專(zhuān)利名稱(chēng)：治療用抗癌疫苗及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療用抗癌疫苗及其制備，特別涉及腫瘤細(xì)胞系通過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾作為抗癌疫苗的制備方法及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類(lèi)生命的一大疾病，雖然經(jīng)過(guò)多年的研究和努力，通過(guò)積極的腫瘤預(yù)防以及早期診斷、治療技術(shù)的提高，已在一定程度上減少了腫瘤的發(fā)生和危害，但是由于人們生活方式和環(huán)境情況的變化，腫瘤的總體發(fā)病和死亡數(shù)目仍居高不下，在某些地區(qū)已成為第一死因。
腫瘤的治療通常以手術(shù)、化療、放療等手段為主，雖然這些治療手段尤其是在化療藥物開(kāi)發(fā)方面都有或多或少的改進(jìn)和提高，但對(duì)于較為晚期的惡性腫瘤患者往往束手無(wú)策，無(wú)法在延長(zhǎng)生存期和改善生活質(zhì)量方面提供幫助。隨著人們對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的總體機(jī)制的研究，從上個(gè)世紀(jì)八十年代末開(kāi)始，逐漸發(fā)展起了一種新的以通過(guò)生物手段對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的生物治療方式，如細(xì)胞因子治療、基因治療等。腫瘤的生物治療方式在常規(guī)手術(shù)、放化療均無(wú)法進(jìn)行的情況下，仍能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞進(jìn)行一定程度的殺傷，其中通過(guò)調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫力對(duì)抗腫瘤的免疫治療是一種相對(duì)有效的腫瘤治療手段。
腫瘤的免疫治療分為被動(dòng)免疫治療和主動(dòng)免疫治療兩大類(lèi)。在被動(dòng)免疫治療中，針對(duì)某一特定的腫瘤細(xì)胞抗原的抗體在用于患者后，可與表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，患者自身的免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并清除這些被抗體標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。另外，還可以將放射性同位素分子或毒素分子與抗體偶聯(lián)，在抗體結(jié)合到腫瘤細(xì)胞后直接殺傷腫瘤細(xì)胞。目前已用于臨床治療乳腺癌的Herceptin即屬于腫瘤被動(dòng)免疫治療。
腫瘤的主動(dòng)免疫治療是通過(guò)向腫瘤患者體內(nèi)導(dǎo)入特定的抗原、激發(fā)患者自身的免疫反應(yīng)來(lái)清除腫瘤細(xì)胞。在導(dǎo)入特定抗原的同時(shí)，往往還使用增強(qiáng)免疫反應(yīng)的其它成份。這一特異性的免疫反應(yīng)不僅可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性的抗體(體液免疫)，還可以激發(fā)抗原特異性的T細(xì)胞(細(xì)胞免疫)。純化的抗原蛋白、多肽、基于基因表達(dá)的系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物等均可以用于腫瘤的主動(dòng)免疫治療，即治療性腫瘤疫苗。
與化療不同，主動(dòng)免疫治療不直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過(guò)產(chǎn)生一種針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性的、靶向性的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，增加針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞、抗體的種類(lèi)和數(shù)量來(lái)治療腫瘤。另外，治療性腫瘤疫苗還可以激活免疫系統(tǒng)，克服由于腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展引起的免疫抑制。有效的腫瘤疫苗可以延長(zhǎng)患者的無(wú)瘤期和總的生存時(shí)間，而不會(huì)有化療和其它生物治療引起的明顯的副作用。
由于癌癥發(fā)病機(jī)理的復(fù)雜性，以及得到廣譜的腫瘤特異性抗原的困難性，以腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的全細(xì)胞疫苗(whole cell vaccine)的開(kāi)發(fā)得以積極進(jìn)行。這一技術(shù)以完整的體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞為抗原體以注射病人，經(jīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別處理后激活特異性抗腫瘤機(jī)制而產(chǎn)生抗癌作用(Nature Reviews Cancer 4401-411，2004)。另外，利用免疫細(xì)胞尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)在體外培養(yǎng)及應(yīng)用特異抗原及細(xì)胞介素共同刺激而作為抗癌疫苗也是這一技術(shù)的組成部分(NatureReviews Immunology 3，630-641，2003)。
全細(xì)胞治療用疫苗的臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸诿绹?guó)積極進(jìn)行，現(xiàn)有多個(gè)后期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行并面臨突破(Expert Review Anticancer Therapy 5635-644，2005)。FDA有望在近期完成對(duì)此類(lèi)產(chǎn)品的審核批準(zhǔn)，從而開(kāi)創(chuàng)一類(lèi)自抗體類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)后的抗腫瘤新的生物制品(Nature 411380-384，2001；Seminars in Oncology 301-8，2003)。本專(zhuān)利申請(qǐng)采用改進(jìn)技術(shù)開(kāi)發(fā)全細(xì)胞治療用抗癌疫苗。結(jié)合腫瘤細(xì)胞所特有的表型及功能缺陷而制備商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值大的復(fù)合型抗癌疫苗。本專(zhuān)利申請(qǐng)利用腫瘤細(xì)胞系生產(chǎn)可廣泛應(yīng)用的疫苗制品，在治療原則上不同于個(gè)體性疫苗(autologous orpersonalized vaccine)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。在應(yīng)用上可結(jié)合其他常規(guī)臨床治療或獨(dú)立使用，排除了個(gè)體性疫苗必須結(jié)合手術(shù)治療的局限性。因此，采用本專(zhuān)利技術(shù)可大規(guī)模生產(chǎn)可控制質(zhì)檢的產(chǎn)品從而方便臨床治療應(yīng)用。
結(jié)合治療用抗癌疫苗的應(yīng)用宗旨是刺激病人免疫系統(tǒng)以抵抗腫瘤發(fā)展及消滅腫瘤，本專(zhuān)利申請(qǐng)主要技術(shù)要點(diǎn)是采用腫瘤細(xì)胞系作為腫瘤抗原的供體，利用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及分泌的細(xì)胞介素進(jìn)行抗腫瘤免疫的刺激及調(diào)節(jié)。通過(guò)營(yíng)造適合對(duì)腫瘤抗原的表達(dá)及提呈的條件，以提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的力度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗癌疫苗，其主要成分為經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系，所述免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-4，IL-2，IL-12，B7.1(CD80)，B7.2(CD86)，CTLA-4等(Nature Reviews Immunology 3，630-641，2003)，優(yōu)選的是GM-CSF和TGF-β。所述腫瘤細(xì)胞系是體外傳代的各類(lèi)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系，針對(duì)所制備疫苗的抗癌類(lèi)型而選擇。所述免疫調(diào)節(jié)基因均克隆于人類(lèi)染色體DNA，所述腫瘤細(xì)胞系來(lái)源于ATCC中心(美國(guó))或從病人腫瘤克隆得到的原代細(xì)胞。
本發(fā)明的抗癌疫苗，其制備方法是通過(guò)將本發(fā)明經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系與含有一定量的生理上可接受的輔助成分混合制成，所述輔助成分可以是DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護(hù)劑，穩(wěn)定劑等，優(yōu)選的是5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)以及適量的磷酸緩沖液，其制備過(guò)程可以根據(jù)醫(yī)藥制劑學(xué)的常規(guī)生產(chǎn)技術(shù)，制成單位劑量形式的供注射用的抗癌疫苗組合物制劑。
本發(fā)明的抗癌疫苗，所述單位劑量形式的供注射用的抗癌疫苗組合物制劑，其中經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系的量為0.1-500×106細(xì)胞/mL與輔助組分充分混勻而成。
本發(fā)明中，腫瘤細(xì)胞系的選擇是決定疫苗制品應(yīng)用對(duì)象的關(guān)鍵，針對(duì)不同腫瘤病人可采取不同細(xì)胞系。例如肝癌病人可用Hep3B，HepG2細(xì)胞系；宮頸癌病人可用HeLa，ME180細(xì)胞系；肺癌病人可用A549細(xì)胞系；也可選用有開(kāi)發(fā)潛力的臨床歷史清晰的原代分離株。腫瘤細(xì)胞系經(jīng)體外轉(zhuǎn)染(transfection)而獲得其它轉(zhuǎn)基因表達(dá)。經(jīng)篩選及建立穩(wěn)定細(xì)胞系以用于抗癌疫苗的生產(chǎn)。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)及建立穩(wěn)定細(xì)胞系采用逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviral vector)，DNA體外轉(zhuǎn)染等技術(shù)。所用病毒載體構(gòu)建采用Moloney murine leukaemia virus(MMLV)。帶有轉(zhuǎn)基因的非自主性復(fù)制的MMLV病毒在特定條件下生產(chǎn)后，用于腫瘤細(xì)胞系的外源基因?qū)?。?yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞先經(jīng)過(guò)特定抗藥標(biāo)記進(jìn)行初選，再利用抗體免疫聯(lián)聯(lián)染色或其他分子生物學(xué)方法進(jìn)行篩選，選出的陽(yáng)性細(xì)胞株用于制備腫瘤疫苗。本專(zhuān)利申請(qǐng)的核心在于所導(dǎo)入的外源基因組合對(duì)于腫瘤細(xì)胞抗原體在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)的識(shí)別及表達(dá)起關(guān)鍵作用。所選出的腫瘤疫苗細(xì)胞經(jīng)放射滅活后再作臨床應(yīng)用。
本發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)基因是外源基因，本發(fā)明所應(yīng)用的外源基因如下GM-CSF高效的巨嗜細(xì)胞(macrophage)和DC細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。當(dāng)腫瘤細(xì)胞抗原體疫苗接種至體內(nèi)后，所攜帶的特異性腫瘤抗原可經(jīng)cross presentation機(jī)制進(jìn)行抗原呈遞(Annual Review of Immunology，1947-64，2001)。在這一過(guò)程中GM-CSF起極其重要的調(diào)節(jié)及促進(jìn)作用。
TGF-β(transforming growth factor β)這是一類(lèi)由大多數(shù)細(xì)胞所共有的調(diào)節(jié)因子。它主要可以抑制免疫系統(tǒng)功能，尤其抑制腫瘤抗原被細(xì)胞免疫系統(tǒng)所識(shí)別(Nature Medicine 71118-1122，2001)。這一基因在腫瘤疫苗制備過(guò)程中利用siRNA技術(shù)予以抑制(Cancer Research 647596-7603，2004；Gene Therapy125-11，2005)。
TAP-1(transporter associated with antigen processing)這一基因產(chǎn)物在抗原呈遞過(guò)程中起傳導(dǎo)器作用。許多癌癥細(xì)胞中這一基因呈突變?nèi)笔В瑥亩惯@些腫瘤細(xì)胞不為免疫系統(tǒng)所識(shí)別(Nature Reviews Cancer 5263-274，2005)。
HSP90(heat shock protein 90)這是一類(lèi)為大多數(shù)細(xì)胞所共有的基因，在應(yīng)急狀態(tài)下表達(dá)提高。這類(lèi)基因表達(dá)的產(chǎn)物在細(xì)胞中擔(dān)任chaperons，幫助其他蛋白形成正常結(jié)構(gòu)以行使功能，以及輔助蛋白在細(xì)胞內(nèi)的傳遞及處理。因此，這類(lèi)HSP蛋白會(huì)和細(xì)胞內(nèi)的各種蛋白包括腫瘤抗原相結(jié)合，為抗原呈遞所必需(InternationalJournal of Hyperthermi a 21717-722，2005)。
本專(zhuān)利申請(qǐng)以上述外源基因應(yīng)用于抗癌疫苗的制備，采用不同外源基因組合而提高抗癌能力，具有協(xié)同作用。優(yōu)選的組合方式列在本發(fā)明實(shí)施例中。


圖1為Hep3B-GMCSF/TGF siRNA抗癌疫苗細(xì)胞系GM-CSF的表達(dá)和TGF-β抑制的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果。AELISA方法檢測(cè)GM-CSF的表達(dá)。BWestern blot方法檢測(cè)TGF-β的表達(dá)。
圖2為抗癌疫苗細(xì)胞系所表達(dá)的GM-CSF的生物學(xué)功效分析。
圖3為抗癌疫苗細(xì)胞系的抗癌功效比較。三組(n＝10)C57B1/6小鼠在第一天接受不同疫苗(2×106經(jīng)放射處理的細(xì)胞)，并在第10天再次免疫同樣細(xì)胞。在第30天接受B16腫瘤細(xì)胞(2×105)SC攻擊。第50天三組動(dòng)物的腫瘤發(fā)生進(jìn)行比較。
圖4為抗癌疫苗細(xì)胞系的抗癌功效比較。所有動(dòng)物在第一和十天接受不同疫苗(2×106經(jīng)放射處理的細(xì)胞)，在第30天接受B16腫瘤細(xì)胞(2×105)SC攻擊。動(dòng)物存活比例經(jīng)圖示比較。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗此類(lèi)腫瘤細(xì)胞疫苗同時(shí)帶有兩種新的特征，即GM-CSF的高效表達(dá)及利用siRNA技術(shù)抑制了TGF-β的產(chǎn)生。此類(lèi)疫苗提高了在腫瘤全細(xì)胞中單純表達(dá)GM-CSF而產(chǎn)生的抗癌免疫功能，具有協(xié)同作用。
GM-CSF基因經(jīng)DNA克隆技術(shù)插入逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染載體rkat43.2而構(gòu)建rkat43.2GM-CSF。此一載體的構(gòu)建及特征已在過(guò)去有所描述(Roberts，等，1998；J Immunol，161375-384.)。GM-CSF基因經(jīng)由BamHI和ApaI內(nèi)切酶而克隆進(jìn)上述質(zhì)粒載體。根據(jù)文獻(xiàn)中所描述的具體方法，有感染活力的帶有GM-CSF基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過(guò)復(fù)合轉(zhuǎn)染MCVecog/p和6.1CMVamphoenv DNA質(zhì)粒以及上述質(zhì)粒載體到包裝細(xì)胞293T中。DNA轉(zhuǎn)染后約4-5天，細(xì)胞裂解液即可制備成帶有GM-CSF基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其感染活力經(jīng)病毒滴度測(cè)定后而進(jìn)一步用于GM-CSF基因表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系的制備。
表達(dá)GM-CSF穩(wěn)定細(xì)胞系的制備是通過(guò)感染相關(guān)腫瘤細(xì)胞系并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)篩選而進(jìn)行的(Cytotechnology 2831-42，1998)。例如制備抗肝癌疫苗，首先將體外培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞進(jìn)行GM-CSF表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。一周后，將所剩存的細(xì)胞作限定性稀釋并在96孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞克隆培養(yǎng)。所建立的單克隆細(xì)胞株經(jīng)GM-CSF表達(dá)篩選而得到高表達(dá)的Hep3B/GM-CSF細(xì)胞株。
TGF-β的抑制通過(guò)pSilencer質(zhì)粒來(lái)傳遞siRNA技術(shù)而完成。Ambion公司(美國(guó))的pSilencerTM 4.1-CMV neo System被用于制備抑制TGF-β基因表達(dá)的siRNA載體。參照該系統(tǒng)使用說(shuō)明書(shū)，siRNA寡核苷酸插入質(zhì)粒載體中，由修飾過(guò)的CMV啟動(dòng)子進(jìn)行siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的合成表達(dá)。所用于產(chǎn)生TGF-βsiRNA的寡核苷酸序列TGF-β1/oligoA及TGF-β1/oligoB由傳統(tǒng)克隆技術(shù)導(dǎo)入質(zhì)粒載體DNA。TGF-β1/oligoA5’-GATCCCC GACTATCGACATGGAGCTGttcaagagaCAGCTCCATGTCGATAGTCTTTTTGGAAATGF-β1/oligoB5’-TCGATTTCCAAAAAGACTATCGACATGGAGCTGtctcttgaaCAGCTCCATGTCGATAGTCGGG攜帶TGF-β1 siRNA的質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞并抑制TGF-β的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生新的生物學(xué)特征。例如已建立的表達(dá)GM-CSF的Hep3B細(xì)胞，由TGF-β1 siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入。經(jīng)過(guò)2-3星期的G418藥物篩選培養(yǎng)，建立穩(wěn)定細(xì)胞株。其中抑制了TGF-β表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)由RT-PCR技術(shù)進(jìn)行篩選。所獲得的穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)由Cell Factory或生物反應(yīng)器(Bio-reactor)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而大量生產(chǎn)，經(jīng)放射滅活后用于臨床試驗(yàn)治療。
利用ELISA和Western Blot方法，可以有效地分析GM-CSF和TGF-β的表達(dá)情況。圖1顯示肝癌Hep3B抗癌疫苗細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)分析，與原始細(xì)胞系的比較表明，新構(gòu)建的疫苗細(xì)胞系表達(dá)GM-CSF蛋白，同時(shí)TGF-β的表達(dá)被明顯地抑制了。肝癌Hep3B抗癌疫苗細(xì)胞系所表達(dá)的GM-CSF被實(shí)驗(yàn)證實(shí)為有生物學(xué)活性。圖2為T(mén)F-1細(xì)胞的特異擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果。Hep3B抗癌疫苗細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)液和各種不同的對(duì)照與TF-1細(xì)胞共同培養(yǎng)，只有疫苗株的培養(yǎng)液表現(xiàn)出與GM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照相似的特異擴(kuò)增結(jié)果，證實(shí)疫苗株表達(dá)具有生物學(xué)活性的GM-CSF。
以上試驗(yàn)表明，所制備的Hep3B-GMCSF/TGF siRNA抗癌疫苗細(xì)胞系不僅表達(dá)較高的GM-CSF，并且抑制了細(xì)胞內(nèi)TGF-β的表達(dá)，達(dá)到了疫苗設(shè)計(jì)要求。為進(jìn)一步證明疫苗抗癌功效，相關(guān)體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)也同時(shí)進(jìn)行。由于人類(lèi)腫瘤模型難于在免疫功能健全的動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行研究，小鼠GM-CSF和TGF-β1基因被用于構(gòu)建不同的細(xì)胞株，從而建立了試驗(yàn)動(dòng)物模型驗(yàn)證GM-CSF表達(dá)和TGF-β1 siRNA抑制的免疫學(xué)功效。在圖3的試驗(yàn)中，有GM-CSF表達(dá)的細(xì)胞和有GM-CSF表達(dá)以及TGF-β1 siRNA抑制的細(xì)胞同時(shí)顯示抗癌免疫疫苗功效，而后者由于TGF-β1 siRNA的抑制更顯示了比只有GM-CSF表達(dá)更好的免疫學(xué)功效。
根據(jù)以上所述疫苗構(gòu)建方法，表達(dá)GM-CSF及TGF-β1 siRNA的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞系已被克隆，包括肺癌A549細(xì)胞，腸癌LoVo細(xì)胞，胃癌SNU5細(xì)胞，宮頸癌HeLa細(xì)胞，等等。
實(shí)施例2腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗此類(lèi)腫瘤細(xì)胞疫苗除以上特征外，同時(shí)增加了HSP的表達(dá)。表達(dá)HSP是通過(guò)在GM-CSF基因后加入Foot Mouth Disease Virus(FMDV)2A序列及后續(xù)的HSP90基因。FMDV 2A序列為第二個(gè)基因HSP90的表達(dá)提供必需的信號(hào)(Donnelly等，2001，Journal of General Virology，821027-1041.)。由此構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染載體rkat43.2GM-CSF/HSP90被用于制備有感染活力的帶有GM-CSF和HSP90基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而進(jìn)一步用于制備表達(dá)GM-CSF和HSP90基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。
新的表達(dá)GM-CSF和HSP90基因的穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染pSilencer質(zhì)粒載體而導(dǎo)入TGF-β1 siRNA，從而建立抑制TGF-β表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。具體制備過(guò)程類(lèi)同于例一所述的Hep3B/GM-CSF/TGF-β1 siRNA細(xì)胞的制備。
此類(lèi)疫苗可進(jìn)一步提高腫瘤抗原的呈遞及免疫系統(tǒng)識(shí)別。圖4為幾種不同基因組合用于小鼠腫瘤模型B16中的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果。在此試驗(yàn)中，B16細(xì)胞經(jīng)體外轉(zhuǎn)染而構(gòu)建B16-GMCSF/TGF-β-和B16-GMCSF/TGF-β-/HSP細(xì)胞系，三種不同細(xì)胞系用于B16腫瘤的治療。首先，在試驗(yàn)第一天，帶有約100mm3大的B16腫瘤的小鼠分為三組(n＝8)，每組接種一種已放射滅活的抗癌疫苗細(xì)胞系。在第60天，小鼠再次接受B16細(xì)胞注射。三組動(dòng)物的存活紀(jì)錄經(jīng)圖顯示比較，B16-GMCSF/TGF-β-/HSP細(xì)胞系所制備的疫苗表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗癌功效。
根據(jù)以上所述疫苗構(gòu)建方法，表達(dá)GM-CSF，HSP及TGF-β1 siRNA的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞系已被克隆，包括肺癌A549細(xì)胞，腸癌LoVo細(xì)胞，胃癌SNU5細(xì)胞，宮頸癌HeLa細(xì)胞，等等。
實(shí)施例3腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF，HSP90及TAP-1并抑制TGF-β的疫苗此類(lèi)腫瘤細(xì)胞疫苗細(xì)胞系具有多種新特征以提高腫瘤抗原的呈遞，可成為高效復(fù)合型抗癌疫苗，具有明顯的協(xié)同作用。
利用DC細(xì)胞的cross presentation機(jī)制來(lái)針對(duì)性地進(jìn)行腫瘤抗原呈遞目前已展示出一定臨床抗癌功效。采用腫瘤細(xì)胞來(lái)制備全細(xì)胞抗癌疫苗將可能成為新一代的抗癌生物制品。本專(zhuān)利申請(qǐng)科學(xué)地應(yīng)用抗原呈遞中的免疫機(jī)制以提高腫瘤抗原的呈遞和識(shí)別，所開(kāi)發(fā)的全細(xì)胞抗癌疫苗可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，疫苗的腫瘤抗原呈遞及免疫系統(tǒng)識(shí)別可望大大提高，從而增強(qiáng)疫苗的抗癌能力。
實(shí)施例4本發(fā)明抗癌疫苗的臨床應(yīng)用在臨床應(yīng)用上，針對(duì)病人的癌癥類(lèi)型，相關(guān)腫瘤細(xì)胞系(例如肺癌或肝癌細(xì)胞系)用于表達(dá)GM-CSF(及或HSP)以及抑制TGF-β而構(gòu)建此類(lèi)抗癌疫苗。所獲得的穩(wěn)定疫苗細(xì)胞系經(jīng)由Cell Factory或生物反應(yīng)器(Bio-reactor)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而大量生產(chǎn)，所獲細(xì)胞經(jīng)洗滌分離并制成懸浮液(0.1～500×106細(xì)胞/mL/支)，經(jīng)放射處理滅活后保存于液氮或低溫冰箱。在用于臨床試驗(yàn)治療前，冷凍保存的抗癌疫苗細(xì)胞制劑化凍后給病人做注射(例如皮下注射)。一般情況下，每個(gè)病人需要一至六次注射為一個(gè)療程(每周或每月一次，每次一支)，歷時(shí)六至24個(gè)星期。
實(shí)施例5腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗的制備實(shí)施例1方法制備的疫苗0.1×106細(xì)胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理?xiàng)l件緩沖液，混合均勻，經(jīng)放射滅活處理，冷凍。
實(shí)施例6腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及抑制TGF-β的疫苗的制備實(shí)施例1方法制備的疫苗500×106細(xì)胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理?xiàng)l件緩沖液，混合均勻，經(jīng)放射滅活處理，冷凍。
實(shí)施例7腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗的制備實(shí)施例2方法制備的疫苗100×106細(xì)胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理?xiàng)l件緩沖液，混合均勻，經(jīng)放射滅活處理，冷凍。
實(shí)施例8腫瘤細(xì)胞表達(dá)GM-CSF及HSP90并抑制TGF-β的疫苗的制備實(shí)施例2方法制備的疫苗10×106細(xì)胞/mL，加入5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白(HSA)的磷酸生理?xiàng)l件緩沖液，混合均勻，經(jīng)放射滅活處理，冷凍。
權(quán)利要求
1.一種抗癌疫苗，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因的內(nèi)源性表達(dá)，輔助機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)疫苗所攜帶的腫瘤細(xì)胞抗原的識(shí)別，激發(fā)機(jī)體抗癌免疫機(jī)能，其特征在于，疫苗成分為經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞系攜有外源性的免疫調(diào)節(jié)基因，所述免疫基因的調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)基因表達(dá)和抑制基因表達(dá)。
3.權(quán)利要求1的疫苗，免疫調(diào)節(jié)基因與腫瘤細(xì)胞系在體外重組而賦予腫瘤細(xì)胞系以新的基因表達(dá)特征，所述腫瘤細(xì)胞系是體外傳代的各類(lèi)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系，針對(duì)所制備疫苗的抗癌類(lèi)型而選擇，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)基因選自GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-2，IL-4，IL-12，B7.1，B7.2，CTLA4等。
4.權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于，含有有效量的經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系和生理上可接受的輔助成分，所述輔助成分選自DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護(hù)劑，穩(wěn)定劑等。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其特征在于，所述有效量的經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系的量是0.1-500×106細(xì)胞/mL。
6.權(quán)利要求4的疫苗，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞系經(jīng)放射滅活處理，所述輔助成分選自5％DMSO，8％Pentastarch，2％人血清白蛋白的磷酸緩沖液。
7.權(quán)利要求1的疫苗在制備抗癌疫苗藥物制劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其特征在于，所述癌為肝癌，肺癌，腸癌，胃癌，鼻咽癌，宮頸癌，乳癌，頭頸癌，胰腺癌，白血病等。
9.權(quán)利要求1的疫苗的制備方法，其特征在于，免疫調(diào)節(jié)基因與腫瘤細(xì)胞系在體外重組進(jìn)行構(gòu)建，經(jīng)過(guò)以下步驟a經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系的制備，其步驟為以病毒或質(zhì)粒DNA載體導(dǎo)入外源基因，續(xù)而進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系篩選而得到。b經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系經(jīng)放射滅活處理和生理上可接受的輔助成分混合制成，所述輔助成分選自DMSO，Pentastarch，血清白蛋白，緩沖溶液，水，疫苗佐劑，保護(hù)劑，穩(wěn)定劑等。
10.權(quán)利要求9的制備方法，其特征在于，經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系量是0.1-500×106細(xì)胞/mL，調(diào)節(jié)基因選自GM-CSF，TGF-β，HSP90，TAP-1，IL-2，IL-4，IL-12，B7.1，B7.2，CTLA4等，所述輔助成分選自5％DMSO，8％Pentastarch，，2％人血清白蛋白的磷酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療用抗癌疫苗及其制備，特別涉及腫瘤細(xì)胞系通過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾作為抗癌疫苗的制備方法及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，疫苗的主要成分為經(jīng)過(guò)免疫調(diào)節(jié)基因修飾的腫瘤細(xì)胞系，所述免疫調(diào)節(jié)基因是GM－CSF，TGF－β，HSP90，TAP－1，IL－4，IL－2，IL－12，B7.1(CD80)，B7.2(CD86)等。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1824328SQ200510135330
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者俞德超, 姜敏 申請(qǐng)人:俞德超, 姜敏