疫苗佐劑及其在制備新城疫滅活疫苗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種應(yīng)用佐劑制備新城疫滅活疫苗的方法，還涉及所述方法制備得到 的新城疫滅活疫苗，屬于新城疫滅活疫苗的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 佐劑（adjuvant)，又稱免疫佐劑，其功能是與抗原混合后注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特 異性改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用。凡是可以增強(qiáng)抗原特 異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均可稱為佐劑。佐劑的種類非常多，常規(guī)佐劑包括鋁鹽類、油乳劑、蜂 膠佐劑。最常見的佐劑為油類佐劑，例如弗氏佐劑、白油佐劑、MF_59、SAF等，這類佐劑通常 具有良好的免疫增強(qiáng)作用。
[0003] 目前，新城疫滅活疫苗免疫效果不理想，亟待開發(fā)一種可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì) 胞免疫和體液免疫的新城疫滅活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用佐劑制備新城疫滅活疫苗的方法，該 方法制備的新城疫滅活疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫，延長(zhǎng)免疫保護(hù) 期。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明公開了一種制備新城疫滅活疫苗的方法，包括以下步驟：（1)增殖新城疫 病毒，收獲病毒液，滅活；（2)向滅活后的病毒液中加入左旋咪唑母液，混勻，得到水相溶 液；（3)向水相溶液中加入表面活性劑，混勻；(4)加入白油，乳化，即得。
[0007] 其中，步驟（1)采用SPF雞胚增殖新城疫病毒；優(yōu)選的，所述新城疫病毒為新城疫 病毒La Sota株；
[0008] 步驟（2)所述左旋咪唑母液是左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射 液；優(yōu)選的，所述左旋咪唑母液用〇. 22 μ m濾器過濾除菌；
[0009] 步驟（2)每毫升水相溶液中含有左旋咪挫2mg、5mg或IOmg ;優(yōu)選為IOmg ;并調(diào)整 水相溶液的pH值達(dá)中性。
[0010] 例如，步驟（2)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml與96ml滅活病毒液混合均勻，即 為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)?mg的水相溶液；取50mg/ml的左旋咪唑母液IOml與90ml 滅活病毒液混合均勻，即為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)?mg的水相溶液；取50mg/ml的左 旋咪唑母液20ml與80ml滅活病毒液混合均勻，即為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)镮Omg的 水相溶液。
[0011] 步驟（3)所述表面活性劑的加入量為滅活后的病毒液體積的5% ;優(yōu)選的，所述表 面活性劑為吐溫-80。
[0012] 步驟⑷按體積比計(jì)，經(jīng)步驟⑶處理的水相溶液與白油的比例為I :1. 5。
[0013] 本發(fā)明對(duì)制備新城疫滅活疫苗的佐劑進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)，分別以左旋咪唑與弗氏佐 劑、左旋咪唑與皂苷、左旋咪唑與白油、白油與卡波姆（樹脂）、白油與黃芪多糖為佐劑制備 新城疫滅活疫苗。結(jié)果表明，佐劑為左旋咪唑與白油制備的新城疫滅活疫苗的免疫效果最 好，HI抗體水平最高，免疫后28天HI抗體平均水平達(dá)8. 91og2。因此，本發(fā)明選擇白油與 左旋咪唑?yàn)橹苽錅缁钜呙绲淖魟⑦M(jìn)一步對(duì)左旋咪唑用量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，含2-10mg 左旋咪唑的疫苗免疫組HI抗體平均水平高于添加其他量左旋咪唑的疫苗免疫組；而含 IOmg左旋咪唑的疫苗免疫組HI抗體平均水平顯著高于其他組。
[0014] 本發(fā)明還公開了所述方法制備得到的新城疫滅活疫苗。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明， 制備得到的新城疫滅活疫苗免疫雞只后無局部或全身反應(yīng)，安全性好；免疫后可刺激機(jī)體 產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫；含IOmg左旋咪唑的疫苗免疫組免疫后10周脾淋巴細(xì)胞 中IFN-Y含量為8076. 92pg/mL，具有更好的保護(hù)作用，延長(zhǎng)疫苗免疫保護(hù)期。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0016] (1)本發(fā)明制備的新城疫滅活疫苗，免疫雞只后無局部或全身反應(yīng)，安全性好；
[0017] (2)本發(fā)明制備的新城疫滅活疫苗免疫雞只后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫 和體液免疫，具有更好的保護(hù)作用，延長(zhǎng)疫苗免疫保護(hù)期。
[0018] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)宙義
[0019] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0020] 可互換使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過一種上述組分。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"佐劑"意指包括一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織儲(chǔ)存，并且還充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣 系統(tǒng)激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨(dú)抗原的初次疫苗接種將無法引發(fā)體液或細(xì) 胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 1、實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物
[0024] 新城疫病毒La Sota株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，HA效價(jià)為28，-20°C保存?zhèn)溆?；鹽酸 左旋咪唑注射液，白油佐劑購(gòu)自美國(guó)索諾邦公司；30日齡SPF雞，整個(gè)飼養(yǎng)過程均在公司生 產(chǎn)的隔離器中進(jìn)行，飼料經(jīng)高壓滅菌，水為酸化水。采血用雞為成年SPF公雞。
[0025] 實(shí)施例1水相溶液配制
[0026] 1、左旋咪唑母液的制備
[0027] 用市售的左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母 液；將其用0.22 μ m濾器（購(gòu)自賽多利斯）過濾除菌后備用。
[0028] 2、配制水相溶液
[0029] 取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml與96ml雞新城疫滅活病毒液混合均勻，并調(diào)整pH 值達(dá)中性，即為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)?mg的水相溶液。
[0030] 實(shí)施例2水相溶液配制
[0031] 1、左旋咪唑母液的制備
[0032] 用市售的左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母 液；將其用0.22 μ m濾器（購(gòu)自賽多利斯）過濾除菌后備用。
[0033] 2、配制水相溶液
[0034] 取50mg/ml的左旋咪唑母液IOml與90ml雞新城疫滅活病毒液混合均勻，并調(diào)整 pH值達(dá)中性，即為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)?mg的水相溶液。
[0035] 實(shí)施例3水相溶液配制
[0036] 1、左旋咪唑母液的制備
[0037] 用市售的左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母 液；將其用0.22 μ m濾器（購(gòu)自賽多利斯）過濾除菌后備用。
[0038] 2、配制水相溶液
[0039] 取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml與80ml雞新城疫滅活病毒液混合均勻，并調(diào)整 pH值達(dá)中性，即為每毫升溶液中含有左旋咪唑?yàn)镮Omg的水相溶液。
[0040] 實(shí)施例4新城疫滅活疫苗的制備
[0041] 將新城疫病毒La Sota株用滅菌生理鹽水作10-5倍稀釋，各接種9~10日齡SPF 胚10枚，0.1 mL/枚，接種后密封針孔，置于37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋，每天照胚2~3次。將 在48h前死亡的雞胚棄去，48h后，每4~8h照胚1次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至120h，不 論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2~8°C冷卻。
[0042] 將冷卻4~24h的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)去除擬定部卵 殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛肩囊膜及羊膜，收集48~120h死亡和120h后的活胚的尿囊液。
[0043] 將滅活并檢驗(yàn)合格的雞胚尿囊液混于同一容器內(nèi)，向滅活病毒液中加入左旋咪唑 母液制備水相溶液，并調(diào)整pH值達(dá)中性，每毫升水相溶液中含有左