本發(fā)明涉及一種試劑盒及其應(yīng)用，尤其涉及一種直接pcr檢測(cè)豬支原體肺炎病原的試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬支原體肺炎(mycoplasmalpneumoniaofswine,mps)，又稱豬地方流行性肺炎(swineenzooticpneumonia)，俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病。主要臨診癥狀為咳嗽和氣喘，病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉羊?qū)嵶?。本病廣泛分布于世界各地，主要特點(diǎn)是高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率為主要特點(diǎn)。臨床主要表現(xiàn)為咳嗽，氣喘，呼吸困難，日增重減少，長(zhǎng)期生長(zhǎng)不良，飼料報(bào)酬率大幅下降。該病常與其他呼吸道病原如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等病原協(xié)同引起豬地方性肺炎，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒2型的協(xié)同感染引起豬呼吸道綜合征。mps發(fā)病率一般在50％-80％，個(gè)別新建豬場(chǎng)發(fā)病率可達(dá)100％，死亡率高達(dá)14％-37％。流行后期或老疫區(qū)則以哺乳仔豬和斷奶小豬多發(fā)，死亡率較高，母豬和成年豬多呈慢性和隱性感染。病豬與健康豬群混合飼養(yǎng)，常引起豬支原體肺炎的爆發(fā)。本病目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對(duì)癥療法。最根本的辦法是消除患病動(dòng)物和徹底消毒，切斷傳播途徑。因此應(yīng)加強(qiáng)檢疫和本病監(jiān)測(cè)，以防本病擴(kuò)散。支原體可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡的豬都易感。本病主要在冬季多發(fā)，夏季也可發(fā)生。病豬和帶毒豬是主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬較多常見。mps的診斷方法主要有細(xì)菌分離和鑒定，elisa方法檢測(cè)抗體和pcr。pcr方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。但是從細(xì)菌分離培養(yǎng)到純化及dna提取至少需要3-4天才能做出初步鑒定，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果也不準(zhǔn)確，而且敏感性差，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，不利于養(yǎng)殖戶和規(guī)?；髽I(yè)采取相應(yīng)的血清型疫苗和藥物來進(jìn)行及時(shí)的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出的一種直接pcr檢測(cè)豬支原體肺炎病原的試劑盒及其應(yīng)用，檢測(cè)迅速，靈敏性佳。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決技術(shù)問題：一種直接pcr檢測(cè)豬支原體肺炎病原的試劑盒，包含以下試劑：裂解液5μl，pcr擴(kuò)增試劑20μl，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

上述試劑的所述裂解液含有2～4m異硫氰酸酯、7～10m乙二胺四乙酸、15～20m十二烷基肌氨酸和3～6％體積比的聚乙烯基吡咯烷酮；所述pcr擴(kuò)增試劑含有5×pcrbuffer、2.0mdntp、10pm正向引物、10pm反向引物、高保真taq酶5u/μl、20mmmgcl2和純凈水。所述正向引物為mpsf：gaagctatcaaaaaaggggaaacta，所述反向引物為mpsr：tgtatcggtttcagaagaag。

本發(fā)明提供的試劑盒能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出豬支原體肺炎病原支原體?？蓪?duì)豬支原體肺炎感染的單個(gè)樣品檢測(cè)，也可對(duì)臨床病例中混合感染的檢測(cè)，可用于豬支原體肺炎病原普查、分子流行病學(xué)調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種直接pcr檢測(cè)豬支原體肺炎病原的試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟：

第一步、樣品的采集，分為病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集為無菌條件下采集病料0.1mg～100mg，裝入無rna酶污染的離心管中備用，所述鼻咽拭子采集為采集鼻咽液，裝入無rna酶污染的離心管中備用；

第二步、樣品裂解，取液體狀樣品10μl～100μl或研磨后的固體狀樣品0.1mg～100mg，加400～600μl裂解液，震蕩混勻；

第三步、直接pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μl，取裂解后的樣品5μl，加入pcr擴(kuò)增試劑20μl，充分混合均勻后短暫離心，pcr擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3min；然后35個(gè)循環(huán)：94℃1min，55℃1min，72℃1mins；最后72℃10min；

第四步、pcr產(chǎn)物的檢測(cè)，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物和2μlloadingbuffer混勻，加到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入對(duì)照和dnamarker(dl2000),電壓為120v，電泳30min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

上述方法的所述第三步中的反應(yīng)體系為25μl，裂解后的樣品5μl，10pmol/μl的正向引物2μl，10pmol/μl的反向引物2μl，5×pcrbuffer5μl，2.0mm/ldntps5μl，5u/μl的高保真taq酶0.5μl，20mmmgcl23.5μl,純凈水2μl，充分混合均勻后短暫離心。擴(kuò)增長(zhǎng)度為600bp。所述第四步中瓊脂糖凝膠電泳時(shí)的凝膠濃度為1.0％，其中含有1％的凝膠燃料。

本發(fā)明的方法是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的，檢測(cè)中提供了陰性和陽性對(duì)照，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度，降低假陽性的出現(xiàn)幾率，特異性較強(qiáng)，省時(shí)省力，該試劑盒將檢測(cè)時(shí)間縮短至2h，大大提高了工作效率。本發(fā)明特別適合于豬支原體肺炎感染的大量臨床樣本的快速診斷，可以為臨床和科研上豬支原體肺炎病防治和治療提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)提高豬支原體肺炎病原的檢測(cè)、監(jiān)控、疫苗研制等具有重要意義。

附圖說明

圖1為rt-pcr產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果圖，圖中的marker為dl2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、700bp、500bp、250bp，從圖1可以看出，mps模板pcr擴(kuò)增片段約為600bp，證明擴(kuò)增片段為目的片段，符合預(yù)期設(shè)計(jì)大小，1為陽性對(duì)照，2為樣品，為支原體擴(kuò)增的片段；3為陰性對(duì)照。

圖2為敏感性試驗(yàn)，將直接pcr模板dna定量，依次10倍稀釋，使其為1pg,10^-1pg,10^-2pg，10^-3pg，10^-4pg，10^-5pg，10^-6pg，10^-7pg。分別進(jìn)行直接pcr擴(kuò)增，確定其敏感性。然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，結(jié)果如圖2所示，其敏感性可達(dá)10^-2pg。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，文中的百分含量，如沒有特別說明均指重量百分比。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的直接pcr檢測(cè)豬支原體肺炎病原的試劑盒，組成包括：

(1)裂解液：2-4m異硫氰酸酯、7-10m乙二胺四乙酸、15-20m十二烷基肌氨酸、3-6％(體積比)聚乙烯基吡咯烷酮。

(2)pcr擴(kuò)增試劑：5×pcrbuffer、2.0mdntp、10pm正向引物、10pm反向引物、高保真taq酶(5u/μl)、20mmmgcl2，純凈水。

各成分的具體組成：

反應(yīng)體系為25μl，裂解后的樣品5μl，mpsf(5′-gaagctatcaaaaaaggggaaacta-3′)(10pmol/μl)2μl，mpsr(3′-tgtatcggtttcagaagaag-5′)(10pmol/μl)2μl，5×pcrbuffer5μl，2.0mm/ldntps5μl，高保真taq酶0.5μl(5u/μl)，20mmmgcl23.5μl,純凈水2μl，充分混合均勻后短暫離心。

其中一對(duì)特異性引物如下：mpsf：gaagctatcaaaaaaggggaaacta，mpsr：tgtatcggtttcagaagaag。

將試劑盒用于直接檢測(cè)豬支原體肺炎病原，包括以下步驟：

(1)樣品的采集：

①病料：無菌采集病料0.1mg-100mg，裝入無rna酶污染的離心管中備用。

②鼻咽拭子：用鼻咽拭子采集鼻咽液，裝入無rna酶污染的離心管中備用。

(2)樣品裂解

①將固體狀的動(dòng)物組織先進(jìn)行研磨處理，液體狀的動(dòng)物組織直接用于裂解；

②取液體狀10μl-100μl或研磨后的固體狀動(dòng)物組織0.1mg-100mg，加400-600μl裂解液，震蕩混勻；

(3)直接pcr

反應(yīng)體系為25μl，取裂解后的樣品5μl，加入pcr擴(kuò)增試劑20μl，充分混合均勻后短暫離心。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；然后35個(gè)循環(huán)：94℃1min，55℃1min，72℃1mins；最后72℃10min。

(4)rt-pcr產(chǎn)物的檢測(cè)

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物和2μlloadingbuffer混勻，加到含eb的1.0％的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入對(duì)照和dnamarker(dl2000),電壓為120v，電泳30min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，結(jié)果如圖1所示，1為陽性對(duì)照，2為樣品，3為陰性對(duì)照。如果擴(kuò)增出600bp條帶，說明陽品為陽性，否則為陰性。

將直接pcr模板dna定量，依次10倍稀釋，使其為1pg,10^-1pg,10^-2pg，10^-3pg，10^-4pg，10^-5pg，10^-6pg，10^-7pg。分別進(jìn)行直接pcr擴(kuò)增，確定其敏感性。然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，結(jié)果如圖2所示，其敏感性可達(dá)10^-2pg。

除上述實(shí)施外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。

序列表

豬肺炎支原體（mycoplasmahyopneumoniae,mps）

catttgaagctatcaaaaaaggggaaactacaaaagaaggtaaaagagaagaagtagataaaaaagttaaggaattagataataaaataaaaggtatattgcctcagcccccagcggctaaaccagaagcagcaaaaccagtagcggctaaaccagaagcggctaaaccagtagcagctaaacctgaagcagctaaacctgaagcagcaaaaccagttgcagctaaacctgaagcagcaaaaccagttgcagctaaacctgaagcagcaaaaccagttgctactaatactaatactaatactggcttttcacttacaaataaaccaaaagaagactatttcccaatggcttttagttataaattagaatatactgacgaaaataaattaagcctaaaaacaccggaaattaatgtatttttagaactagttcatcaaagcgagtatgaagaccaaaaaataataaaggaactagataaaactgttttaaatcttcaatatcaattccaggaagtcaaggtaactagtgaccaatatcagaaacttagccacccaatgatgaccgaaggatcttcaaatcaaggtaaaaaaagcgaaggaactcctaaccaaggtaaaaaagcagaaggcgcgcctaaccaaggtaaaaaaagcgaaggaactcctaaccaaggtaaaaaagcagaaggcgcgcctagtcaacaaagcccaactaccgaatta

mpsf：gaagctatcaaaaaaggggaaacta，上游引物

mpsr：tgtatcggtttcagaagaag，下游引物