雞球蟲病三價活疫苗及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞球蟲病三價活疫苗，由柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲三種艾美耳球蟲分離、純化、培養(yǎng)后的孢子化球蟲卵囊采用烷化劑類化學(xué)誘變劑進(jìn)行一級致弱、一級致弱株培養(yǎng)的小雞所得卵囊采用物理誘變因素紫外線照射進(jìn)行二級致弱得到的三種二級致弱株混合制成。進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了上述雞球蟲病三價活疫苗的制備方法和用途。本發(fā)明的雞球蟲病三價活疫苗采用雙重致弱，誘變率高、毒力低，免疫效果穩(wěn)定。
【專利說明】雞球蟲病三價活疫苗及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到用于免疫由球蟲導(dǎo)致的疾病的疫苗，屬于免疫生物學(xué)與生物病理學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)的原蟲病，該病是由孢子蟲綱、艾美耳科、艾美耳屬的9種艾美耳球蟲引起的。據(jù)報道，全世界每年因雞球蟲病造成高達(dá)30億美元經(jīng)濟(jì)損失，在美國每年因球蟲病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失約為6.4億美元，而我國每年支出的抗球蟲藥物費(fèi)用約為6-8億元人民幣，占雞病全部防治費(fèi)用的近三分之一，隨著我國集約化養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，這一數(shù)據(jù)還會急劇上升。
[0003]由于球蟲是經(jīng)口 -糞的簡單途徑傳播，常用消毒劑對其幾乎沒有殺滅作用。因此該病流行極為廣泛，可以說凡是養(yǎng)雞的地方就有球蟲存在。
[0004]自20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物具有抗球蟲作用以來，家禽球蟲病的防治一直主要依靠抗球蟲藥物，但艾美耳球蟲對抗球蟲藥物的抗藥性已嚴(yán)重影響了采用藥物防治家禽球蟲病的效果。同時，抗球蟲藥物的殘留等潛在危害逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)幾種化學(xué)治療藥物殘留在肉中，使得其不適于消費(fèi)。日本已于2005年宣布禁止進(jìn)口應(yīng)用雞球蟲凈的雞；歐盟自2006年起在飼料中全面禁用抗生素類作為飼料添加劑，包括抗球蟲藥莫能菌素和鹽霉素，從2010年開始全面禁用所有抗球蟲藥。因此，傳統(tǒng)的以抗球蟲藥物預(yù)防為主的雞球蟲病的防控策略將 逐漸過渡為采用免疫控制，即使用球蟲病疫苗。
[0005]近20年間，我國對于雞球蟲病活卵囊疫苗的研究有了重大進(jìn)展。至今，已有上海獸醫(yī)研究所、北京農(nóng)學(xué)院、齊魯動物保健品公司和佛山市正典生物技術(shù)有限公司等多家研制單位的產(chǎn)品獲得雞球蟲疫苗，球蟲活苗是實(shí)際生產(chǎn)中唯一可替代抗球蟲藥物以控制球蟲病的手段。雞在低水平感染球蟲時不會發(fā)病，經(jīng)過3次左右生活史循環(huán)，雞體可產(chǎn)生較好的保護(hù)性免疫力。市面上銷售的球蟲疫苗就是基于這個原理，球蟲活疫苗分為強(qiáng)毒苗和弱毒苗。
[0006]強(qiáng)毒苗是直接從自然發(fā)生球蟲病雞的腸道內(nèi)或糞便中分離出來的蟲株，因致病力強(qiáng)且無耐藥性，故為藥物敏感株。疫苗的制作一般直接從自然發(fā)生球蟲病腸道或者糞便中，運(yùn)用飽和鹽水漂浮法收集球蟲混合卵囊，并采用單卵囊分離并增殖各種艾美耳球蟲卵囊，按一定比例混合后配以適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑組成的活疫苗。但是強(qiáng)毒球蟲苗也存在一些無法避免的弊端:在疫苗接種至產(chǎn)生免疫力期間，不得使用任何抗球蟲藥，否則可能導(dǎo)致免疫效果不好；由于強(qiáng)毒苗毒力較強(qiáng)，使用不當(dāng)也可能會引起球蟲病的暴發(fā)；強(qiáng)毒苗中所含的球蟲卵囊在水中沉降較快，易造成免疫不均勻，必須尋找較好的懸浮劑搭配使用；接種強(qiáng)毒球蟲苗，可能將強(qiáng)毒球蟲引入新雞場。
[0007]弱毒疫苗是指通過人為方法減弱艾美耳蟲株的致病性所得到的致弱蟲株，可以降低對宿主的危害，并產(chǎn)生足夠的免疫力。與強(qiáng)毒疫苗相比，這一類疫苗致病性較小，并具有較高的抗球蟲效力和安全性。通常采用對親代蟲株反復(fù)傳代和篩選，使蟲株的內(nèi)生發(fā)育周期縮短，形成了不同于親本株生物學(xué)特性的早熟株，用來制取弱毒疫苗，但早熟株也有弊端，如免疫原性高,相應(yīng)毒力較弱,無法產(chǎn)生較好的免疫力等。
[0008]由此可見，本領(lǐng)域還急需開發(fā)毒性低、對生物體影響小的雞球蟲病三價活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對現(xiàn)有技術(shù)的需要，本發(fā)明公開了一種雞球蟲病三價活疫苗，通過采用雙重致弱方法制成，所得到疫苗誘變率高、毒力低、性能穩(wěn)定，并且其安全性高，毒力較弱，降低了對宿主的危害性。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0011]一種雞球蟲病三價活疫苗，由柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲三種艾美耳球蟲分離、純化、培養(yǎng)后的孢子化球蟲卵囊采用烷化劑類化學(xué)誘變劑進(jìn)行一級致弱、一級致弱株培養(yǎng)的小雞所得卵囊采用物理誘變因素紫外線照射進(jìn)行二級致弱得到的三種二級致弱株混合制成。
[0012]其中，柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲是三個國內(nèi)主要球蟲蟲種的卵囊，其球蟲蟲種形態(tài)及生物學(xué)特性已經(jīng)經(jīng)過本領(lǐng)域廣泛研究:柔嫩艾美耳球蟲卵囊平均大小為22.6X19.0微米，外形為卵圓形，呈淡綠色，主要寄生部位為盲腸，孢子化時間約48小時，潛伏期為168小時；巨型艾美耳球卵囊平均大小為30.5X22.6微米，外觀為卵形，呈黃褐色，主要寄生部位為小腸中斷，孢子化時間約72小時，潛伏期為156小時；毒害艾美耳球蟲卵囊平均大小為16.7X14.3微米，外觀為長圓形，無色，主要寄生部位為小腸中斷和盲腸，孢子化時間約48小時，潛伏期為168小時。
[0013]其中，所用烷化劑類化學(xué)誘變劑可以是疫苗領(lǐng)域任意可用的類型，通常由重鉻酸鉀、二甲基亞砜、氯化鈉、碳酸氫鈉、NTG、環(huán)磷酰胺加入到蒸餾水組成。
`[0014]優(yōu)選的，本發(fā)明所用烷化劑類化學(xué)誘變劑組成為重鉻酸鉀350_500g、二甲基亞砜10_20ml、氯化鈉l_3g、碳酸氫鈉l_3g、NTG5_10ml、環(huán)磷酰胺0.01-0.03mg、蒸懼水1500-2000ml。
[0015]通過采用上述化學(xué)誘變劑，能與核苷酸分子中的磷酸基、嘌呤、嘧啶基起烷化作用，或與DNA分子作用而造成DNA損傷。使鳥嘌呤N7位氮原子上發(fā)生烷基化或使β -糖苷鍵活化而造成脫嘌呤作用。
[0016]在本發(fā)明中，所用物理誘變因素紫外線照射，紫外光源15-20瓦，波長200_300nm，照射時間:230-300秒，其中卵囊懸液距離紫外光源25-30cm。
[0017]通過采用紫外線照射，紫外線照射引起的損傷分為直接和間接兩種，直接損傷是照射直接對靶分子作用結(jié)果，主要是形成嘧啶二聚體妨礙DNA雙鏈的正常拆開和復(fù)制。間接損傷是照射引起蛋白質(zhì)合成抑制。
[0018]將上述以化學(xué)方法與物理方法進(jìn)行雙重致弱，使得本發(fā)明的疫苗在不改變球蟲卵囊免疫原性的基礎(chǔ)上降低了卵囊的致病性。
[0019]相應(yīng)的，本發(fā)明提供了所述雞球蟲病三價活疫苗的制備方法，包括下述步驟:1)將柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲三種艾美耳球蟲的球蟲卵囊進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)得到孢子化卵囊；2)將步驟I)所得孢子化卵囊采用烷化劑類化學(xué)誘變劑進(jìn)行化學(xué)致弱，經(jīng)分離、收集后分別配制成卵囊懸浮液制成一級致弱株；3)將一級致弱株與雞飼料混合喂給小雞，宰殺小雞從腸道收集卵囊，將收集到的三種卵囊分別用重鉻酸鉀溶液保存，經(jīng)孢子化過程后離心分離；4)將步驟3)收集到的卵囊分別離心去除重鉻酸鉀，用重蒸水配成卵囊懸液，將卵囊懸液在流動狀態(tài)下采用紫外線下照射；5)照射結(jié)束后，卵囊重新加入到重鉻酸鉀溶液中，即得二級致弱株；6)將三種二級雙重致弱株分別進(jìn)行孢子化卵囊計(jì)數(shù)，混勻并稀釋即得一次、二次用雙重致弱的三價球蟲苗混懸液，將三種雙重致弱三價球蟲苗混懸液分別充分混勻后混合制成球蟲三價活疫苗進(jìn)行分裝。
[0020]其中，所述步驟I)具體包括下述步驟:將生理鹽水與糞便攪成混懸液；將混懸液經(jīng)濾過后離心棄去上清液，向沉淀中加入飽和鹽水充分混勻，離心所得沉淀物即為所需球蟲卵囊；從病雞的盲腸和小腸刮取內(nèi)容物和粘膜，加入生理鹽水后過濾純化，然后采用生理鹽水沖洗，離心洗滌后收集沉淀，所得沉淀物用胰酶和膽汁在水浴箱內(nèi)消化，消化期間間歇搖動，離心洗滌后將沉淀物攪拌均勻加入到重鉻酸鉀溶液中，在28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，間歇搖動，完成卵囊的孢子化 。
[0021]其中所用的飽和鹽水是指比重不低于1.18的氯化鈉溶液；所用的糞便是指患有球蟲病的雞的糞便，生理鹽水與糞便的混合比例不受到特別限制，優(yōu)選的采用糞便與五倍于糞便體積的生理鹽水；上述的濾過通常采用符合所需目的的網(wǎng)篩一次或多次過濾實(shí)現(xiàn)；離心通過將濾過液加入到離心管中在離心機(jī)中進(jìn)行離心，離心速度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要選擇，通常是在2000-3000rpm離心1-1Omin ;上述的胰酶和膽汁采用動物疫苗領(lǐng)域所常用的濃度，即0.5-1.5%胰酶和4% -8%膽汁(用0.01M pH8.0PBS稀釋)。
[0022]在上述過程中，離心的次數(shù)可以為一次或多次。
[0023]其中，步驟2)所用的化學(xué)致弱劑即為上述的烷化劑類化學(xué)誘變劑。
[0024]其中，步驟4)的卵囊懸液濃度為40-80萬個卵囊/ml，所用物理誘變因素紫外線照射，紫外光源15-20瓦，波長200-300nm，照射時間:230-300秒，其中卵囊懸液距離紫外光源25-30cm，照射過程中卵囊懸液處于流動狀態(tài)。
[0025]其中，步驟6)三種卵囊數(shù)量經(jīng)計(jì)算配制需要量，分別準(zhǔn)確移取計(jì)算得到的三種卵囊數(shù)量，混勻并適當(dāng)稀釋后，即得一次、二次用雙重致弱的三價球蟲苗混懸液。三種雙重致弱三價球蟲苗混懸液的混合比例，優(yōu)選為根據(jù)每瓶羽份數(shù)換算得的混懸液量按1:1:1的比例混合制成球蟲三價活疫苗進(jìn)行分裝。
[0026]其中，上述所用的重鉻酸鉀溶液為疫苗領(lǐng)域常用濃度，即2.5%的重鉻酸鉀溶液。
[0027]相應(yīng)的，在上述基礎(chǔ)上本發(fā)明還公開了所述雞球蟲病三價活疫苗用于雞中誘導(dǎo)雞應(yīng)答反應(yīng)的用途。
[0028]上述的劑量，用藥途徑等可以根據(jù)使用的方便采用拌料或飲水免疫均可，應(yīng)用疫苗的頻率也可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，例如肉雞3、8、16日齡，蛋雞、種雞于3、10、20日齡各進(jìn)行一次口服免疫等；或者將蟲苗加適量水稀釋，拌入少量飼料內(nèi)，然后逐步擴(kuò)大拌料量至飼喂一頓的量，充分?jǐn)噭?，以手捏不出水，放手即松散為宜。將拌有蟲苗的飼料均勻散于一塊或多塊薄膜上，投喂已斷食3小時的雛雞；或者采用飲水免疫:免疫前一天根據(jù)免疫雞數(shù)算好用水量，按0.3 %比例加入懸浮劑羧甲基纖維素鈉，攪拌混勻的懸浮液。次日，將蟲苗倒入懸浮液中，攪拌混勻，放入飲水用具內(nèi)，投喂已斷水3小時的雛雞。
[0029]與其他方式相比，由于飲水免疫的方式省工省時省錢，比于飼料中長期添加抗球蟲藥物大大減少了勞動量，可提高工效數(shù)倍或數(shù)十倍，能顯著降低飼養(yǎng)成本，還避免了抗藥性的產(chǎn)生和藥殘問題，因此優(yōu)選采用此種方式和用量進(jìn)行接種。
[0030]進(jìn)一步的，為了確保雞體在獲得高效價體液免疫時提高雞體細(xì)胞免疫水平，本發(fā)明的應(yīng)用中還包括將所述雞球蟲病三價活疫苗與免疫激活劑聯(lián)合使用。
[0031]通過上述聯(lián)合應(yīng)用，在致弱蟲苗發(fā)揮特異性免疫的同時，輔以細(xì)菌免疫激活劑(通常為短小棒狀桿菌)的非特異性免疫，從而產(chǎn)生協(xié)同作用。
[0032]上述免疫激活劑的使用方式可采用本領(lǐng)域已有方式，即將免疫激活劑用潔凈蒸餾水充分溶解后，根據(jù)每瓶份數(shù)換算得的溶液進(jìn)行分裝，可得免疫激活劑半成品，將上述半成品入半成品庫保存即可。
[0033]本發(fā)明的雞球蟲病三價活疫苗針對我國雞球蟲病發(fā)病規(guī)律與病型特點(diǎn)所開發(fā)，是一種天然生物免疫制劑，對雞球蟲病的保護(hù)率高，毒力低，安全無毒無公害，免疫效果好，有利于促進(jìn)我國養(yǎng)雞業(yè)生態(tài)環(huán)境的控制及疫病防治技術(shù)的提高和推廣，將有效地提高肉、禽蛋品質(zhì)，推動我國綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)和無公害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對提高我國養(yǎng)殖業(yè)效益起到積極地促進(jìn)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0034]在下述實(shí)施例中 申請人:提供了一種本發(fā)明疫苗的具體制備過程，僅作為優(yōu)選示例，不采用下述方法所采用的具體用量、時間、強(qiáng)度、溫度等各種參數(shù)，采用其它方式亦可。
[0035]采用以下過程制備本發(fā)明的活疫苗:
[0036]1.將柔嫩、毒害、巨型三種艾美耳球蟲分別進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)。
[0037](一 )球蟲卵囊的分離:在1000ml開水中加食鹽380g，充分?jǐn)嚢璧玫奖戎丶s1.18的飽和鹽水溶液。將糞便和5倍于糞便體積的生理鹽水?dāng)嚦苫鞈乙?，將糞便混懸液先經(jīng)50目網(wǎng)篩濾過，然后經(jīng)100-200目網(wǎng)篩濾過到第二個容器中，并將第二個容器中的濾過液倒入離心管中，離心(3000rpm，3min)，棄去上清液，向沉淀中加入10倍的飽和鹽水充分混勻，離心(3000rpm，3min)，沉淀物即為所需卵囊。
[0038](二)球蟲卵囊的純化:分別取病雞的盲腸(柔嫩和毒害艾美耳球蟲)和小腸中斷(巨型艾美耳球蟲)縱向剪開，刮取其內(nèi)容物和粘膜，加入少量生理鹽水。先經(jīng)60目銅網(wǎng)篩濾過然后經(jīng)80目-200目銅網(wǎng)篩濾過,逐步純化。將濾液離心(2000rpm, IOmin),反復(fù)用大量生理鹽水沖洗，離心洗滌3次，收集沉淀，沉淀物用0.5-1.5%胰酶和4% -8%膽汁(用
0.01M pH8.0PBS稀釋)在41°C水浴箱內(nèi)消化1_2小時，消化期間間歇搖動，離心(3000rpm，5min)洗滌3次，沉淀物攪拌均勻后置于10倍體積量的2.5%重鉻酸鉀溶液中，在28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72-96h，保持所需濕度并間歇搖動，完成卵囊的孢子化。
[0039]當(dāng)卵囊孢子化率達(dá)80%以上即可收集，然后將孢子化的卵囊液置4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。將上述分離、收集后的卵囊分別配制成適當(dāng)含量的卵囊懸浮液備用。
[0040]2.構(gòu)造一級致弱株
[0041]采用下述成分混合均勻作為化學(xué)致弱劑，
[0042]重鉻酸鉀350-500g

二甲基亞砜 10-20ral
氣化鈉l-3g
碳酸it鈉l_3g
NTG5-10ml
環(huán)鱗酸胺0.01-0.03mg
蒸餾水1500-2000ral,
[0043]將柔嫩、毒害和巨型艾美耳球蟲的孢子化卵囊采用化學(xué)誘變劑進(jìn)行化學(xué)致弱，經(jīng)分離、收集后分別配制成適當(dāng)含量的卵囊懸浮液制成一級致弱株保存?zhèn)溆谩?br> [0044]3.構(gòu)造二級致弱株
[0045]將孵化出的SPF (無特定病原)小雞在飼養(yǎng)房中飼喂到適宜日齡(根據(jù)需要可以進(jìn)行選擇，不受到限制)后，將柔嫩、毒害、巨型三種一級致弱株與粉碎、過篩后的雞飼料混合，喂給SPF小雞接種傳代，并 分組喂養(yǎng)。在適宜日齡宰殺小雞從腸道有效部位收集卵囊，將收集到的三種卵囊分別用2.5%的重鉻酸鉀溶液保存，經(jīng)過孢子化過程后進(jìn)行離心分離，將收集到的卵囊分別離心去除重鉻酸鉀，然后用重蒸水配成濃度為40-80萬個卵囊/ml的卵囊懸液，所用物理誘變因素紫外線照射，紫外光源15-20瓦，波長200-300nm，照射時間:230-300秒。為了保證有效照射，紫外線照射裝置預(yù)開15min，卵囊懸液距離紫外光源25-30cm，照射過程中卵囊懸液處于流動狀態(tài)。照射結(jié)束后，卵囊返回10倍量的2.5%重鉻酸鉀中，即為二級致弱株。
[0046]4.制備成球蟲三價活疫苗
[0047]將柔嫩、毒害、巨型三種二級致弱株(即雙重致弱株)分別進(jìn)行孢子化卵囊計(jì)數(shù)，并根據(jù)兩次免疫時三種卵囊數(shù)量的不同技術(shù)需要，經(jīng)計(jì)算配制需要量，分別準(zhǔn)確移取計(jì)算得到的三種卵囊數(shù)量，混勻并適當(dāng)稀釋后，即得一次、二次用雙重致弱的三價球蟲苗混懸液。雙重致弱三價球蟲苗混懸液分別充分混勻后，根據(jù)每瓶羽份數(shù)換算得的混懸液量按1:1:1的比例混合制成球蟲三價活疫苗進(jìn)行分裝。
[0048]在制備得到上述疫苗后， 申請人:對3種艾美耳球蟲與5代雙重致弱株一些生物學(xué)特性，包括卵囊的形態(tài)特征、內(nèi)生性發(fā)育速率(隱伏期)、致病性及藥物敏感性(耐藥性)等方面進(jìn)行了廣泛的比較研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示:烷化劑類化學(xué)誘變劑處理和物理誘變因素紫外線照射雙重致弱并不影響E.tenella、E.necatrix、E.maxima卵囊的形態(tài)特征,但有效減慢了卵囊的內(nèi)生性發(fā)育速率，使3種球蟲卵囊的隱伏期延長了約5-8h。尤其是E.necatrix隱伏期遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)中所能達(dá)到的99h，由此可見雙重致弱降低了球蟲卵囊的致病性并恢復(fù)了耐藥株對藥物的敏感性，這些特性的改變是穩(wěn)定的、可遺傳的。
[0049]同時， 申請人:還對E.tenella強(qiáng)毒株與雙重致弱株的免疫原性做了比較，證實(shí)二者的免疫原性未發(fā)生變化，均能激發(fā)雛雞產(chǎn)生對球蟲感染的高度免疫。雙重致弱在不改變球蟲卵囊免疫原性的基礎(chǔ)上降低了卵囊的致病性，是一種優(yōu)異的弱毒疫苗。
[0050]將上述制備的活疫苗與免疫激活劑成品聯(lián)用，在致弱蟲苗發(fā)揮特異性免疫的同時，輔以細(xì)菌免疫激活劑的非特異性免疫的配套協(xié)同作用，能夠確保雞體在獲得高效價體液免疫時提高雞體細(xì)胞免疫水平，從而降`低球蟲病的死亡率。
【權(quán)利要求】
1.一種雞球蟲病三價活疫苗，其特征在于將柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲三種艾美耳球蟲分離、純化、培養(yǎng)后的孢子化球蟲卵囊采用烷化劑類化學(xué)致弱劑進(jìn)行一級致弱、一級致弱株培養(yǎng)的小雞所得卵囊采用物理誘變因素紫外線照射進(jìn)行二級致弱得到的三種二級致弱株混合制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞球蟲病三價活疫苗，其特征在于所用烷化劑類化學(xué)誘變劑由重鉻酸鉀、二甲基亞砜、氯化鈉、碳酸氫鈉、NTG、環(huán)磷酰胺加入到蒸餾水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞球蟲病三價活疫苗，其特征在于烷化劑類化學(xué)誘變劑組成為重鉻酸鉀350-500g、二甲基亞砜10-20ml、氯化鈉l_3g、碳酸氫鈉l_3g、NTG5_10ml、環(huán)磷酰胺 0.01-0.03mg、蒸餾水 1500-2000ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞球蟲病三價活疫苗，其特征在于物理誘變因素紫外線照射光源為15-20瓦，波長為200-300nm，照射時間230-300秒。
5.雞球蟲病三價活疫苗的制備方法，其特征在于包括下述步驟:1)將柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲三種艾美耳球蟲的球蟲卵囊進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)；2)將步驟I)所得孢子化卵囊采用烷化劑類化學(xué)誘變劑進(jìn)行化學(xué)致弱，經(jīng)分離、收集后分別配制成卵囊懸浮液制成一級致弱株；3)將一級致弱株與雞飼料混合喂給小雞，宰殺小雞從腸道收集卵囊，將收集到的三種卵囊分別采用重鉻酸鉀溶液保存，經(jīng)孢子化過程后離心分離；4)將步驟3)收集到的卵囊分別離心去除重鉻酸鉀，用重蒸水配成卵囊懸液，將卵囊懸液在流動狀態(tài)下采用物理誘變因素紫外線下照射；5)照射結(jié)束后，卵囊重新加入到重鉻酸鉀中，即得二級致弱株；6)將三種二級雙重致弱株分別進(jìn)行孢子化卵囊計(jì)數(shù)，混勻并稀釋即得一次、二次用雙重致弱的三價球蟲苗混懸液，將三種雙重致弱三價球蟲苗混懸液分別充分混勻后混合制成球蟲三價活疫苗進(jìn)行分裝。
6.根據(jù)權(quán)利要`求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)具體包括下述步驟:將生理鹽水與糞便攪成混懸液；將混懸液經(jīng)濾過后離心棄去上清液，向沉淀中加入飽和鹽水充分混勻，離心所得沉淀物即為所需球蟲卵囊；從病雞的盲腸和小腸刮取內(nèi)容物和粘膜，加入生理鹽水后過濾純化，然后采用生理鹽水沖洗，離心洗滌后收集沉淀，所得沉淀物用胰酶和膽汁在水浴箱內(nèi)消化，消化期間間歇搖動，離心洗滌后將沉淀物攪拌均勻加入到重鉻酸鉀溶液中，在28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，間歇搖動，完成卵囊的孢子化。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)采用權(quán)利要求3所述的烷化劑類化學(xué)誘變劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)的卵囊懸液濃度為40-80萬個卵囊/ml，紫外光源15-20瓦，波長200-300納米的紫外線下照射230-300秒，其中卵囊懸液距離紫外光源25-30cm，照射過程中卵囊懸液處于流動狀態(tài)。
9.權(quán)利要求1所述雞球蟲病三價活疫苗用于雞中誘導(dǎo)雞應(yīng)答反應(yīng)的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于還包括將所述雞球蟲病三價活疫苗與免疫激活劑聯(lián)合使用。
【文檔編號】A61P33/02GK103520714SQ201310347439
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】李丹青, 賈妮 申請人:西安天星生物藥業(yè)股份有限公司