專利名稱：雞新城疫－禽流感二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥品類，它具體涉及用于禽類的新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
新城疫和禽流感是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的兩種重要的病毒傳染病，廣泛地流傳于包括我國在內(nèi)的世界各地，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對禽流感主要應(yīng)用特定血清型毒株研制的滅活疫苗進行預(yù)防和控制，對雞新城疫的防治，雖然有幾種弱毒疫苗可用，但弱毒疫苗不易保存，而且易受母源抗體的干擾，免疫效果不穩(wěn)定，因此目前都是應(yīng)用滅活疫苗進行預(yù)防。在滅活疫苗的研制及生產(chǎn)中主要是采用熱力和化學(xué)方法處理，但都存在一些技術(shù)問題不好克服。近年來發(fā)現(xiàn)可用超高壓技術(shù)做病毒滅活處理，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)在超高壓條件下能夠破壞分子內(nèi)部非共價鍵的結(jié)合，能使病毒喪失原有的感染性但還保持住原病毒的免疫原性，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生與原病毒相同的免疫反應(yīng)，所以超高壓技術(shù)在疫苗制備方面有極大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)中疫苗的制備方法上存在的技術(shù)問題特提出本方案，它采用超高壓的方法對病毒株處理，此法具有經(jīng)濟可靠且免疫效果好的特點。
按如上構(gòu)思，本方案所提供的雞新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法，其特征是它們的工藝過程如下，①將新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在200～400MPA超高靜水壓下保壓分鐘做病毒滅活處理；②將禽流感病毒(AIV)H9株在400～600MPA超高靜水壓下保壓20～40分鐘做病毒滅活處理；③將(NDV)、(AIV)滅毒液按毒價比例1∶1混合，加入占總量2％的吐溫-80和占總量0.01％硫柳汞鈉溶液攪拌成水相；④取比例為0.921∶0.058∶0.02的7號白油、司班-80和硬脂酸鋁配制成油相；⑤將水相混合物緩慢加入到油相中，其水相油相比為1∶2，用攪拌器充分混合乳化，即制成油包水型的滅活ND-AI新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗。
在本方案中，新城疫病毒(NDV)LA SOTA超高壓滅活的壓力的最佳值為300MPA，保壓時間為30分鐘。禽流感病毒(AIV)H9超高壓滅活的壓力的最佳值為500MPA，保壓時間為30分鐘。
采用本方案的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在該疫苗制備成本低，它的免疫效果好，其產(chǎn)生抗體的效果明顯地高于化學(xué)方法中的甲醛滅毒或福爾瑪林滅毒的疫苗，新城疫禽流感二聯(lián)乳劑疫苗對家雞禽類適用的范圍廣，值得推廣使用。


圖1是兩種滅活疫苗免疫抗體曲線。
具體實施例方式本方案是對已有技術(shù)中家雞用的甲醛滅活病毒或福爾瑪林滅活病毒疫苗的改進和提高。它是取新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在300MPA超高壓條件下保壓30分鐘、取將禽流感病毒(AIV)H9株在500MPA超高壓條件下保壓30分鐘作病毒滅活處理，將兩種滅活病毒液體按毒價比例近于1∶1混合，加入占總量2％的吐溫-80和占總量0.01％硫柳汞鈉溶液攪拌成水相；再將水相混合物緩慢加入到比例為0.921∶0.058∶0.02的7號白油、司班-80和硬脂酸鋁配制的油相中，其水相油相比為1∶2，用攪拌器充分混合乳化，即制成油包水型的滅活ND-AI新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗。
在超高壓處理下破壞了病毒顆粒內(nèi)部的非共價鍵的結(jié)合，膜衣殼蛋白亞單位之間解體，破壞了它的傳染性；在超高壓處理時不破壞它內(nèi)部的共價結(jié)合鍵，作為抗原的單個亞單位不被破壞，故其免疫原性不變。本方案的疫苗經(jīng)具體的實驗證明，它具有好保存、使用的家雞產(chǎn)生的抗體效果好的特點，對其它禽類適用的范圍廣，因此值得批量制造推廣使用。
本方案進行了雞新城疫禽流感二聯(lián)超高靜水壓滅活疫苗與甲醛滅活疫苗、常態(tài)對照組比較疫苗的免疫試驗其分組情況是將60只30日齡健康雞分為3組，每組20只。第1組，肌肉注射超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑苗0.5ml/只；第2組，肌肉注射甲醛滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑苗0.5ml/只。免疫抗體的測定于免疫當日(0天)和免設(shè)后7、15、20、60、80、100、120天各組分別隨機抽樣采血，測定血清NDV、AIV的HI抗體效價實驗雞HI抗體測定結(jié)果表1(GMP Log2)

表1中兩個試驗組0天及對照組0～120天測定的AIV HI抗體效價均≤2。
從表中可以看出，試驗期間測得的NDV、AIV HI抗體效價，靜壓滅活疫苗免疫組和甲醛滅活疫苗免疫組的兩種抗體的效價均高于對照組的相應(yīng)值(p＜0.01)，說明試驗組兩種疫苗都有明顯的免疫效果。
從以下的圖1中可看出兩種疫苗用后產(chǎn)生的抗體的情況，靜壓滅活疫苗免疫組的NDV、AIV HI抗體效價明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值，說明靜壓滅活疫苗的免疫效果優(yōu)于甲醛滅活疫苗。
兩種疫苗NDV HI抗體效價比較表2(GMP Log2)

由表2可以看出，在試驗測定的7～120天中，靜壓滅活疫苗免疫組的NDV HI抗體效價在不同測定時期，均明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值(p＜0.01)，平均高出1.14Log2。
表3兩種疫苗AIV HI抗體效價比較(GMP Log2)

由表3可以看出，在試驗測定的7～120天中，靜壓滅活疫苗免疫組的AIV HI抗體效價在不同測定時期，也均明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值(p＜0.01)，平均高出1.10Log2。從表2、3還可以看出，超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑疫苗與甲醛滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑疫苗相比，抗體產(chǎn)生速度相當，但超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑疫苗免疫的試驗雞的抗體蜂值高、維持性好、衰減較慢。
總之，在試驗期間，由測得NDV、AIV HI抗體效價分析表明，靜壓滅活疫苗免疫組和甲醛滅活疫苗免疫組的兩種抗體的效價均高于對照組的相應(yīng)值(p＜0.01)，說明兩種疫苗都有明顯的免疫效果。而且可以看出靜壓滅活疫苗免疫組的NDV、AIV HI抗體效價分別為8.57Log2和8.03Log2，明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值7.43Log2和6.93Log2(p＜0.01)，說明靜壓滅活疫苗的免疫效果優(yōu)于甲醛滅活疫苗。
另外，在試驗雞同種抗體水平比較方面經(jīng)分析證明，在免疫測定期間，靜壓滅活疫苗免疫組的NDV HI抗體效價在不同測定時期，均明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值(p＜0.01)，平均高出1.14Log2。靜壓滅活疫苗免疫組的AIVHI抗體效價在不同測定時期，也均明顯高于甲醛滅活疫苗免疫組的相應(yīng)值(p＜0.01)，平均高出1.10Log2。
討論病毒超高靜水壓滅活條件的確定NDV、AIV兩種病毒對超高靜水壓的耐受性有一定的差異，我們通過試驗確定了NDV、AIV病毒臨界滅活條件，NDV的臨界滅活條件為450Mpa 30min，而AIV的臨界滅活條件為250Mpa 30min。但為了確保安全，NDV、AIV病毒液分別選用500Mpa、300Mpa超高靜水壓下分別保壓滅活30min處理。試驗證明該滅活條件下病毒滅活徹底。
抗原病毒兩種滅活方法的差異，超高靜水壓處理是一種低溫高壓物理處理方法，可導(dǎo)致病毒囊膜上的蛋白亞單位組合形式發(fā)生改變使病毒失去感染性，但不影響其抗原結(jié)構(gòu)，由于病毒囊膜結(jié)構(gòu)的物理性改變，還可使病毒的部分膜內(nèi)抗原得以暴露，使其抗原性增強。而甲醛滅活法，是一種傳統(tǒng)的抗原病毒滅活方法，這種方法是一種化學(xué)滅活方法，其滅活原理是通過醛類的還原作用和醛化作用使病毒蛋白變性，進而使病毒滅活。對制備疫苗的抗原滅活而言，甲醛滅活具有兩大缺陷首先甲醛滅活可降低或影響病毒抗原的抗原性；其次是甲醛是一種潛在的致癌物質(zhì)，對動物健康不利，更重要的是甲醛疫苗用于供食用的動物，將對人類健康產(chǎn)生潛在危害。
結(jié)論用超高靜水壓并保壓一定時間，對NDV、AIV病毒液進行超高壓冷處理，可使兩種病毒完全滅活，用滅活病毒抗原制備的超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑疫苗安全、穩(wěn)定。用滅活病毒抗原制備的超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)乳劑疫苗與甲醛滅活的ND-AI二聯(lián)乳劑疫苗相比，在抗原含量相同的情況下，前者免疫效果更好，前者免疫的試驗雞血清NDV、AIV HI抗體效價較后者分別高出1.14Log2和1.10Log2(p＜0.01)。而且實驗還證明超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)油乳劑疫苗與甲醛滅活ND-AI二聯(lián)乳劑疫苗相比，抗體產(chǎn)生速度相當，但超高靜水壓滅活ND-AI二聯(lián)乳劑疫苗免疫的試驗組雞的抗體維持性好，衰減較慢，充分顯示了二聯(lián)乳劑疫苗的優(yōu)越性。
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法，其特征是它們的工藝過程如下，①將新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在200～400MPA超高靜水壓下保壓分鐘做病毒滅活處理；②將禽流感病毒(AIV)H9株在400～600MPA超高靜水壓下保壓20～40分鐘做病毒滅活處理；③將(NDV)、(AIV)滅毒液按毒價比例1∶1混合，加入占總量2％的吐溫-80和占總量0.01％硫柳汞鈉溶液攪拌成水相；④取比例為0.921∶0.058∶0.02的7號白油、司班-80和硬脂酸鋁配制成油相；⑤將水相混合物緩慢加入到油相中，其水相油相比為1∶2，用攪拌器充分混合乳化，即制成油包水型的滅活ND-AI新城疫-禽流感二聯(lián)乳劑疫苗。
2.按照權(quán)利要求1所述的二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法，其特征是新城疫病毒(NDV)LA SOTA超高壓滅活的壓力的最佳值為300MPA，保壓時間為30分鐘。
3.按照權(quán)利要求1所述的二聯(lián)乳劑疫苗的制備方法，其特征是禽流感病毒(AIV)H9超高壓滅活的壓力的最佳值為500MPA，保壓時間為30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥品類。為克服已有技術(shù)中疫苗中弱毒疫苗不易保存、易受母源抗體的干擾，免疫效果不穩(wěn)定、用甲醛滅活病毒的疫苗存在抗原性差還有致癌的潛在危險等技術(shù)問題特提出本方案。該雞新城疫－禽流感二聯(lián)乳劑疫苗是采用超高壓滅活病毒的新工藝，將新城疫病毒株和禽流感病毒株分別在300MPA和500MPA環(huán)境下保持30分鐘滅活病毒，兩種病毒液以1∶1加入到占總量2％的吐溫－80和占總量0.01％硫柳汞鈉溶液攪拌成水相；將水相混合物緩慢加入到比例為0.921∶0.058∶0.02的7號白油、司班－80和硬脂酸鋁配制的油相中，水相油相比例為1∶2，充分混合乳化制成油包水型的滅活ND－AI新城疫－禽流感二聯(lián)疫苗。經(jīng)實驗和試用證明它具有性能穩(wěn)定、免疫效果好、好保存及經(jīng)濟效益高的特點，值得推廣使用。
文檔編號A61P31/00GK1923279SQ20051001489
公開日2007年3月7日 申請日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者張安國, 賈培起 申請人:天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司