本發(fā)明涉及抗原物質(zhì)純化
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及用于疫苗的支原體的純化技術(shù)，具體涉及一種純化豬肺炎支原體的方法。
背景技術(shù)：
：豬支原體性肺炎，是一種由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的慢性接觸性呼吸道傳染病，以氣喘為主要癥狀，又稱豬氣喘病。該病分布范圍廣、感染率高、死亡率低，患病豬生長減慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低、容易引起他細(xì)菌或病毒的繼發(fā)性或混合性感染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、肺炎鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬鼻支原體以及多殺性巴氏桿菌等。疫苗是豬支原體性肺炎防治的重要生物制品，而疫苗的開發(fā)過程中又以抗原性能最為關(guān)鍵，從使用效果層面來看，無論滅活抗原還是減毒或抗原都應(yīng)當(dāng)具有顯著的免疫原性，同時(shí)對機(jī)體刺激小、不良反應(yīng)率低，為了獲得好的免疫原性，抗原的純化至關(guān)重要。目前應(yīng)用較廣的滅活疫苗是輝瑞公司生產(chǎn)的豬肺炎支原體滅活疫苗瑞倍適，其應(yīng)用的佐劑Amphigen具有較好的免疫刺激能力。國內(nèi)使用較多的是由江蘇農(nóng)科院研制的Mhp168株弱毒活疫苗，采用肺內(nèi)注射方式免疫。豬肺炎支原體的培養(yǎng)和保存難度大，傳統(tǒng)的培養(yǎng)凍干方法所用血清或其它蛋白注射后會(huì)引起嚴(yán)重引起過敏反應(yīng)，因此制備高純度抗原、去除培養(yǎng)基中血清等雜蛋白、優(yōu)化疫苗生產(chǎn)下游工藝迫在眉睫?，F(xiàn)有技術(shù)的疫苗制備工藝中，豬肺炎支原體抗原的純化效果有待提升，一方面其抗原回收率較低，同時(shí)還存在著雜蛋白去除不完全的現(xiàn)象，此外，現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)方法流程繁瑣，不易于生產(chǎn)規(guī)模的放大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種純化豬肺炎支原體的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的豬肺炎支原體純化工藝抗原回收率低的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的豬肺炎支原體純化工藝難以充分去除雜質(zhì)。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的豬肺炎支原體純化工藝處理量有限，不利于生產(chǎn)規(guī)模的放大。為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液，澄清處理，收集產(chǎn)物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進(jìn)行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產(chǎn)物用緩沖液進(jìn)行3～7倍體積洗濾后，收集產(chǎn)物。作為優(yōu)選，步驟1)所述豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液中所含有的抗原是豬肺炎支原體活抗原或滅活的豬肺炎支原體抗原。作為優(yōu)選，步驟1)所述澄清處理是利用濾膜、膜包或中空纖維超濾膜實(shí)現(xiàn)的。作為優(yōu)選，步驟2)所述超濾濃縮是利用中空纖維膜過濾系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。作為優(yōu)選，所述中空纖維膜過濾系統(tǒng)中中空纖維柱孔徑為300～700KD。作為優(yōu)選，步驟2)超濾濃縮的倍數(shù)是2～5倍體積。作為優(yōu)選，步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為2000～6000sec-1，更優(yōu)的，是4000sec-1。作為優(yōu)選，步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為5～10psi，更優(yōu)的，是7.5psi。作為優(yōu)選，步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.2～7.4的PBS溶液。作為優(yōu)選，步驟3)所述洗濾是等體積洗濾。作為優(yōu)選，步驟2)所述的超濾濃縮、步驟3)所述洗濾過程均為收集回流液、棄去透過液。在以上技術(shù)方案中，步驟2)所述的超濾濃縮可以對抗原液進(jìn)行2～20倍、甚至更大體積的濃縮。本發(fā)明提供了一種純化豬肺炎支原體的方法，該技術(shù)方案以抗原培養(yǎng)液直接作為原料，先后經(jīng)澄清處理、超濾濃縮、洗濾三步處理即告完成，在此基礎(chǔ)上基于實(shí)驗(yàn)手段設(shè)計(jì)了所采用的工藝裝置，利用中空纖維膜剪切力低、容塵量高的特點(diǎn)，并優(yōu)化了操作條件，通過跨膜壓、剪切速率的限定保證了抗原自身穩(wěn)定，并確保了雜質(zhì)去除率。應(yīng)用本方法純化豬肺炎支原體抗原，不進(jìn)行濃縮的情況下，抗原回收率達(dá)到87.8％以上，抗原液中豬血清去除60.7％；5倍濃縮后雜蛋白去除率達(dá)98％，抗原回收率62％，豬血清含量與原抗原液相比降低90.3％。同時(shí)，由于本方法處理量大、處理速度快、操作簡單、工藝穩(wěn)定，因此可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或半自動(dòng)化生產(chǎn)。應(yīng)用本方法純化的豬肺炎支原體抗原制備的疫苗，對于降低豬肺炎支原體疫苗產(chǎn)品副反應(yīng)、提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。具體實(shí)施方式以下將對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1豬肺炎支原體抗原的制備按發(fā)酵罐體積70％加入豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，待培養(yǎng)基自然冷卻到37℃時(shí)，加入20％豬血清，攪拌均勻；按培養(yǎng)基總量的10％接入生產(chǎn)用豬肺炎支原體種子液，37℃攪拌培養(yǎng)3～7日，待PH值由7.5下降至6.8時(shí)收獲菌液。實(shí)施例2豬肺炎支原體抗原的純化收獲的豬肺炎支原體抗原液應(yīng)用3～6um濾膜澄清；應(yīng)用300KD的中空纖維系統(tǒng)對澄清的抗原液進(jìn)行純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/2，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，收獲的截留液即為純化的豬肺炎支原體抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計(jì)算蛋白去除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表1以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應(yīng)的蛋白去除率純化前(mg/ml)純化后(mg/ml)蛋白去除率16.413.915.2％表2以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表3以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質(zhì)量mg豬血清去除率純化前315.920063.18-純化后132.820026.5658％實(shí)施例3豬肺炎支原體滅活抗原的純化收獲得豬肺炎支原體抗原液按終濃度0.2％加入甲醛，37℃滅活24h；將滅活的豬肺炎支原體抗原液用3～6um濾膜澄清；應(yīng)用300KD的中空纖維系統(tǒng)對澄清的抗原液進(jìn)行純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/2，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，收獲的截留液即為純化的豬肺炎支原體抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計(jì)算蛋白去除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。表4以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應(yīng)的蛋白去除率純化前(mg/ml)純化后(mg/ml)蛋白去除率16.414.213.4％表5以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表6以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質(zhì)量mg豬血清去除率純化前315.920063.18-純化后124.120024.8260.7％實(shí)施例4豬肺炎支原體滅活抗原的濃縮收獲的豬肺炎支原體抗原液應(yīng)用3～6um濾膜澄清；應(yīng)用300KD的中空纖維系統(tǒng)對澄清的抗原液進(jìn)行濃縮純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/5，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，收獲截留液即為純化濃縮的豬肺炎支原體滅活抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計(jì)算蛋白去除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示。表7以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應(yīng)的蛋白去除率表8以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表9以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質(zhì)量mg豬血清去除率原液315.920063.18-濃縮后152.5406.190.3％實(shí)施例5純化前后效力檢驗(yàn)體重1.5～2.0kg健康家兔(豬肺炎支原體血清抗體IHA效價(jià)不高于1:5)15只，其中5只各后腿肌肉注射實(shí)施例4純化前滅活抗原0.5ml，5只后腿肌肉注射實(shí)施例4純化后滅活抗原0.5ml，注射后14日，相同途徑、相同劑量二免。剩余5只不接種作為對照。二免后30日，連同對照組采血，用IHA法檢測家兔血清豬肺炎支原體抗體效價(jià)。效力檢測結(jié)果如表10所示：表10豬肺炎支原體抗原純化前、后對免疫接種后抗體效價(jià)的影響實(shí)施例6一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液，澄清處理，收集產(chǎn)物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進(jìn)行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產(chǎn)物用緩沖液進(jìn)行3倍體積洗濾后，收集產(chǎn)物。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：步驟1)所述豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液中所含有的抗原是豬肺炎支原體活抗原或滅活的豬肺炎支原體抗原。步驟1)所述澄清處理是利用濾膜、膜包或中空纖維超濾膜實(shí)現(xiàn)的。步驟2)所述超濾濃縮是利用中空纖維膜過濾系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。所述中空纖維膜過濾系統(tǒng)中中空纖維柱孔徑為300KD。步驟2)超濾濃縮的倍數(shù)是2倍體積。步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為2000sec-1。步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為5psi。步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.2的PBS溶液。步驟3)所述洗濾是等體積洗濾。實(shí)施例7一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液，澄清處理，收集產(chǎn)物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進(jìn)行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產(chǎn)物用緩沖液進(jìn)行7倍體積洗濾后，收集產(chǎn)物。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：所述中空纖維膜過濾系統(tǒng)中中空纖維柱孔徑為700KD。步驟2)超濾濃縮的倍數(shù)是5倍體積。步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為6000sec-1。步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為10psi。步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.4的PBS溶液。實(shí)施例7一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養(yǎng)液，澄清處理，收集產(chǎn)物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進(jìn)行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產(chǎn)物用緩沖液進(jìn)行5倍體積洗濾后，收集產(chǎn)物。以上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3