一種同時檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法。本發(fā)明首先篩選出具有該病原體基因型特點的保守性基因片段，作為PCR檢測的三個基因靶點，分別合成擴增這些靶點基因的引物；然后將3個基因片段的3對引物放在一個PCR反應體系，建立直接從樣品中一次檢測三種病原體的三重PCR檢測方法。本發(fā)明一方面既可以準確檢測病原體，還可以對混合感染狀況進行分析，從而掌握其疫情流行發(fā)展趨勢，起到一箭雙雕的效果。另一方面其較常規(guī)PCR方法縮短了24小時的檢測時間，達到了快速檢測實際樣品的目的，并降低了成本。
【專利說明】一種同時檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜 血桿菌的三重PCR方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物【技術領域】的多重PCR檢測方法，具體是一種能同時檢測豬肺 炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法。

【背景技術】
[0002] 豬呼吸道疾病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要群發(fā)性疾病之一。研究表明，豬呼吸道疾 病是由一種或多種細菌、病毒混合感染引起的疾病。通常由病毒或支原體首先侵襲呼吸道， 破壞防御屏障，各種氣源性病菌如多殺性巴氏桿菌以及副豬嗜血桿菌等進入呼吸道和肺部 而造成繼發(fā)或混合感染。豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是的主要原發(fā) 性病原之一，由于豬群感染MPS后難以治愈，且該病難以凈化，避免接觸MPS是最有效的預 防措施，因此早期快速、準確地檢測診斷十分必要。豬肺炎支原體是一種介于細菌和病毒 之間的原核生物，其對培養(yǎng)條件要求較高，且在培養(yǎng)過程能夠使PH值升高，通過酚紅可以 看到液體培養(yǎng)基變紅，一般作為分離豬肺炎支原體的初步判斷。然而這種檢測費時且主觀 性強，難以達到準確診斷。另一個豬呼吸道常見病原體，豬多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)屬革蘭氏陰性菌，用印度墨汁等染料染色時可以看到清晰的莢膜，主要導致豬 的出急性血性敗血癥、豬肺疫和萎縮性鼻炎，常與其他病毒和細菌呈混合感染或者繼發(fā)感 染。對巴氏桿菌的鑒定多采用形態(tài)觀察、生理生化鑒定及其免疫學鑒定等傳統(tǒng)的方法，這些 方法耗時耗力且準確度差，因此僅僅依靠常規(guī)檢驗方法和臨床經驗很難對病原進行判斷， 進而會貽誤動物疫病的防控的最佳時機；而副豬嗜血桿菌則是一種革蘭氏陰性菌，能夠引 起豬纖維性漿膜炎、腦膜炎和關節(jié)炎等，且常與豬呼吸道疾病有關。副豬嗜血桿菌是比豬肺 炎支原體還要難培養(yǎng)的病原菌之一，目前對其的分離檢測要比養(yǎng)殖場實際感染率少20%以 上，其通常與豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、豬繁殖與呼吸病毒等病原菌混合感染，由于 其培養(yǎng)條件苛刻，限制了對其的研究。因此，建立一種靈敏快速的檢測豬上述呼吸道三種常 見病原體方法十分必要。
[0003] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體 系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的 PCR技術。其可在同一 PCR反應體系中同時加入多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴 增，可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。


【發(fā)明內容】

[0004] 鑒于以上三種病原體豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌均是豬場 PRDC的常見重要病原體，且往往是混合感染。傳統(tǒng)的診斷技術如細菌分離、免疫學試驗等費 時費力，不適于臨床快速診斷，也不適于大規(guī)模的流行病學調查的現(xiàn)狀，本發(fā)明目的在于克 服現(xiàn)有技術的不足，提供一種直接從樣品中一次檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和 副豬嗜血桿菌的三重PCR檢測方法。本發(fā)明方法簡單，成本低廉，檢測快速，效率高。
[0005] 本發(fā)明本著一次檢測就可以檢出樣品中三種病原體的目標，首先從已發(fā)表的文獻 中分別篩選出具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三病原體基因型特點 的保守性基因片段，作為PCR檢測的三個基因靶點，分別合成擴增這些靶點基因的引物，將 該3對引物放在一個PCR反應體系，通過各項參數(shù)調整優(yōu)化，建立直接從樣品中一次檢測三 種病原體的三重PCR檢測方法；本發(fā)明還進一步改進現(xiàn)場樣品前處理方法，通過縮短前處 理時間，進一步達到利用該三重PCR方法快速檢測實際樣品的目的。
[0006] 本發(fā)明是通過以下的技術方案實現(xiàn)的。
[0007] -種同時檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方 法，具體步驟如下：
[0008] (1)篩選具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三個病原體基因 型特點的保守性基因片段，作為PCR檢測的三個基因靶點，分別合成擴增上述靶點基因的 引物；
[0009] (2)將3對引物放在一個PCR反應體系中，擴增靶點基因；
[0010] ⑶通過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定PCR擴增產物；其中：
[0011] 擴增豬肺炎支原體的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示；擴增豬多殺性巴氏桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的 序列如SEQ ID NO. 4所示；擴增副豬嗜血桿菌的上游引物的序列如SEQID NO. 5所示；下游 引物的序列如SEQ ID NO. 6所示（見表1)。
[0012] 表1引物序列及PCR產物

【權利要求】
1. 一種同時檢測豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法， 其特征在于，具體步驟如下： (1) 篩選具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三個病原體基因型特 點的保守性基因片段，作為PCR檢測的三個基因靶點，分別合成擴增上述靶點基因的引物； (2) 將3對引物放在一個PCR反應體系中，擴增靶點基因； (3) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定PCR擴增產物；其中： 擴增豬肺炎支原體的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示； 擴增豬多殺性巴氏桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 4 所示； 擴增副豬嗜血桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 6所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步驟（1)中，豬肺炎支原體的保 守性基因片段為Sp36基因，豬多殺性巴氏桿菌的保守性基因片段為KMT基因，副豬嗜血桿 菌的保守性基因片段為Trimeric autotransporter基因。
3. 根據(jù)權利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步驟⑵中，PCR反應體系如下： cDNA模板1μ 1，3對上、下游引物各0. 5μ 1，PCR Mix 12. 5μ 1，超純水補充至50μ 1 ;PCR反 應條件：95°C預變性5min，進入95°C 60s，58°C lmin和72°C lmin的循環(huán)，循環(huán)35次，最后 72°C 延伸 5min。
4. 根據(jù)權利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，對實際待檢測樣品前處理時，選 擇豬多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體都適宜的TSB培養(yǎng)基，將現(xiàn)場采到組織樣品直接接種 在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，取菌液提取豬被檢病原體DNA樣品，作為模板，進行三重 PCR檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263845SQ201410576967
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】朱建國, 韓少鵬 申請人:上海交通大學