR-90細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、WI-26細(xì)胞、MiCl₁細(xì)胞、CHO細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、COS-3細(xì)胞、COS-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞、DBS-FrhL-2細(xì)胞、BALB/3T3細(xì)胞、F9細(xì)胞、SV-T2細(xì)胞、M-MSV-BALB/3T3細(xì)胞、K-BALB細(xì)胞、BLO-11細(xì)胞、NOR-10細(xì)胞、C₃H/IOTI/2細(xì)胞、HSDM₁C₃細(xì)胞、KLN₂O₅細(xì)胞、McCoy細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、株系2071(小鼠L)細(xì)胞、L-M株(小鼠L)細(xì)胞、L-MTK^-(小鼠L)細(xì)胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1細(xì)胞、Swiss/3T3細(xì)胞、印度黃麂細(xì)胞、SIRC細(xì)胞、C_II細(xì)胞和Jensen細(xì)胞、Sp2/0、NS0、NS1細(xì)胞或其衍生物)。

根據(jù)本文中公開的方法培養(yǎng)的細(xì)胞可以為正常細(xì)胞、患病細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、突變體細(xì)胞、體細(xì)胞、基因工程改造的細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，任何所述細(xì)胞可以是已建立的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系或獲自天然來(lái)源。細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛴糜诋a(chǎn)生有用的組分。在某些情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞本身為產(chǎn)物，細(xì)胞用于細(xì)胞療法。還可培養(yǎng)細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)產(chǎn)生，包括抗體產(chǎn)生，小RNA產(chǎn)生(如miRNA或siRNA)，病毒或VLP(病毒樣顆粒)產(chǎn)生，DNA或病毒載體的產(chǎn)生和分離，核酸產(chǎn)生，維生素產(chǎn)生，期望的代謝產(chǎn)物，生物燃料合成等。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文中描述的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。CHO細(xì)胞已被分類為來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮和成纖維細(xì)胞。始于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞系(CHO-K1)(Kao,F.-T.和Puck,T.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60:1275-1281(1968)已培養(yǎng)多年。目前，大多數(shù)生物制藥公司因?yàn)樵S多有利方面(細(xì)胞系具有精確的翻譯后修飾例如人樣糖基化模式和低風(fēng)險(xiǎn)的人病毒傳播)而在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

7.細(xì)胞的培養(yǎng)

可按照研究者確定的實(shí)驗(yàn)條件培養(yǎng)由本文中描述的培養(yǎng)基支持的細(xì)胞。下文中的實(shí)施例顯示，用于培養(yǎng)某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的有功能的至少一組培養(yǎng)條件。然而，應(yīng)理解，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定給定的動(dòng)物細(xì)胞類型的最佳涂鋪和培養(yǎng)條件。關(guān)于常規(guī)單層培養(yǎng)條件，可通過(guò)使用本文中描述的細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞涂鋪在無(wú)粘附因子的培養(yǎng)容器的表面上?；蛘?，可用天然的、重組的或合成的粘附因子或肽片段(例如，膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白等，或其天然或合成的片段)預(yù)包被容器，所述粘附因子或肽片段可例如從LifeTechnologies,Corp.(Carlsbad,CA)、R&D Systems,Inc.(Rochester,Minnesota)、Genzyme(Cambridge,Massachusetts)和Sigma(St.Louis,Missouri)商購(gòu)獲得。還可將細(xì)胞接種至天然或合成的三維支持基質(zhì)例如預(yù)制膠原凝膠或合成的生物聚合物材料中或其上。對(duì)于懸浮培養(yǎng)，通常將細(xì)胞懸浮于本文中描述的培養(yǎng)基中，并且導(dǎo)入促進(jìn)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)容器例如旋轉(zhuǎn)瓶、灌注器或生物反應(yīng)器。參見Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,156-174(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。在一些情況下，培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的一定水平的攪拌是必需的?？蓪嚢杞抵磷畹统潭纫员苊馀囵B(yǎng)基組分的變性和培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的剪切。

可針對(duì)所使用的特定培養(yǎng)條件最優(yōu)化每一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)胞接種密度。對(duì)于塑料培養(yǎng)容器中的常規(guī)單層培養(yǎng)，1-5x10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的初始接種密度可以是優(yōu)選的，然而對(duì)于懸浮培養(yǎng)，可使用更高的接種密度(例如，5-20x10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)。

通常將哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，優(yōu)選在約37℃(但其可以是30℃與39℃之間的任何溫度)下。非哺乳動(dòng)物細(xì)胞可具有其它優(yōu)選的培養(yǎng)溫度?？芍鸩竭M(jìn)行哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，例如在一個(gè)溫度下進(jìn)行最佳細(xì)胞生長(zhǎng)，而在另一個(gè)溫度下進(jìn)行最佳蛋白質(zhì)/肽/片段或病毒的產(chǎn)生。培養(yǎng)箱大氣可以是潮濕的并且其可在空氣中含約3-10％的二氧化碳，更優(yōu)選在空氣中包含約5-10％的二氧化碳，最優(yōu)選在空氣中包含約3-8％的二氧化碳，盡管某些細(xì)胞系的培養(yǎng)可能在空氣中需要多至20％的二氧化碳來(lái)獲得最佳結(jié)果。取決于細(xì)胞類型，細(xì)胞培養(yǎng)基pH可在例如約6-8.5，優(yōu)選約7.1至7.6，或優(yōu)選約7.1至7.4，或更優(yōu)選約7.1至7.3或優(yōu)選約6-6.3(對(duì)于昆蟲細(xì)胞)的范圍內(nèi)。

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約1.5-2.0x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度時(shí)，閉合培養(yǎng)或分批培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)經(jīng)歷完全培養(yǎng)基更換(即，用新鮮培養(yǎng)基替代消耗的培養(yǎng)基)。灌注培養(yǎng)中(例如，生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中)的細(xì)胞將以連續(xù)再循環(huán)的方式接受新鮮培養(yǎng)基。

8.病毒的產(chǎn)生

除了以懸浮或單層培養(yǎng)形式培養(yǎng)細(xì)胞外，本發(fā)明的培養(yǎng)基還可用于從哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生病毒的方法。此類方法包括(a)在適合于促進(jìn)病毒感染細(xì)胞的條件下將細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)與病毒接觸；和(b)在適合于促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生病毒的條件下在本文中描述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。可在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞之前、期間或之后將細(xì)胞與病毒接觸。用病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳方法是本領(lǐng)域公知的，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。與在除本文中描述的細(xì)胞培養(yǎng)基之外的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在本文中描述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可預(yù)期產(chǎn)生更高的病毒滴度(例如，2、3、5、10、20、25、50、100、250、500或1000倍的滴度)。

此類方法可用于產(chǎn)生各種哺乳動(dòng)物病毒或適合于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒、病毒樣顆粒和病毒載體，包括但不限于腺病毒及其衍生物、腺伴隨病毒及其衍生物、逆轉(zhuǎn)錄病毒及其衍生物、慢病毒及其衍生物、昆蟲病毒如桿狀病毒及其衍生物、仙臺(tái)病毒及其衍生物等。在本文中描述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細(xì)胞后，使用的包含病毒(其可以是重組病毒、病毒載體、病毒顆粒或其組分(蛋白質(zhì)和/或核酸(DNA和/或RNA)))的培養(yǎng)基可用于各種目的，包括疫苗產(chǎn)生、抑制性RNA分子如miRNA、siRNA等的產(chǎn)生、用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染或基因療法的病毒載體的產(chǎn)生、動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物的感染、病毒蛋白質(zhì)和/或核酸的研究等。或者任選地，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于蛋白質(zhì)和/或核酸分離的技術(shù)，從使用的培養(yǎng)基中分離病毒、病毒載體、病毒顆粒或其組分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生VLP?！癡LP”或“病毒樣顆粒”為用于將一種或多種化合物包括生物學(xué)材料例如脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)和核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)的載體。可利用VLP遞送的其它化合物包括染料(例如，熒光染料)、標(biāo)記(例如，熒光或放射性標(biāo)記)和藥物(例如，抗生素或抗病毒劑)。VLP通常包含至少一種病毒蛋白質(zhì)。通常，病毒蛋白質(zhì)包圍化合物。然而，在具體情況下，除了包含在VLP中外，還可利用其它方法將待遞送的化合物與VLP結(jié)合。例如，可將化合物連接(例如，共價(jià)地或非共價(jià)地連接)于病毒蛋白質(zhì)，或可將其整合入包膜(當(dāng)存在時(shí))。在一個(gè)方面，可將VLP與各種類型的核酸(例如，異源核酸)例如DNA、RNA、RNA和DNA、或RNA/DNA雜交體或本領(lǐng)域已知的衍生物結(jié)合。VLP的實(shí)例包括，使用VIRAPOWER^TM腺病毒和慢病毒載體試劑盒(參見，例如，Invitrogen Corporation,cat.nos.K4930-00、K4940-00、K4950-00、K4955-00、K4960-00、K4965-00、K4967-00和K4985-00)產(chǎn)生的病毒顆粒產(chǎn)物。

可用于制備VLP的病毒包括例如，噬菌體(例如，T偶噬菌體(例如，T4噬菌體等)、T奇噬菌體(例如，T7噬菌體等)、噬菌體phi29、λ噬菌體等)、桿狀病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒(例如，Moloney鼠白血病病毒、HIV1、HTLV-III等)、仙臺(tái)病毒、痘病毒和甲病毒(例如，西門利克森林病毒(Semliki Forest Virus)、辛德比斯病毒(SindBisVirus)等)?？捎糜谥苽銿LP的病毒的其它實(shí)例以及用于制備VLP的方法描述于本文中的其它地方。

9.重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生

本培養(yǎng)基還可用于從上述細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別地懸浮生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法中。因?yàn)楸景l(fā)明的培養(yǎng)基提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞的快速高密度懸浮培養(yǎng)，因此本方法有利于增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)意指全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、肽、切割的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、交聯(lián)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、標(biāo)記的肽或蛋白質(zhì)等。蛋白質(zhì)還指所有類型的天然和改變的蛋白質(zhì)，包括重組蛋白質(zhì)、突變體蛋白質(zhì)、工程改造的蛋白質(zhì)、嵌合蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、活性蛋白質(zhì)、加工的蛋白質(zhì)等。蛋白質(zhì)可由細(xì)胞或細(xì)胞系天然表達(dá)，或可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程方法對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行工程改造以表達(dá)其，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔等?？蓪⑺玫牡鞍踪|(zhì)或肽純化或分離至期望的純度水平。可使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或給料組合物產(chǎn)生或表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽或其片段包括但不限于，細(xì)胞外蛋白質(zhì)如層粘連蛋白、纖連蛋白、整聯(lián)蛋白等，酶如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶、蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、激酶、RNA酶、DNA酶等，肽激素如胰島素、PTHrP等，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)包括膜蛋白、受體、核蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白等，抗體，任何抗體片段如抗體的重鏈或輕鏈、抗原結(jié)合位點(diǎn)或基序、嵌合抗體等。嵌合抗體可以是物種間嵌合抗體或類型間嵌合抗體。可使用本發(fā)明的組合物和培養(yǎng)基/給料產(chǎn)生的表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可以為人或哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)序列，所述蛋白質(zhì)序列在非動(dòng)物細(xì)胞系如植物細(xì)胞中表達(dá)，以產(chǎn)生用于下游治療用途的不含動(dòng)物源的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)不含偶生試劑(adventitious agent)。

根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生多肽的方法包括，在適合于細(xì)胞表達(dá)多肽的條件下在本文中描述的含有小肽或二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)歷基因工程改造以產(chǎn)生多肽的細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。用于基因工程改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)目標(biāo)多肽的最佳方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且從而是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如，Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,15-40(Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)?？稍诒景l(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，或可在被置于所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后用一種或多種外源核酸分子轉(zhuǎn)染它們。可按照上述方法將基因工程改造的細(xì)胞在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)為單層培養(yǎng)物，或更優(yōu)選培養(yǎng)為懸浮培養(yǎng)物。在培養(yǎng)細(xì)胞后，可任選地按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)分離技術(shù)從細(xì)胞和/或使用的培養(yǎng)基中純化目標(biāo)多肽。

10.在培養(yǎng)基中或濃縮給料中檢測(cè)小肽

可使用本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)氨基酸和/或小肽的任何技術(shù)檢測(cè)本文中描述的小肽和二肽，所述技術(shù)包括但不限于酸水解、液相色譜、毛細(xì)管電泳(Brown等人,J.Chrom.(1994)A,661:279-285)、HPLC(van Wandelen等人,J.Chrom.(1997)A,763:11-22)或質(zhì)譜法。用于氨基酸組成和濃度的色譜分析的肽的酸水解在本領(lǐng)域是公知的。酸水解之前和之后的氨基酸峰的色譜圖譜的比較可指示培養(yǎng)基、給料或補(bǔ)充物中氨基酸和從而小肽的組成和濃度。例如，如果酪氨酸存在于培養(yǎng)基中的小肽中，則與酸水解前的相同培養(yǎng)基樣品的峰高度/面積相比，其濃度在培養(yǎng)基樣品的酸水解產(chǎn)物中增加(例如，酪氨酸的峰高度和/或峰面積)。

例如，使用Wandelen等人,J.Chrom.(1997)A,763:11-22中描述的方法檢測(cè)本文中描述的丙氨酰酪氨酸和丙氨酰半胱氨酸二肽，所述方法包括在AccQ-Tag Ultra^TM(Waters Corp.,Milford,MA)柱(2.1x100mm,1.7μm)上HPLC(高效液相色譜)分離6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)-衍生化的氨基酸混合物。如下設(shè)置檢測(cè)器參數(shù)：波長(zhǎng)模式：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)；波長(zhǎng)：260nm；取樣速度：20(點(diǎn)/秒)；時(shí)間常數(shù)：0.4000(秒)。通過(guò)使用這些參數(shù)，在示例性運(yùn)行中，丙氨酰酪氨酸二肽樣品具有約6.172分鐘的峰洗脫時(shí)間(參見圖2)，正好在內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(AABA)之后；在另一個(gè)示例性運(yùn)行中，丙氨酰半胱氨酸二肽樣品具有6.631分鐘的峰洗脫速率，在賴氨酸與酪氨酸之間(參見圖3)。

因此，該利用超高效液相色譜(UPLC)法的AccQ-Tag^TM Ultra(Waters Corp.,Milford,MA)Pre-Column Derivatization提供了一種這樣的方法，其測(cè)試任何樣品培養(yǎng)基或補(bǔ)料以觀察其是否包含含有半胱氨酸或酪氨酸的小肽，例如二肽丙氨酰酪氨酸或丙氨酰半胱氨酸。相同的方法還可用于檢測(cè)其它小肽，包括其它目標(biāo)二肽。

此外，本文中描述的二肽還可使用液相色譜伴質(zhì)譜檢測(cè)(LC/MS)進(jìn)行定量。利用偶聯(lián)至四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(SYNAPT^TM HDMS^TM System,Milford,MA)的反相液相色譜柱(AcquityHSS T3 1.8-μm,2.1-mm i.d x 150-mm，于40℃)進(jìn)行分離。全氟化羧酸(例如，全氟戊酸)用作離子配對(duì)劑用于極性化合物的最佳分離(Jun Qu,Yiming Wang,Guan Luo,Zhuping Wu和Chengdui Yang,Anal.Chem.,2002,74,2034-2040；通過(guò)引用整體并入本文)。流動(dòng)相-A為水中的0.1％甲酸和0.05％全氟戊酸，流動(dòng)相-B為80％乙腈中的0.1％甲酸和0.05％全氟戊酸。所有試劑均為L(zhǎng)C/MS級(jí)的。超高效液相色譜(UPLC)梯度在1-45％的流動(dòng)相-B上為線性的，以0.4-mL/分鐘的流速進(jìn)行15分鐘。以連續(xù)正電噴射(+ES)和V-模式在70-1000Da內(nèi)每0.5秒收集質(zhì)譜。從總離子色譜提取質(zhì)子化的L-丙氨酰-L-半胱氨酸二聚體和質(zhì)子化的L-丙氨酰-L-酪氨酸離子，其分別為383.105(±0.03)Da和253.118(±0.03)Da。質(zhì)子化的L-丙氨酰-L-半胱氨酸二聚體和質(zhì)子化的L-丙氨酰-L-酪氨酸離子的滯留時(shí)間分別為9.60(±0.03)分鐘和8.75(±0.03)分鐘(圖4至7)。

除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。在矛盾的情況下，以本說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯然的是，可對(duì)本文中描述的方法和應(yīng)用進(jìn)行其它適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)和改變，而不背離本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的范圍。此外，材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而無(wú)意為限定性的。本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考資料通過(guò)引用整體并入本文。

實(shí)施例1:包含二肽的培養(yǎng)基的產(chǎn)生

制備包含二肽丙氨酰酪氨酸(AlaTyr)和丙氨酰半胱氨酸(其形成二硫化物二聚體[AlaCys]₂)的示例性細(xì)胞培養(yǎng)基。具體地，將二肽，丙氨酰酪氨酸和丙氨酰半胱氨酸作為干粉添加至包含葡萄糖和濃縮氨基酸混合物的含水基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中，將其混合直至溶解。將丙氨酰酪氨酸以約4.0g/L的濃度添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。將丙氨酰半胱氨酸以約3.0g/L的濃度添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。二肽在水中的觀察的溶解度經(jīng)測(cè)定為約15.4g/L(對(duì)于AlaTyr)，大于100g/L(對(duì)于AlaCys)以及約8.7g/L(對(duì)于[AlaCys]₂二聚體)。作為比較，L-酪氨酸在水中的溶解度在20℃為約0.38g/L。游離L-半胱氨酸易于被氧化成胱氨酸。鹽酸L-半胱氨酸在酸性水溶液中穩(wěn)定得多，但在中性或堿性水溶液中，其也通過(guò)需氧氧化轉(zhuǎn)變成L-胱氨酸。L-胱氨酸在水中的溶解度在25℃為約0.11g/L。

實(shí)施例2:分批補(bǔ)料測(cè)試

使用產(chǎn)生IgG的CHO細(xì)胞進(jìn)行綜合分批補(bǔ)料測(cè)試，所述細(xì)胞生長(zhǎng)在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基CD FortiCHO^TM(Invitrogen Cat.No.A-1148301和Custom Stock A-11437DK；Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)中并且補(bǔ)充以葡萄糖(CD FortiCHO^TM+葡萄糖；圖1:具有實(shí)心方塊的曲線和正斜杠-填充條塊)，或補(bǔ)充以具有低水平的半胱氨酸或酪氨酸的濃縮氨基酸混合物與葡萄糖+實(shí)施例1中描述的包含二肽(DP)的培養(yǎng)基或給料的混合物(CD FortiCHO^TM+aa+DP給料FP2和FP3；參見圖1：(FP2)具有實(shí)心圓的曲線和空心條塊(FP3)具有實(shí)心菱形的曲線和反斜杠-填充的條塊)。圖1中的“aa”是指具有低水平的半胱氨酸或酪氨酸的濃縮氨基酸混合物與葡萄糖的混合物。

研究的其它基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為CD OptiCHO^TM,CD CHO；全部來(lái)自Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA(數(shù)據(jù)未顯示)。所使用的優(yōu)選培養(yǎng)基為CD FortiCHO^TM。示例性濃縮氨基酸混合物為例如CHO CD EfficientFeed^TM A(Invitrogen Cat.No.A1023401)、CHO CD EfficientFeed^TM B(Invitrogen Cat.No.A1024001)、CHO CD Efficient Feed^TM試劑盒(Invitrogen Cat.No.A1024101)、CD Efficient Feed^TM C AGT^TM(Custom Stock A-11525SA,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基或補(bǔ)料中的包含半胱氨酸和酪氨酸的小肽經(jīng)設(shè)計(jì)用于與適合于生長(zhǎng)期望的細(xì)胞類型的任何示例性基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基一起使用，所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基具有任何示例性化學(xué)計(jì)量平衡的濃縮氨基酸混合物(aa)，任選地具有葡萄糖、維生素、痕量元素等，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)斷定。

將細(xì)胞生長(zhǎng)在具有500mL工作體積的DasGip生物反應(yīng)器中，使用7.0+/-0.05的pH控制設(shè)置點(diǎn)和30％的pO2控制設(shè)置點(diǎn)。每當(dāng)葡萄糖水平達(dá)到2g/L時(shí)，就給補(bǔ)充有葡萄糖的CHO細(xì)胞自動(dòng)飼喂3g/L的葡萄糖。將補(bǔ)充有二肽(DP)的CHO細(xì)胞經(jīng)歷兩個(gè)給料方案。在第一給料方案中(參見圖1，紅色曲線和條塊:FP2)，從第4天至第13天每天給CHO細(xì)胞飼喂2％的含二肽的培養(yǎng)基。在第二方案中，(參見圖1，綠色曲線和條塊:FP3)，從第5天至第14天每天給CHO細(xì)胞飼喂2％的含二肽的培養(yǎng)基。

與基于CD Opti CHO^TM(Life Technologies,Corp.,Carlsbad,CA)或CD CHO(Life Technologies,Corp.,Carlsbad,CA Carlsbad,CA)的分批補(bǔ)料法(數(shù)據(jù)未顯示)相比，生長(zhǎng)在CD FortiCHO^TM培養(yǎng)基中并且補(bǔ)充有葡萄糖的細(xì)胞具有相當(dāng)?shù)幕蚋玫腎gG生產(chǎn)率(1600mg/L)。與第15天時(shí)的CD FortiCHO^TM+葡萄糖的約1600mg/L的IgG滴度相比，生長(zhǎng)在CD FortiCHO^TM中且補(bǔ)充有濃縮氨基酸和實(shí)施例1的包含二肽的培養(yǎng)基的CHO細(xì)胞在12天后具有增強(qiáng)的活力和倍增的生產(chǎn)率水平，到第15天時(shí)具有約3200mg/L的IgG滴度(圖1)。在用于CD FortiCHO^TM+aa+二肽(DP)給料的兩個(gè)給料方案中，兩者都運(yùn)行良好并且顯示相當(dāng)?shù)腎gG生產(chǎn)水平。FP3方案與FP2相比，具有更好地維持的葡萄糖水平和更恒定的IgG生產(chǎn)水平，而FP2方案促進(jìn)更高的峰細(xì)胞密度。值得注意的是，包含二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基以顯著減小的體積給料比例產(chǎn)生增加的細(xì)胞密度和生產(chǎn)率水平，從而提供了使用本文中描述的包含二肽的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一個(gè)有利方面。

包含二肽丙氨酰酪氨酸和丙氨酰半胱氨酸的液體細(xì)胞培養(yǎng)基或給料溶液可于2-8℃下貯存，保持無(wú)沉淀10個(gè)月以上，從而對(duì)于這樣的濃縮液顯示了比預(yù)期顯著更高的液體穩(wěn)定性。

本文中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和公開的參考資料通過(guò)引用整體并入本文。雖然已參考優(yōu)選實(shí)施方案具體地顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可對(duì)其中的形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種改變，而不背離由所附權(quán)利要求包括的本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的實(shí)施方案如下：

1.包含至少一種小肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述小肽包含至少2個(gè)氨基酸，其中至少一個(gè)氨基酸為半胱氨酸或酪氨酸。

2.實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述小肽的其余氨基酸中的至少一個(gè)選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

3.實(shí)施方案2的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述小肽的其余氨基酸中的至少一個(gè)為丙氨酸或甘氨酸。

4.實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中至少一種所述小肽是選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X和半胱氨酸-X或其鹽的二肽，并且其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，和/或，和其中一種或多種小肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。

5.實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中X為丙氨酸或甘氨酸。

6.實(shí)施方案1-5的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為液體溶液。

7.實(shí)施方案1-5的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為干粉或顆粒性干粉。

8.實(shí)施方案1-7的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包含碳水化合物和氨基酸或其鹽。

9.實(shí)施方案8的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述碳水化合物為己糖。

10.實(shí)施方案8或9的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述氨基酸或其鹽為精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種。

11.實(shí)施方案1-10的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包含維生素、鹽、緩沖劑或無(wú)機(jī)元素。

12.實(shí)施方案1-11的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基不包含脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分、或生長(zhǎng)因子。

13.實(shí)施方案1-12的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基不包含蛋白質(zhì)。

14.實(shí)施方案1-13的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基被濃縮為2X或更濃的制劑。

15.實(shí)施方案4-14的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一種或多種二肽為丙氨酰酪氨酸，和/或丙氨酰半胱氨酸，和/或丙氨酰胱氨酸二聚體。

16.實(shí)施方案4-6或8-14的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一種或多種二肽以約1g/L至約16g/L的濃度存在。

17.實(shí)施方案4-6或8-14的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一種或多種二肽以約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在。

18.實(shí)施方案6或8-17的任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中于2-8℃下貯存的液體溶液保持無(wú)沉淀12個(gè)月以上。

19.一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括在支持細(xì)胞的培養(yǎng)的條件下將所述細(xì)胞與基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基接觸，和用實(shí)施方案1-18的任一項(xiàng)的濃縮給料或培養(yǎng)基補(bǔ)充所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。

20.實(shí)施方案19的方法，其中在超過(guò)一天上，用濃縮給料或培養(yǎng)基補(bǔ)充所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。

21.實(shí)施方案20的方法，其中從開始細(xì)胞培養(yǎng)后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天開始，用濃縮給料或培養(yǎng)基補(bǔ)充所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，以及之后每天進(jìn)行所述補(bǔ)充，直至第13或14天。

22.實(shí)施方案19-21的任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的補(bǔ)充為約1-10％或約5-20％的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的總起始體積。

23.實(shí)施方案19-22的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞為動(dòng)物、植物、昆蟲、禽類、酵母、藻類或魚類細(xì)胞。

24.實(shí)施方案22的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白或其片段。

25.實(shí)施方案24的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生超過(guò)3000mg/L的免疫球蛋白或其片段。

26.一種制備細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，包括將一種或多種小肽與碳水化合物和至少一種氨基酸或其鹽組合，其中所述一種或多種小肽的每一種包含半胱氨酸或酪氨酸。

27.實(shí)施方案26的方法，其中所述一種或多種小肽的除半胱氨酸或酪氨酸外的氨基酸，選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸。

28.實(shí)施方案27的方法，其中所述一種或多種小肽的除半胱氨酸或酪氨酸外的氨基酸為丙氨酸或甘氨酸。

29.實(shí)施方案26的方法，其中所述一種或多種小肽為選自X-酪氨酸、X-半胱氨酸、酪氨酸-X,或半胱氨酸-X或其鹽的一種或多種二肽，其中X選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸或谷氨酸，并且其中所述一種或多種二肽的N-末端氨基酸具有游離氨基。

30.實(shí)施方案29的方法，其中X為丙氨酸或甘氨酸。

31.實(shí)施方案26-30的任一項(xiàng)的方法，其中所述碳水化合物為葡萄糖。

32.實(shí)施方案26-31的任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種氨基酸或其鹽為精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種。

33.實(shí)施方案26-32的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含維生素、鹽、緩沖劑或無(wú)機(jī)元素。

34.實(shí)施方案26-33的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基不包含脂質(zhì)、水解產(chǎn)物或其級(jí)分、或生長(zhǎng)因子。

35.實(shí)施方案26-34的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基不包含蛋白質(zhì)。

36.實(shí)施方案26-35的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基被濃縮為2X或更濃的制劑。

37.實(shí)施方案29-36的任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種二肽為丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸。

38.實(shí)施方案29-37的任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種二肽以約1g/L至約16g/L的濃度存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。

39.實(shí)施方案29-37的任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種二肽以約2.5g/L至約8.5g/L的濃度存在。

40.實(shí)施方案29-39的任一項(xiàng)的方法，其中于2-8℃下貯存的細(xì)胞培養(yǎng)基保持無(wú)沉淀12個(gè)月以上。

41.一種用于分析細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括測(cè)定包含半胱氨酸或酪氨酸的短肽在所述培養(yǎng)基中的存在或不存在。

42.實(shí)施方案41的方法，用于分析無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)、無(wú)水解產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其中所述分析通過(guò)選自質(zhì)譜法(LCMS)、毛細(xì)胞管電泳和HPLC的方法來(lái)進(jìn)行。

43.實(shí)施方案41的方法，用于分析無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)、無(wú)水解產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其中所述短肽包含2、3、4、5或6個(gè)氨基酸。

44.實(shí)施方案41的方法，用于分析培養(yǎng)基，其中所述短肽為二肽。

45.實(shí)施方案23的方法，其中CHO細(xì)胞產(chǎn)生病毒。

46.實(shí)施方案45的方法，其中所述病毒為重組病毒或病毒樣顆粒(VLP)。

47.實(shí)施方案46的方法，其中所述病毒為腺病毒、慢病毒、桿狀病毒、仙臺(tái)病毒、痘苗病毒或其工程改造的病毒衍生物。

48.實(shí)施方案46的方法，其中所述VLP攜帶核酸。

49.實(shí)施方案48的方法，其中所述核酸為RNA。

50.實(shí)施方案9的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述己糖選自葡萄糖、半乳糖、果糖和麥芽糖。

51.包含含有半胱氨酸或酪氨酸的小肽的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基不含血清、不含蛋白質(zhì)和/或不含水解產(chǎn)物。

52.實(shí)施方案51的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其中所述小肽包含2、3、4、5或6個(gè)氨基酸。

53.實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其支持重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

54.實(shí)施方案53的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基，其中所述重組蛋白質(zhì)為免疫球蛋白或其片段。

55.包含實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基以及細(xì)胞的組合物。

56.在細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括：將細(xì)胞與實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基接觸；和在適合于生長(zhǎng)所述細(xì)胞和/或表達(dá)所述重組蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。

57.用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器，其中第一容器裝有實(shí)施方案1的包含至少一種二肽的培養(yǎng)基，以及其中所述培養(yǎng)基支持培養(yǎng)中的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。

58.實(shí)施方案57的試劑盒，其中所述培養(yǎng)為懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)。

59.實(shí)施方案57的試劑盒，其中所述生長(zhǎng)為高密度生長(zhǎng)。

60.在實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基中產(chǎn)生病毒或病毒顆粒的方法，包括：在實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基在適合于所述病毒或病毒顆粒表達(dá)的條件下支持所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。

61.由實(shí)施方案56的方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。

62.由實(shí)施方案60的方法產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒。

63.實(shí)施方案1的細(xì)胞培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基用于產(chǎn)生病毒或重組蛋白質(zhì)的用途。

64.由實(shí)施方案26的方法產(chǎn)生的培養(yǎng)基、濃縮給料或重建的培養(yǎng)基。

65.實(shí)施方案1或64的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述小肽為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。

66.實(shí)施方案1或64的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述小肽在長(zhǎng)度上為至少約2至10個(gè)氨基酸。

67.實(shí)施方案1或64的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述小肽在長(zhǎng)度上為至少約10個(gè)氨基酸。

68.實(shí)施方案22的方法，其中在分批補(bǔ)料培養(yǎng)期間進(jìn)行所述補(bǔ)充。