本發(fā)明涉及細胞領(lǐng)域，特別涉及培養(yǎng)基及山竹細胞次生代謝物的制備方法。
背景技術(shù)：
：山竹又稱山竹子、莽吉柿、鳳果，是藤黃科(Guttiferae)藤黃屬(Garcinia)常綠喬木山竹的果實。近年來山竹的藥理作用成為研究熱點。山竹果殼含有多種氧雜蒽酮衍生物，主要包括α-倒捻子素、γ-倒捻子素等。這些氧雜蒽酮表現(xiàn)出多種生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化及對多種細菌具有抗菌活性。在生物化學(xué)上氧雜蒽酮被認為是唯一的自然界找到的由三環(huán)芳香族被各種酚類、甲氧基類和異戊二烯所取代，從而產(chǎn)生一系列衍生物的家族。目前，研究人員已經(jīng)鑒定和分離大約200種氧雜蒽酮，其中40種是在莽吉柿果實中發(fā)現(xiàn)的。許多重要的氧雜蒽酮如α－倒捻子酮、β－倒捻子酮、γ－倒捻子酮。目前山竹的氧雜蒽酮類化合物均用化學(xué)提取法或復(fù)合酶解法。主要存在如下問題：1.化學(xué)合成方法工藝復(fù)雜。2.安全性低，生產(chǎn)過程中使用大量有機溶劑，極易殘留在成品中。3.受限于山竹的生長季節(jié)，影響成品的產(chǎn)量。4.細胞大量培養(yǎng)具有濃縮有效物的功效。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基及山竹細胞次生代謝物總氧雜蒽酮類化合物的制備方法。本發(fā)明利用山竹細胞培養(yǎng)物中的次生代謝物(山竹細胞培養(yǎng)過程中合成并釋放至培養(yǎng)液中具生物活性物質(zhì)的總稱)含有總氧雜蒽酮類化合物，將其次生代謝物收集進行凍干保存。利用總氧雜蒽酮類化合物具抗氧化功效，達到抗衰老的目的，可將該凍干粉運用到化妝品中。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括2,4-D、6-BA和基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述2,4-D在所述培養(yǎng)基中的濃度為0.2～2.0mg/L；所述6-BA在所述培養(yǎng)基中的濃度為0.5～3.0mg/L。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基還包括葡萄糖。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述葡萄糖在所述培養(yǎng)基中的濃度為1.0～5.0g/L。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)山竹細胞制備次生代謝物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述山竹細胞次生代謝物為總氧雜蒽酮類化合物。本發(fā)明還提供了一種山竹細胞次生代謝物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1：獲得山竹細胞；步驟2：取步驟1獲得的山竹細胞與本發(fā)明提供的培養(yǎng)基混合后初步培養(yǎng)，再與本發(fā)明提供的培養(yǎng)基混合后擴大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述制備方法步驟1中所述山竹細胞的制備方法為取山竹果皮與基礎(chǔ)培養(yǎng)基、纖維素酶和果膠酶混合后酶解，過濾，收集濾液。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述制備方法中所述纖維素酶的加入量為所述山竹果皮質(zhì)量的0.01～0.10％，所述果膠酶的加入量為所述山竹果皮質(zhì)量的0.01～0.10％。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述制備方法中所述纖維素酶的酶活為30000U/mg，所述果膠酶的酶活為50000U/mg。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，纖維素酶和果膠酶的體積比1:1。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述酶解的時間為3小時。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述初步培養(yǎng)的條件為：取山竹細胞加入I號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞株配制成1-5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養(yǎng)14天。I號培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.2～1.0mg/L6-BA1.5～3.0mg/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述擴大培養(yǎng)的條件為：經(jīng)過初步培養(yǎng)后，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞配制成1-3x106/ml密度的山竹細胞液置于發(fā)酵罐中進行懸浮培養(yǎng)，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養(yǎng)14天。Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0～2.0mg/L6-BA0.5～1.5mg/L葡萄糖1.0～5.0g/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，步驟2收集培養(yǎng)液之后，還包括過濾、濃縮，收集濃縮液后除菌，凍干的步驟。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述凍干為于-20～-35℃，真空度為50～200Pa的條件下，凍干24～36小時。本發(fā)明還提供了所述制備方法制得的山竹細胞次生代謝物。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述山竹細胞次生代謝物為總氧雜蒽酮類化合物。本發(fā)明還提供了所述山竹細胞次生代謝物在制備抗脂質(zhì)過氧化的藥物、食品和/或化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述山竹細胞次生代謝物在制備抗衰老的藥物、食品和/或化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括2,4-D、6-BA和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過該培養(yǎng)基以及本發(fā)明提供的方法制得的山竹細胞培養(yǎng)物中的次生代謝物(山竹細胞培養(yǎng)過程中合成并釋放至培養(yǎng)液中具生物活性物質(zhì)的總稱)含有總氧雜蒽酮類化合物，將其次生代謝物收集進行凍干保存。利用總氧雜蒽酮類化合物具抗氧化功效，達到抗衰老的目的，可將該凍干粉運用到化妝品中。具體實施方式本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基及山竹細胞次生代謝物的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供了一種山竹細胞次生代謝物的制備方法，包括如下步驟：獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒后的山竹果皮，用滅菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉(zhuǎn)移至無菌干凈的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基，0.01-0.10％纖維素酶和0.01-0.10％果膠酶，消化3小時。優(yōu)選的，纖維素酶和果膠酶體積比為1:1。用200目無菌網(wǎng)篩對消化液進行過濾，除去雜質(zhì)，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養(yǎng)：加入I號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養(yǎng)14天。經(jīng)過初步培養(yǎng)后，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞配制成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置于發(fā)酵罐中進行懸浮培養(yǎng)，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養(yǎng)14天。I號培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)：名稱含量名稱含量2,4-D0.2-1.0mg/L6-BA1.5-3.0mg/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)：名稱含量名稱含量2,4-D1.0-2.0mg/L6-BA0.5-1.5mg/L葡萄糖1.0-5.0g/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍干粉的制備：收集山竹細胞培養(yǎng)物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌后進行凍干處理，凍干溫度為-20～-35℃，真空度為50～200Pa，凍干時間為24～36小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍干粉。將凍干粉分裝成1ml/支。本發(fā)明采用植物細胞培養(yǎng)法提取山竹中的總氧雜蒽酮類化合物對提取出的總氧雜蒽酮類化合物進行凍干處理，易于保存和應(yīng)用，增大穩(wěn)定性。有益效果包括：1.提取工藝穩(wěn)定，有效成分濃度大，并能保存其活性。2.安全性高，不殘留有機溶劑。3.不受限于山竹的生長季節(jié)影響。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及山竹細胞次生代謝物的制備方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒后的山竹果皮，用滅菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉(zhuǎn)移至無菌干凈的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基，0.01％纖維素酶和0.05％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網(wǎng)篩對消化液進行過濾，除去雜質(zhì)，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養(yǎng)：加入I號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養(yǎng)14天。經(jīng)過初步培養(yǎng)后，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞配制成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置于發(fā)酵罐中進行懸浮培養(yǎng)，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養(yǎng)14天。表1I號培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.2mg/L6-BA3.0mg/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表2Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L葡萄糖3.0g/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍干粉的制備：收集山竹細胞培養(yǎng)物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌后進行凍干處理，凍干溫度為-28℃，真空度為50Pa，凍干時間為30小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍干粉。將凍干粉分裝成1ml/支。實施例2獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒后的山竹果皮，用滅菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉(zhuǎn)移至無菌干凈的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基，0.10％纖維素酶和0.01％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網(wǎng)篩對消化液進行過濾，除去雜質(zhì)，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養(yǎng)：加入I號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養(yǎng)14天。經(jīng)過初步培養(yǎng)后，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞配制成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置于發(fā)酵罐中進行懸浮培養(yǎng)，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養(yǎng)14天。表3I號培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表4Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.5mg/L6-BA1.0mg/L葡萄糖1.0g/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍干粉的制備：收集山竹細胞培養(yǎng)物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌后進行凍干處理，凍干溫度為-35℃，真空度為200Pa，凍干時間為36小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍干粉。將凍干粉分裝成1ml/支。實施例3獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒后的山竹果皮，用滅菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉(zhuǎn)移至無菌干凈的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基，0.05％纖維素酶和0.10％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網(wǎng)篩對消化液進行過濾，除去雜質(zhì)，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養(yǎng)：加入I號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞株配制成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養(yǎng)14天。經(jīng)過初步培養(yǎng)后，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基將山竹細胞配制成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置于發(fā)酵罐中進行懸浮培養(yǎng)，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養(yǎng)14天。表5I號培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.6mg/L6-BA2.2mg/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表6Ⅱ號滅菌培養(yǎng)基的配方(1LMS培養(yǎng)基中)名稱含量名稱含量2,4-D2.0mg/L6-BA0.5mg/L葡萄糖5.0g/L注：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍干粉的制備：收集山竹細胞培養(yǎng)物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌后進行凍干處理，凍干溫度為-20℃，真空度為120Pa，凍干時間為24小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍干粉。將凍干粉分裝成1ml/支。實施例4次生代謝物凍干粉中總氧雜蒽酮類含量的測定標準曲線的制備：精密量取α－倒捻子素對照品溶液0，5，10，15，20，25，30μl，總氧雜蒽酮類濃度分別為0，10，15，20，25，30μg/ml，分別置于10ml具塞試管中，加甲醇至1.0ml，搖勻，以甲醇為空白。分別加0.25ml5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，室溫放置9min。再加入0.35ml10％硝酸鋁溶液，搖勻，室溫放置6min。再加入3.0ml4％氫氧化鈉溶液，加甲醇補足體積至5ml，搖勻，室溫放置15min，370nm波長處測定吸光度，以α－倒捻子素的量對吸光度作標準曲線?？傃蹼s蒽酮的提取及測定：樣品組1～樣品組3：采用實施例1～實施例3制備的凍干粉溶解成液體。取樣品粉末0.25g，精密稱定，置于具塞試管中，加入5ml檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和一定質(zhì)量分數(shù)的酶，在一定溫度和pH下水浴一定時間，過濾，棄去酶液，再向藥渣中加入液固比為1∶17(g/ml)的90％乙醇，超聲提取74min后，過濾，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，同時顯色，測定吸光度。結(jié)果見表7。表7組別總氧雜蒽酮類含量(μg/ml)樣品組1(實施例1制備)31.2樣品組2(實施例2制備)30.7樣品組3(實施例3制備)30.4結(jié)論：本專利的植物細胞培養(yǎng)方法能成功提取出豐富的總氧雜蒽酮類物質(zhì)，且不同批次間的含量無明顯差別(P<0.05)，證明方法穩(wěn)定。實施例5山竹次生代謝物凍干粉對大白鼠皮膚組織勻漿中MDA生成量的影響自由基形成后，其代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量明顯增高，MDA為極活潑的交聯(lián)劑，它能使真皮結(jié)構(gòu)發(fā)生大分子交聯(lián)，使真皮纖維扭曲增粗紊亂，使人的皮膚在外觀上日見衰老，MDA含量的高低可間接表征物質(zhì)的抗脂質(zhì)過氧化(即抗MDA生成)活性，MDA含量越小，表明物質(zhì)的抗脂質(zhì)過氧化能力越強；反之，則抗脂質(zhì)過氧化能力越弱。將40只大白鼠分成4組，每組10只，去其背部被毛，暴露面積約6cm。，取同一批次的實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉，涂抹前將與其配對的2ml溶酶完全倒入凍干粉中，充分混勻，將2ml混合物全部均勻地涂抹至小鼠暴露的背部，每兩天涂抹一次。第一組，連續(xù)涂抹實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉5次后處死，取背部皮膚組織勻漿，制作為10％的勻漿。第二組，連續(xù)涂抹實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉10次后處死，取背部皮膚組織勻漿，制作為10％的勻漿。第三組，連續(xù)涂抹實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉15次后處死，取背部皮膚組織勻漿，制作為10％的勻漿。第四組不涂抹實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉，30天后處死，取背部皮膚組織勻漿，制作為10％的勻漿。標準管取0.2ml10mol/ml標準品、標準空白管取0.2ml無水乙醇、測定管取0.2ml測試樣品，然后三管均加入0.2ml試劑一，混勻后，均加入3ml試劑二和1ml試劑三。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，刺一小孔，95℃水浴40分鐘，取出后流水冷卻，然后3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。取上清，532mm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，比色測各管吸光度值。結(jié)果見表8。表8注：*表明與對照組之間數(shù)據(jù)有顯著差異(P<0.05)結(jié)論：證明本專利提取的總氧雜蒽酮類具有明顯抗氧化作用(P<0.05)，隨著使用天數(shù)的增加，效果有明顯提升。取實施例2、實施例3制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉進行上述實驗，實驗結(jié)果與實施例1制備的山竹細胞次生代謝物凍干粉的實驗結(jié)果相近，與其無顯著差異(P＞0.05)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3