本發(fā)明涉及農(nóng)作物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用領(lǐng)域，具體涉及一種適于磷高效大豆基因型篩選的特異性ssr分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

培育和推廣磷高效的大豆品種具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。栽培大豆〔glycinemax(l.)merrill〕是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是食用油和種子蛋白的主要來(lái)源之一，其生長(zhǎng)在廣泛的土壤環(huán)境中。磷是作物養(yǎng)分三要素之一。對(duì)于生長(zhǎng)在土壤中的植物，磷是有限的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。它的可利用能力依賴(lài)于土壤特性和不穩(wěn)定的磷含量。據(jù)估計(jì)，在世界2/3的栽培土壤中，有效磷總體上偏低，存在不同程度的缺磷現(xiàn)象。在缺磷時(shí)，蛋白質(zhì)合成受阻，新的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形成較少，影響細(xì)胞分裂，生長(zhǎng)緩慢，分枝或分蘗減少，植株矮小，開(kāi)花期和成熟期都延遲，產(chǎn)量降低，抗性減弱。中國(guó)華南熱帶、亞熱帶地區(qū)，土壤有效磷含量低、利用率不高，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的種植中通過(guò)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量使用磷肥，提高產(chǎn)量，此方法已造成磷資源的危機(jī)，環(huán)境污染問(wèn)題也日益突出。為改變這一現(xiàn)狀，現(xiàn)已轉(zhuǎn)變策略，期望通過(guò)對(duì)大豆磷營(yíng)養(yǎng)效率的遺傳改良，使之能夠更好地適應(yīng)特定的生態(tài)條件。因此，開(kāi)展大豆磷高效的種質(zhì)資源篩選，培育磷高效的大豆新品種，提高大豆活化和利用土壤磷庫(kù)的能力，使土壤磷庫(kù)成為磷礦的替代資源，具有重大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。

由于缺乏特異性評(píng)價(jià)指標(biāo)，目前生產(chǎn)上常用的大豆磷高效種質(zhì)資源篩選方法效率較低。植物對(duì)磷的吸收和利用能力的相對(duì)大小以磷效率（phosphorusefficiency）來(lái)表示。大豆不同品種（基因型）對(duì)磷缺乏有不同的適應(yīng)機(jī)制。評(píng)價(jià)不同大豆品種磷缺乏條件下的適應(yīng)性通常采用種質(zhì)篩選法，即采用缺磷土壤（大田或土壤盆栽）或在水培條件下對(duì)大豆種質(zhì)資源進(jìn)行種植評(píng)價(jià)。這些方法都需要占用較大的空間，并且一般需要完成一個(gè)生長(zhǎng)周期，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，受土壤、養(yǎng)分、水分、氣候等因素會(huì)影響到試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。磷高效品種篩選，確定大豆磷效率的指數(shù)是非常重要的。大豆生長(zhǎng)磷效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多，如生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)定指標(biāo)，包括根形態(tài)構(gòu)型、生物量、葉面積、葉齡相對(duì)值、光合特性、生理生化指標(biāo)、分蘗數(shù)（水稻）等。實(shí)踐證明，并不是所有的參數(shù)指標(biāo)對(duì)于磷高效大豆的評(píng)價(jià)和育種都是有效的。僅僅是一些容易測(cè)量到的和與磷效率相關(guān)的參數(shù)被用在大豆育種中。統(tǒng)計(jì)學(xué)上的評(píng)價(jià)方法包括單一參數(shù)、多樣參數(shù)以及主要部分分析方法等。單一參數(shù)的評(píng)價(jià)直接顯示了不同基因型在磷缺乏時(shí)比較根上部生物量、磷吸收和磷效率的比例。這些參數(shù)在磷可利用性土壤中是敏感的。與單一參數(shù)顯示方法相比，多樣參數(shù)評(píng)價(jià)如簇分析方法更優(yōu)越，因?yàn)樗C合分析了磷效率多樣參數(shù)。然而，簇分析方法不能說(shuō)明不同參數(shù)對(duì)磷效率的貢獻(xiàn)，在磷效率評(píng)價(jià)中，其結(jié)果可能不準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上，有人提出了一個(gè)折中方案，即主要部分分析方法，通過(guò)綜合計(jì)算主要部分在低磷條件（-p）及低磷（-p）和高磷（+p）相對(duì)值參數(shù)的百分比的標(biāo)準(zhǔn)值得到的，保留超過(guò)1的特征值。種植介質(zhì)無(wú)論是土壤還是水培，整個(gè)篩選過(guò)程工序多、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、易受環(huán)境條件影響，且在水培條件下成熟難，易破壞原材料。盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)方法上有所改善，但由于缺乏有效的特異性評(píng)價(jià)指標(biāo)，造成成本高、效率低下，準(zhǔn)確性欠佳。

根系性狀是評(píng)價(jià)大豆磷效率的關(guān)鍵指標(biāo)。有研究結(jié)果表明，植物攝取磷的能力具有很大的基因型差異，不同的植物高效吸收磷的機(jī)制有所不同，但主要涉及的器官是根。根是大部分作物從土壤中吸收養(yǎng)分的唯一途徑。根系的發(fā)育狀況與作物營(yíng)養(yǎng)吸收密切相關(guān)。根系性狀受遺傳因子的控制，還與根際環(huán)境條件如磷養(yǎng)分狀況有關(guān)。換言之，作物通過(guò)根系從介質(zhì)土壤中獲取養(yǎng)分，養(yǎng)分促進(jìn)了作物地上部和地下部的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響到作物干物質(zhì)的積累和產(chǎn)量的形成。根吸收磷元素是靠根系接土壤的方式為主要來(lái)源。植物對(duì)土壤中磷的吸收主要依靠根系吸收周?chē)佑|到的有效磷，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在低磷脅迫環(huán)境條件下，高等植物會(huì)形成一些對(duì)土壤磷吸收的適應(yīng)機(jī)制，包括根形態(tài)特征的演變（如根毛形成）、誘導(dǎo)酸性磷酸酶、特異根系分泌物的形成和分泌、根構(gòu)型的形成等，從而影響磷效率。已有很多的研究證明，根系性狀與大豆磷養(yǎng)分高效吸收密切相關(guān)。在低磷條件下，磷高效大豆能夠增加根部到根上部干重比例、增加根長(zhǎng)、增多側(cè)根、增加根毛數(shù)量、改變根構(gòu)型。在磷缺乏條件下，磷高效基因型更容易累積生物量，增長(zhǎng)根長(zhǎng)，增加磷吸收和根上部磷利用率。本專(zhuān)利申請(qǐng)人團(tuán)隊(duì)提出應(yīng)用磷效率相關(guān)的根系性狀進(jìn)行大豆磷高效基因型篩選（尹元萍等，利用根系形態(tài)構(gòu)型篩選磷高效大豆基因型，分子植物育種，2015，5（13）:999-1008），應(yīng)用根生物量、根磷含量、根構(gòu)型等根系性狀指標(biāo)具有較好的篩選效果，但根系挖掘和分析的工作量較大，大豆根系挖掘也會(huì)導(dǎo)致植株的損害。

應(yīng)用磷效率相關(guān)根系性狀分子標(biāo)記能夠高效和無(wú)損地進(jìn)行大豆磷效率的評(píng)價(jià)。關(guān)于不同磷營(yíng)養(yǎng)條件下植物根系性狀qtl定位分析的報(bào)道最早見(jiàn)于20世紀(jì)90年代初。簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simplesequencerepeat，ssr）是廣泛存在于真核基因組中的一類(lèi)dna堿基序列，它們均由1-6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)單元，不同等位基因間的重復(fù)數(shù)存在豐富的差異。ssr已成為應(yīng)用最廣、最重要的分子標(biāo)記。大豆基因組的大小約在1129×10⁶~1181×l0⁶bp之間，其中40%-60%的是重復(fù)序列，25%是中度重復(fù)序列，20%是少數(shù)重復(fù)序列。對(duì)大豆的物理作圖和分子連鎖圖譜的比較表明，大豆中每個(gè)cm大致相當(dāng)于550kb的基因組，因此大豆基因組遺傳距離全長(zhǎng)約3500cm。由于ssr標(biāo)記是在基因組中僅存在一個(gè)拷貝的共顯性標(biāo)記，因此在圖譜構(gòu)建上，ssr標(biāo)記一般作為圖譜的錨定標(biāo)記，有利于圖譜連鎖群或染色體的歸并和不同連鎖群的整合。梁泉等（liangetal.,qtlanalysisofroottraitsasrelatedtophosphorusefficiencyinsoybean，annalsofbotany，2010，106:223-234）的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)b1、c1、d1a、d2等連鎖群上有7個(gè)位點(diǎn)與大豆磷效率相關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種適于大豆磷效率篩選的ssr引物序列和大豆磷高效基因型評(píng)價(jià)方法，可以用于高效、準(zhǔn)確地篩選磷高效大豆品種。其技術(shù)方案為：

一種適于大豆磷效率篩選的ssr引物序列，其特征在于，該ssr引物序列包括21對(duì)ssr引物序列，該21個(gè)特異ssr標(biāo)記是，sat_128、sat_149、satt519、satt298、sat_348、barcsoyssr_11_0588、barcsoyssr_11_0574、barcsoyssr_11_0688、sat_296、sct_192、satt458、satt135、sat_277、barcsoyssr_17_0291、barcsoyssr_17_0360、sat_343、satt507、sct_010、satt076、sat404、satt042。

一種大豆磷高效基因型評(píng)價(jià)方法，其特征在于包括如下步驟：（1）設(shè)置對(duì)照組，以bx10（巴西10號(hào)）、3個(gè)f10代重組自系ril71、ril97、ril130為磷高效品種，bd2（本地2號(hào)）、4個(gè)野生大豆yn01、yn02、yn03、yn04，3個(gè)f10代重組自交系ril32、ril144、ril171磷低效品種；

（2）從大豆葉片中分離提取dna；

（3）以dna為模板，用上述特異ssr分子標(biāo)記為引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出特異片段；

（4）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）檢測(cè)，擴(kuò)增條帶進(jìn)行0、1矩陣統(tǒng)計(jì)，構(gòu)建ssr標(biāo)記數(shù)據(jù)矩陣；

（5）根據(jù)擴(kuò)增條帶計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳聚類(lèi)分析，即可判斷磷高效大豆品種。

下表為用于大豆磷高效篩選的21對(duì)ssr引物序列。

用于大豆磷效率篩選的21對(duì)ssr（simplesequencerepeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）引物序列

根據(jù)背景技術(shù)所介紹，發(fā)明人在b1、c1、d1a、d2和f連鎖群上發(fā)現(xiàn)有7個(gè)與大豆根系性狀、磷效率、生物量、產(chǎn)量等性狀緊密連鎖的位點(diǎn)。因此，發(fā)明人在上述7個(gè)位點(diǎn)左右兩側(cè)區(qū)段增加標(biāo)記，共選擇了100對(duì)ssr引物，并對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)廣東、廣西、四川、遼寧、江蘇、浙江等省和國(guó)外巴西等具有代表性的94份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，最終得到21對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性好的ssr引物（附圖3），分別是sat_128、sat_149、satt519、satt298、sat_348、b1-5、b1-11、b1-18、sat_296、sct_192、satt458、satt135、sat_277、d2-2、d2-9、sat_343、satt507、sct_010、satt076、sat404、satt04。通過(guò)與水培條件的磷效率篩選結(jié)果比較，結(jié)果幾乎完全一致。94個(gè)大豆種質(zhì)資源中，僅出現(xiàn)1個(gè)樣品的錯(cuò)誤，特異性ssr標(biāo)記進(jìn)行大豆磷高效品種篩選的錯(cuò)誤率僅為1.06%。

附圖說(shuō)明

圖1特異性ssr分子標(biāo)記鑒定磷高效大豆基因型的操作流程；

圖2引物satt519擴(kuò)增的1-94號(hào)大豆種質(zhì)資源，其中，1-4號(hào)為野生種；5-10號(hào)為6個(gè)ril；35號(hào)為bd2；92號(hào)為bx10；

圖33個(gè)特異性高的ssr引物在1-94號(hào)大豆品種中的擴(kuò)增結(jié)果；

圖494個(gè)大豆品種的upmag聚類(lèi)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的適于磷高效大豆基因型篩選的特異性ssr分子標(biāo)記鑒定方法，包括：

1）設(shè)置對(duì)照組，設(shè)立已經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)的磷高效、磷低效品種為對(duì)照，以bx10（巴西10號(hào)）、3個(gè)f10代重組自系ril71、ril97、ril130為磷高效品種，bd2（本地2號(hào)）、4個(gè)野生大豆yn01、yn02、yn03、yn04，3個(gè)f10代重組自交系ril32、ril144、ril171磷低效品種。這些品種（系）磷效率特性已由相關(guān)研究證實(shí)，磷效率高端株系（ril71、ril97、ril130）和磷效率低端株系（ril32、ril144、ril171）（梁泉，大豆磷效率相關(guān)根系性狀的qtl分析，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2007）、bd2（磷低效品種）和bx10（磷高效品種）（徐青萍等，大豆科學(xué)，2003，22:108-114）。

2）采用ctab法或商品試劑盒提取大豆葉片總dna。

3）選擇下述ssr分子標(biāo)記sat_128、sat_149、satt519、satt298、sat_348、b1-5、b1-11、b1-18、sat_296、sct_192、satt458、satt135、sat_277、d2-2、d2-9、sat_343、satt507、sct_010、satt076、sat404、satt042，并合成引物，所合成的引物根據(jù)od值和分子量大小，將引物稀釋為50μm，置于-20℃冰箱保存。

4）pcr擴(kuò)增特異區(qū)段，采用20μl的pcr反應(yīng)體系，組成如下：

10×pcrbuffer（含mg²⁺）2.0μl

dntp（10mmol/l）0.3μl

上、下游引物（50μmol/l）各0.06μl

taq酶（5u/μl）0.2μl

模板dna1μl（約20ng）

補(bǔ)雙蒸水至20μl

混勻后，置于pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)程序最終選定的參數(shù)為：

根據(jù)每對(duì)引物不同的tm值，適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)程序中的退火溫度，一般用52℃可得到較好的擴(kuò)增結(jié)果。

5）pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用7.2%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）檢測(cè)，0.5×tbe緩沖液，在pcr產(chǎn)物中每孔加入5μl的上樣指示劑，振動(dòng)混勻后用微量進(jìn)樣器取2.0μl樣品至點(diǎn)樣孔中，電泳槽恒流80ma，根據(jù)產(chǎn)物大小，一般二甲苯菁下移至凝膠的2/3時(shí)即可停止，電泳電泳結(jié)束，取出凝膠經(jīng)染色和漂洗后，進(jìn)行讀帶并記錄帶型數(shù)據(jù)。

6）每對(duì)ssr引物檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，視每條多態(tài)性帶為1個(gè)等位基因，其中有多態(tài)性帶記為（1）和無(wú)的記為（0），根據(jù)擴(kuò)增條帶構(gòu)建ssr標(biāo)記數(shù)據(jù)矩陣。

7）利用ntsys2.10e軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)和構(gòu)建upgma遺傳聚類(lèi)圖。

8）根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，參考對(duì)照組的結(jié)果，即可判斷磷高效或磷低效的大豆品種。

與傳統(tǒng)的缺磷土壤或在水培條件鑒定磷高效種質(zhì)資源方法相比，本發(fā)明鑒定在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，僅需要少量大豆新鮮葉片，取材容易，藥品、試劑的成本較低，所需實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備不多，耗費(fèi)時(shí)間短，21對(duì)特異性ssr分子標(biāo)記多態(tài)好、分辨率高，具有很好的一致性和準(zhǔn)確性，且對(duì)種子無(wú)損，容易進(jìn)行推廣。