一種鑒別新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能鑒別新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒，由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴(kuò)混合液、二擴(kuò)混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組成。該試劑盒針對(duì)新城疫病毒F基因設(shè)計(jì)6條引物，經(jīng)過引物濃度、聚合酶濃度、退火溫度等優(yōu)化，建立了鑒別診斷方法。本發(fā)明方法靈敏度高，特異性好，既能檢測出目前流行的新城疫基因Ⅶ型流行毒株感染，又能判斷是否是Lasota疫苗接種陽性，結(jié)果直觀準(zhǔn)確，適用于大范圍新城疫疫情普查診斷，避免誤診造成的損失。
【專利說明】一種鑒別新城疫“3013疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒別新城疫匕80仏疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒，屬于動(dòng)物醫(yī)學(xué)動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(他機(jī)狀丨匕(11862186，冊(cè))是嚴(yán)重危害禽類的病毒性傳染病之一，是我國法定的一類動(dòng)物疫病。新城疫病毒(^61(^81:16 (1186886卩11~118，冊(cè)V)屬副黏病毒科、腿腺炎病毒屬有囊膜，具有能刺激宿主產(chǎn)生抑制紅細(xì)胞凝集素和病毒中和抗體的抗原成分。病毒核酸類型為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的I？嫩。在冊(cè)V基因組上依次排列著冊(cè)、
圓和I基因，分別編碼核衣殼蛋白(冊(cè)?、磷蛋白(口)、基質(zhì)蛋白⑶)、融合蛋白(口)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(圓)和大分子蛋白化)，其中？、圓蛋白與冊(cè)乂致病性密切相關(guān)。
[0003]目前，雖然國內(nèi)養(yǎng)禽場對(duì)新城疫的預(yù)防極為重視，但新城疫的流行仍頻繁發(fā)生，損失巨大。因此，及早診斷、盡快控制新城疫對(duì)減少經(jīng)濟(jì)損失有重要意義。在我國國家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》((^8/116550-2008)中，診斷方法有臨床診斷、病毒分離鑒定、血凝-血凝抑制試驗(yàn)和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(814(?)。其中臨床診斷只能初步診斷，確診方法中病毒分離鑒定、血凝-血凝抑制試驗(yàn)均需進(jìn)行病毒分離，耗時(shí)較長，不適應(yīng)臨床快速診斷的要求。奶-？0？技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，十分適合養(yǎng)殖場快速定性診斷的需要。但是，由于我國飼養(yǎng)的禽廣泛應(yīng)用新城疫活疫苗且免疫頻率高，其中以匕80仏株應(yīng)用最為廣泛，導(dǎo)致禽群中普遍存在匕80仏疫苗毒株，用常規(guī)奶-？0？診斷方法不能確定所檢測到的毒株是新城疫1^800疫苗株還是流行毒株，為臨床診斷造成極大困難。
[0004]為了解決鑒別診斷疫苗毒和流行毒這一問題，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的探索工作。1989年，0611^0^等用乂4株建立了一組特異性單抗制劑，不僅能區(qū)別的自然感染和人工免疫，而且與其他副粘病毒屬病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。但是其缺點(diǎn)是制備難度大、成本高，且目前并無商品化應(yīng)用的成熟產(chǎn)品。把!'641 8匕4等建立了價(jià)^雜交技術(shù)進(jìn)行強(qiáng)弱毒株區(qū)分，設(shè)計(jì)了 2個(gè)探針，探針長21個(gè)堿基，與強(qiáng)毒株16^8的？蛋白裂解位點(diǎn)基因互補(bǔ)，可與11個(gè)速發(fā)性毒株、5個(gè)中發(fā)性毒株的雜交，而不能與對(duì)照的7個(gè)弱毒株八雜交。但由于八雜交技術(shù)操作繁瑣，難度大，難以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，亦無商品化產(chǎn)品可以應(yīng)用，目前仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。孫軍峰等根據(jù)基因訓(xùn)型新城疫病毒？基因裂解位點(diǎn)特征設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，建立的基因VII型毒株熒光定量814(?鑒別檢測方法，特異性良好，最低可檢測到100拷貝/微升的模板咖八。但該方法的缺點(diǎn)是成本高，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，普通實(shí)驗(yàn)室無法使用且靈敏度稍低。
[0005]近年來，我國新城疫的流行特點(diǎn)出現(xiàn)了明顯變化，流行毒株以基因訓(xùn)型為主，非典型性新城疫多發(fā)，對(duì)我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的旨在提供一種用于鑒別新城疫匕80仏疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株的診斷試劑盒。
[0007]實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種鑒別新城疫匕80仏疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株的診斷試劑盒，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴(kuò)混合液、二擴(kuò)混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組成；
所述反轉(zhuǎn)錄混合液由處理滅菌水、2.5111 11101 ?5 X ^ 811打61~、25
911101.[-1麗-1？上游引物、51/ 111歷反轉(zhuǎn)錄酶和側(cè)/ 111 I歷酶抑制劑組成；每個(gè)反應(yīng)體積比為10:4:4:1:0.5:0.5，共計(jì)20 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1000 ^匕裝成1管；
所述一擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10父？0？51119 11101.11
冊(cè)乂-1？上游引物、25 1111101 ? 1^1冊(cè)乂-卟下游引物、5口/111 1*1叫0嫩聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為17:2.5:2:0.5:0.5:0.5，共計(jì)23 ^ 1,50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 9匕裝成1管；所述二擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10父？0？ 811 打6；^、2.5111911101.11
冊(cè)乂-2？上游引物、25 0 11101噸―1冊(cè)乂-21？下游引物、冊(cè)乂-3？上游引物、25 ^ 11101噸―1冊(cè)乂-3尺下游引物、5口1*1'叫0嫩聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為16:2.5:2:0.5:0.5:0.5:0.5:0.5，共計(jì)23 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 ^匕裝成1管；
所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水，每個(gè)反應(yīng)需對(duì)照250^匕50個(gè)反應(yīng)共計(jì)12500^匕分裝
10管，每管 1250 9 I ；
所述陽性對(duì)照為匕80仏疫苗株雞胚培養(yǎng)尿囊液，每個(gè)反應(yīng)需對(duì)照250 ^ 1, 50個(gè)反應(yīng)共計(jì) 12500 111,分裝 10 管，每管 1250 9 I ；
所述的引物冊(cè)[卟序列為:5’ - 60X^0X0061X6006^01 -3’
所述的引物冊(cè)[卟序列為:5’ - ^601X6X^X^60^60X6 -3’
所述的引物冊(cè)12？序列為:5’ - ^16660100^001X0X^0 -3’
所述的引物冊(cè)序列為:5’ - 01600^01601^611616^1 -3’
所述的引物冊(cè)13？序列為:5’ - ^00X06^66^666^6001 -3’
所述的引物冊(cè)[38 序列為:5’ - 1^606^1^110^600^1^0 -3’。
[0008]本發(fā)明所述的診斷試劑盒可快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異的鑒別新城疫匕如仏疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株，能夠直接從組織病料、喉頭拭子、血清或全血、糞便等臨床樣本進(jìn)行檢測診斷，為家禽生產(chǎn)保駕護(hù)航。
[0009]本發(fā)明提供上述試劑盒鑒別檢測新城疫匕80仏疫苗毒株和基因訓(xùn)型流行毒株的方法，包括以下步驟:
1)1^120106叫6社試劑法提取待檢樣品總I？嫩，空氣中自然干燥；
2)取反轉(zhuǎn)錄混合液20^ 1,充分吹吸溶解總價(jià)^，42 I水浴反轉(zhuǎn)錄90舊!!，取出置-20I下保存?zhèn)溆茫?br> 3)取一擴(kuò)混合液23^ 1,加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ^ 1,混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95預(yù)變性5 111111，然后依次為94 I，50 8 ；5200 ,60 8 ；72 I，60 8 ；共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，
最后72延伸10 111111 ；
4)取二擴(kuò)混合液23^匕加入一擴(kuò)產(chǎn)物2^匕混合均勻進(jìn)行？(?擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95V預(yù)變性5 111111，然后依次為94 I，50 8 ；55 V ,60 8 ；72 V ,60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10 111111 ； 5)10 8 - 1^1瓊脂糖凝膠中電泳；
6)結(jié)果分析:陰性對(duì)照不出條帶，陽性對(duì)照出526恥、199恥兩個(gè)條帶，說明對(duì)照成立，樣品中出現(xiàn)526恥一個(gè)條帶，即為新城疫基因訓(xùn)型流行毒株感染，樣品出526如、199恥兩個(gè)條帶，即為匕如仏疫苗毒株。
[0010]試劑盒的驗(yàn)證性試驗(yàn)
①特異性試驗(yàn)
使用本發(fā)明的診斷試劑盒，提取匕如仏疫苗毒株、勵(lì)V 3X1^株(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室分離保存，測序分析為基因訓(xùn)型流行毒株?、187、八IV冊(cè)、181^和八―總觀八，按本發(fā)明所述方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-套式復(fù)合擴(kuò)增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示匕180^1疫苗毒株出現(xiàn)526如、19%？兩個(gè)條帶，3X1^株出現(xiàn)526恥一個(gè)條帶，18乂、八IV冊(cè)、1807和仙乂均沒有出現(xiàn)條帶(見附圖0。回收各陽性樣本的條帶，純化后連接1)1018-丁載體，轉(zhuǎn)化0冊(cè)0感受態(tài)細(xì)胞，取鑒定為陽性得菌液，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測得的序列與所用毒株基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)序列完全一致。結(jié)果證實(shí)本試劑盒及檢測方法具有很高的特異性，能準(zhǔn)確擴(kuò)增基因片段，并能直接通過電泳圖直觀區(qū)分匕如仏疫苗株和基因訓(xùn)型流行毒株。
[0011]②靈敏度試驗(yàn)
使用本發(fā)明提供的診斷試劑盒，提取匕80&疫苗株總觀八，紫外分光光度計(jì)測定濃度為8.? 171，按照10倍濃度梯度稀釋至10—101，用試劑盒提供的一擴(kuò)混合液和二擴(kuò)混合液進(jìn)行套式復(fù)合？(?，擴(kuò)增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒能檢測的極限為8.5X10^ - 171，提示本方法靈敏度極高(見附圖1、。
[0012]③穩(wěn)定性試驗(yàn)
本發(fā)明提供的診斷試劑盒保存條件為-201，每月1次用匕80仏疫苗毒株、3X1^株及對(duì)照進(jìn)行檢測試驗(yàn)，連續(xù)檢測6個(gè)月，檢測試劑盒存放的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，所述6個(gè)月的試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明試劑盒有良好的穩(wěn)定性。
[0013]④田間試驗(yàn)
采集了陜西省臨床疑似新城疫組織病料、血清以及喉頭棉拭子73份，用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法進(jìn)行診斷，同時(shí)以奶-成⑶方法進(jìn)行平行檢測試驗(yàn)。結(jié)果本發(fā)明的檢出陽性率為30.1% (22/73),奶-成⑶方法檢出陽性率為26% (19/73),結(jié)果提示本發(fā)明靈敏度更高(見附圖3)0
[0014]本發(fā)明采用套式？⑶擴(kuò)增，且目的片段較小，保證了反應(yīng)的高靈敏度。檢測總時(shí)間控制在6小時(shí)左右，達(dá)到了快速檢測的目的。本發(fā)明能徹底解決新城疫匕如仏疫苗毒株和流行最為普遍的新城疫基因訓(xùn)毒株的鑒別診斷問題，且檢測需時(shí)短、靈敏度高、特異性好，非常適合新城疫疫情的大面積快速檢測普查，適用于各實(shí)驗(yàn)室、動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心以及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。該試劑盒操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高、特異性好。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明試劑盒及方法特異性試驗(yàn)電泳圖；
圖中1為012000 0嫩分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為匕80仏疫苗毒株，2為新城疫基因VII型3父顆毒株，3為187活疫苗毒株,4為八IV ?。?毒株，5為1807活疫苗毒株,6為八―毒株。
[0017]圖2為本發(fā)明試劑盒及方法靈敏度試驗(yàn)電泳圖；
圖中1為012000 0嫩分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，廣10為匕80仏疫苗毒株⑶嫩梯度稀釋，濃度范圍為 8.5X10^8.[―1 ?8.5X10^8.[―1。
[0018]圖3為本發(fā)明試劑盒對(duì)部分臨床樣品檢測結(jié)果；
圖中1為012000 0嫩分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1-6為部分組織病料陽性檢測結(jié)果。其中1、4為疫苗毒匕80仏株陽性結(jié)果，2、3、5、6為新城疫基因訓(xùn)型型野毒陽性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)敘述。
[0020]實(shí)施例1。
[0021]1.引物的設(shè)計(jì)與制備
參考上公布的全基因組序列，結(jié)合本課題組數(shù)年研究測定的基因序列，用0嫩義虹生物軟件綜合分析比對(duì)，針對(duì)？基因設(shè)計(jì)了 6條引物冊(cè)7-1？、
冊(cè)乂-2？、^07-3？和冊(cè)7-31？，所述引物的序列如下:
冊(cè)乂-1？:5’ -601^01006116006^01-3^ ；
冊(cè)乂-卟:5’ -^601161^1^60^6016-3^ ；
冊(cè)乂-2？:5’ -^16660100^001101^0-3^ ；
冊(cè)乂-21？:5’ -01600^01601^611616^1-3^ ；
冊(cè)乂-3？:5’ -^00106^66^666^6001-3^ ；
冊(cè)乂-31？:5’ -1^606^1^110^600^1^0-3^ ；
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0022]2.陰、陽性對(duì)照的制備
陰性對(duì)照為滅菌三蒸水，陽性對(duì)照為匕80仏疫苗株雞胚培養(yǎng)尿囊液。
[0023]3.試劑盒的制備本試劑盒由以下組分組成:
①反轉(zhuǎn)錄混合液:由02？?:處理滅菌水、2.5111 11101 ?5 X ^ 811打61~、25
911101.[-1麗-1？上游引物、51/ 111歷反轉(zhuǎn)錄酶和側(cè)/ 111 I歷酶抑制劑組成；每個(gè)反應(yīng)體積比為10:4:4:1:0.5:0.5，共計(jì)20 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1000 ^匕裝成1管；
②一擴(kuò)混合液:由滅菌三蒸水、10父？0？51119 11101.11冊(cè)乂-1？上游引物、25 1111101 ? 1^1冊(cè)乂-卟下游引物、5口/111 1*1叫0嫩聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為17:2.5:2:0.5:0.5:0.5，共計(jì)23 ^ 1,50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 9匕裝成1管；
③二擴(kuò)混合液:由滅菌三蒸水、10父？0？51119 11101.11冊(cè)乂-2？上游引物、25 0 11101噸―1冊(cè)乂-21？下游引物、冊(cè)乂-3？上游引物、25 ^ 11101噸―1冊(cè)乂-3尺下游引物、5口1*1'叫0嫩聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為16:2.5:2:0.5:0.5:0.5:
0.5:0.5，共計(jì)23 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 ^匕裝成1管；
④陰性對(duì)照:為滅菌三蒸水，每個(gè)反應(yīng)需對(duì)照250^ 1, 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)12500 ^ 1,分裝10管，每管1250 4 I。
[0024]⑤陽性對(duì)照:為1880^8疫苗株雞胚培養(yǎng)尿囊液，每個(gè)反應(yīng)需對(duì)照250 ^ 1, 50個(gè)反應(yīng)共計(jì)12500 111,分裝10管，每管1250 ^ I。
[0025]本發(fā)明試劑盒保存條件為-20 V。
[0026]實(shí)施例2。
[0027]1.引物的設(shè)計(jì)與制備同實(shí)施例1。
[0028]2.組織病料樣品的處理與八提取
①取疑似新城疫組織病料如肺臟、脾臟或氣管3?58，剪碎成糊狀，加5倍無菌？83，用組織研磨器充分研磨，收集懸液，4 00?12 000 ^/舊!!離心15 111111，取上清液250 [加入到無菌無I？嫩酶的2？管，同時(shí)做試劑盒中提供的陰、陽性對(duì)照，給以上各管中加入750^ II'尺1201尺6叫6111:，顛倒混勻后于靜置5 1111110
[0029]②加入200^1預(yù)冷的氯仿(4 I保存),充分振蕩至乳化均勻，于41靜置15 -11。
[0030]③于41 12 000 1-/111111離心15 111111，取出2？管，輕輕吸取上層水相約450 ^ [轉(zhuǎn)移入另一管。
[0031]④加入等體積的冰冷異丙醇(-20 I保存),顛倒混勻后置-201過夜，充分沉淀核酸。
[0032]⑤于41、12 000離心10 111111，取出管，棄去上清液，加入1 III[冰冷的75%乙醇(-201保存),顛倒數(shù)次洗滌核酸。
[0033]⑥于41、12 000 1-/111111離心5砧!!，取出2？管，棄去上清液，倒置2？管干燥核酸。
[0034]3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測冊(cè)V
①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液209 1,反復(fù)吹打離心管管底核酸，充分溶解后離心，置于42 V水浴反轉(zhuǎn)錄90111111，取出備用；
②吸取一擴(kuò)混合液230 1,加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ^ 1,混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 I預(yù)變性5 111111,94 V 50 8,52 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10砧打；
③吸取二擴(kuò)混合液23^ 1,加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 ^匕混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95預(yù)變性5 0111,95 V 50 8,55 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 I延伸
10 111111 ；即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0035]實(shí)施例3。
[0036]1.引物的設(shè)計(jì)與制備同實(shí)施例1。
[0037]2.血清或全血樣品的處理與提取
①取分離得到待檢禽血清或采集的禽全血250 9 I加入到無菌無璧酶的管，同時(shí)做試劑盒中提供的陰、陽性對(duì)照，給以上各管中加入750^ I 101201 06叫6111:，顛倒混勻后于 41 靜置 5 111111。
[0038]②加入200^ I預(yù)冷的氯仿(4 I保存),充分振蕩至乳化均勻，41靜置15 ―!!。
[0039]③于41、12 000 1-/111111離心15 111111，取出2？管，輕輕吸取上層水相約450 ^ [轉(zhuǎn)移入另一管。
[0040]④加入等體積的冰冷異丙醇(-20 I保存),顛倒混勻后置-201過夜，充分沉淀核酸。
[0041]⑤于4。0、12 000離心10砧^，取出管，棄去上清液，加入1 III[冰冷的75%乙醇(-201保存),顛倒數(shù)次洗滌核酸。
[0042]⑥于41、12 000 1-/111111離心5砧!!，取出2？管，棄去上清液，倒置2？管干燥核酸。
[0043]3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測冊(cè)V
①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液209匕反復(fù)吹打離心管管底核酸，充分溶解后瞬間離心，置于42水浴反轉(zhuǎn)錄90111111，取出備用；
②吸取一擴(kuò)混合液230 1,加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ^ 1,混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 I預(yù)變性5 111111,94 V 50 8,52 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10砧打；
③吸取二擴(kuò)混合液23^ 1,加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 ^匕混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95預(yù)變性5 0111,94 V 50 8,55 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 I延伸
10111111 ；即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0044]實(shí)施例4。
[0045]1.引物的設(shè)計(jì)與制備同實(shí)施例1。
[0046]2.喉頭棉拭子或糞便棉拭子樣品的處理與八提取
①將待檢禽喉頭棉拭子或糞便棉拭子置于1 1111滅菌？83緩沖液中，充分?jǐn)D壓，4000 X！111111離心10 111111,取250 4 I上清液加入到無菌無I？嫩酶的管，同時(shí)做試劑盒中提供的陰、陽性對(duì)照，給以上各管中加入750 4 I 101201 06叫6111:，顛倒混勻后于41^靜置5 1111110
[0047]②加入200 0 I預(yù)冷的氯仿(4 I保存),充分振蕩至乳化均勻，41靜置15 ―!!。
[0048]③于41、12 000 1-/111111離心15 111111，取出2？管，輕輕吸取上層水相約450 ^ [轉(zhuǎn)移入另一管。
[0049]④加入等體積的冰冷異丙醇(-20 I保存),顛倒混勻后置-201過夜，充分沉淀核酸。
[0050]⑤于41、12 000離心10 111111，取出管，棄去上清液，加入1 III[冰冷的75%乙醇(-201保存),顛倒數(shù)次洗滌核酸。
[0051]⑥于41、12 000『加丨!!離心5砧!!，取出管，棄去上清液，倒置管干燥核酸。
[0052]3.用本發(fā)明試劑盒鑒別檢測冊(cè)V
①吸取反轉(zhuǎn)錄混合液209匕反復(fù)吹打離心管管底核酸，充分溶解后瞬間離心，置于42水浴反轉(zhuǎn)錄90111111，取出備用；
②吸取一擴(kuò)混合液230 1,加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ^ 1,混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 I預(yù)變性5 111111,94 V 50 8,52 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10砧打；
③吸取二擴(kuò)混合液23^ 1,加入一擴(kuò)產(chǎn)物2 ^匕混合均勻進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95預(yù)變性5 0111,94 V 50 8,55 V 60 8,72 V 60 8共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 I延伸
10111111 ；即得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0053]結(jié)果判定
1.稱取1.08瓊脂糖，加入100此1X1仙緩沖液中，微波爐中加熱融化，加入5仏(100^/此)溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5臟，待冷卻凝固后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1X1^2緩沖液淹沒膠面；
2.分別取59 I上述實(shí)施例2?實(shí)施例4所得擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液混勻，加入加樣孔中，同時(shí)加5 11 1012000 0嫩分子量標(biāo)準(zhǔn)；
3.電壓80V?1007，或電流40 —?50—，電泳300111 ；
4.取出凝膠，置入紫外分析儀中觀察，或置入凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相；
5.以0120000嫩分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為參照，陰性對(duì)照不出條帶，陽性對(duì)照出526如、199吣兩個(gè)條帶，說明對(duì)照成立，樣品中出現(xiàn)526恥一個(gè)條帶，即為新城疫基因訓(xùn)型流行毒株感染，樣品出526恥、199恥兩個(gè)條帶，即為新城疫匕如仏疫苗毒株。
【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒別新城疫Lasota疫苗毒株和基因VII型流行毒株復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴(kuò)混合液、二擴(kuò)混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組成； 所述反轉(zhuǎn)錄混合液由DEPC處理滅菌水、2.5m mo I.L_1dNTP,5XAMV Buffer、25μ mo I.Γ1 NDV-1F上游引物、5U/ μ L AMV反轉(zhuǎn)錄酶和40U/ μ L HPR I RNA酶抑制劑組成；每個(gè)反應(yīng)體積比為10:4:4:1:0.5:0.5，共計(jì)20 μ L，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1000 μ L，裝成I管；所述一擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10XPCR Buffer、2.5m mol.L ΜΝΤΡ、25 μ mo I.L 1NDV-1F上游引物、25 μ mol.Γ1 NDV-1R下游引物、5U/μ L rTaq DNA聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為17:2.5:2:0.5:0.5:0.5，共計(jì)23 μ L，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 μ L，裝成I管；所述二擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10XPCR Buffer、2.5m mol.L ΜΝΤΡ、25 μ mol.L 1NDV-2F 上游引物、25 μ mo I.Γ1 NDV-2R 下游引物、NDV-3F 上游引物、25 μ mo I.Γ1 NDV-3R下游引物、5U/yL rTaq DNA聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為16:2.5:2:0.5:0.5:0.5:0.5:0.5，共計(jì)23 μ L，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150 μ L，裝成I管； 所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水，每個(gè)反應(yīng)對(duì)照為250 μ L，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)12500 μ L，分裝成10管,每管為1250 μ L ； 所述陽性對(duì)照為Lasota疫苗株雞胚培養(yǎng)尿囊液，每個(gè)反應(yīng)對(duì)照為250 μ L，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)12500 μ L，分裝成10管，每管為1250 μ L ； 所述的引物 NDV-1F 序列為:5’ - GCTAACTCCGTTGCCGACT -3’ ； 所述的引物 NDV-1R 序列為:5’ - AAGCTTGTATAAAGCAGCTG -3’ ； 所述的引物 NDV-2F 序列為:5’ - ATGGGCYCCAGACCTTCTAC -3’ ； 所述的引物 NDV-2R 序列為:5’ - CTGCCACTGCTAGTTGTGAT -3’ ； 所述的引物 NDV-3F 序列為:5’ - ACCTCGAGGAGGGAGCCT -3’ ； 所述的引物 NDV-3R 序列為:5’ - TAGCGATATTCAGCCATAC -3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104313183SQ201410576841
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月25日
【發(fā)明者】朱小甫, 吳旭錦 申請(qǐng)人:咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院