能與人B淋巴細(xì)胞上的mIgE結(jié)合的抗CεmX抗體的制作方法
【專利說(shuō)明】能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE結(jié)合的抗C ε mX抗體
[0001] 發(fā)明背景
[0002] IgE在介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)中起到?jīng)Q定性作用，I型超敏反應(yīng)負(fù)責(zé)導(dǎo)致的過(guò)敏性疾 病，包括過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎等。過(guò)敏性反應(yīng)是免疫系統(tǒng)對(duì)無(wú)害環(huán)境物質(zhì) 的應(yīng)答，所述環(huán)境物質(zhì)例如塵螨、樹(shù)木和草的花粉、某些食品和藥物以及蜜蜂和火蟻叮咬。 在這些反應(yīng)中，過(guò)敏原與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面IgE的結(jié)合引起IgE交聯(lián)和相關(guān) IgE. Fc受體的聚集，所述IgE. Fc受體為I型IgE. Fc受體或Fc ε RI。該受體聚集隨后激活 信號(hào)途徑，導(dǎo)致顆粒的胞吐和藥理介質(zhì)的釋放，所述藥理介質(zhì)例如組胺、白三烯、類胰蛋白 酶、細(xì)胞因子和趨化因子。那些介質(zhì)從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的釋放導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的各 種病理表現(xiàn)。
[0003] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于治療IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病的抗IgE的抗體，該抗體與血液和 組織液中的游離的IgE和B細(xì)胞上的mlgE結(jié)合，但是不與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的 Fc ε RI所結(jié)合的IgE結(jié)合。利用人源化抗IgE抗體即奧馬珠單抗（商品名Xolair)的治療 在多種過(guò)敏性病癥中表現(xiàn)出弱化I型超敏性的多重藥理作用?？贵w與IgE在Fc的CH3結(jié) 構(gòu)域中的位點(diǎn)高親和力結(jié)合，該位點(diǎn)與Fc ε RI的結(jié)合位點(diǎn)重疊。因此，該療法基于抗體與 游離IgE和B淋巴母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞上的mlgE的結(jié)合，這導(dǎo)致血液和組織液中總的游離 IgE水平下降。
[0004] 抗IgE與游離的IgE的結(jié)合進(jìn)一步阻止IgE與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面上的 Fc ε RI的結(jié)合。由于未被IgE占據(jù)的Fc ε RI不穩(wěn)定，且隨后內(nèi)化并降解，以抗IgE結(jié)合耗 盡游離的IgE也逐漸下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的Fc ε RI。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗體療法其它 作用的證據(jù)，包括中和細(xì)胞因子活性、弱化總炎性活性和可能通過(guò)IgE-抗-IgE免疫復(fù)合物 的累積清除過(guò)敏原。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人之一（T. W. Chang)發(fā)現(xiàn)，IgE除了與奧馬珠單抗結(jié)合的位于CH3上 的抗原位點(diǎn)之外，被稱為C ε mX的另一個(gè)抗原位點(diǎn)存在于人mlgE上，用于祀向表達(dá)mlgE的 B淋巴細(xì)胞。CemX是位于人膜結(jié)合ε鏈（me)的CH4結(jié)構(gòu)域和C末端膜錨定片段之間的 52個(gè)氨基酸的片段。在大多數(shù)所研宄的人個(gè)體中，已經(jīng)證明，沒(méi)有CemX的me (Hies)占有 極小的比例，而具有C ε mX的m ε鏈（m ε )優(yōu)勢(shì)表達(dá)。游離、分泌型IgE的ε鏈的mRNA和 mlgE的m ε 3和m ε 的mRNA都來(lái)源于ε RNA轉(zhuǎn)錄本的可選剪接。C ε mX的氨基酸和核苷酸 序列在整個(gè)蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中是唯一的。因此，CemX為靶向mlgE和表達(dá)mlgE的B細(xì) 胞提供了特有的抗原位點(diǎn)。
[0006] Chang的研宄組以前報(bào)道了所開(kāi)發(fā)的數(shù)種C ε mX特異性小鼠單克隆抗體，包括a20 在內(nèi)，這些抗體能與含有C ε mX片段的重組蛋白和SK0-007細(xì)胞系的細(xì)胞結(jié)合，并且能與 CHO細(xì)胞系的細(xì)胞結(jié)合，所述SK0-007細(xì)胞系是表達(dá)人mlgE的人骨髓瘤來(lái)源的細(xì)胞系，所述 CHO細(xì)胞系用對(duì)應(yīng)于m h的CH2結(jié)構(gòu)域至細(xì)胞質(zhì)末端的片段（m ε ;CM:細(xì)胞質(zhì)）的基 因轉(zhuǎn)染。單克隆抗體a20及其所有早期開(kāi)發(fā)的抗體均被發(fā)現(xiàn)與位于52a. a. C ε mX結(jié)構(gòu)域C 末端的 8-a. a.肽區(qū)域、RADWPGPP(SEQ ID N0:1)、殘基 #45-52 結(jié)合。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明涉及對(duì)人mlgE的C ε mx結(jié)構(gòu)域具有特異性并能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE 結(jié)合的抗體的開(kāi)發(fā)和鑒定。本發(fā)明還涉及這些抗體在治療由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病和其他 疾病中的應(yīng)用。
[0009] 在研宄由Chang的研宄組開(kāi)發(fā)的抗C ε mX單克隆抗體a20的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)a20與 m ε 基因所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的結(jié)合較好，所述細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞系或NSO細(xì)胞系，不 表達(dá)Iga (CD79a)、Ig0 (CD79b)、CD21、CD19、CD81和其他與B細(xì)胞受體（BCR)相關(guān)的蛋白。 然而，發(fā)現(xiàn)a20與m ε 基因所轉(zhuǎn)染的表達(dá)Ig a、Ig β和其他BCR相關(guān)蛋白的細(xì)胞系結(jié) 合不良，例如Ramos細(xì)胞系。我們?cè)O(shè)想，a20所識(shí)別的位于C ε mX上的抗原表位可能被某些 BCR相關(guān)蛋白封閉。因此，a20單克隆抗體及其嵌合或人源化版本不適于在體內(nèi)用于人類患 者中，用于靶向表達(dá)mlgE的B淋巴母細(xì)胞和記憶細(xì)胞的目的。
[0010] 如果肽表位RADWPGPP(SEQ ID N0:1)是用于誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的唯一表位，那么利用 以含人C ε mX的蛋白所免疫的小鼠由雜交瘤方法產(chǎn)生的單克隆抗體，對(duì)該肽區(qū)域都將是特 異性的。然而，如果該表位是優(yōu)勢(shì)表位，但不是唯一的免疫原性表位，那么仍可開(kāi)發(fā)對(duì)C ε mX 上其他抗原表位具有特異性的單克隆抗體?？赡茉贑 ε mX上存在不能由BCR相關(guān)蛋白封閉 的表位，用于抗體結(jié)合。如果是這樣，還可以開(kāi)發(fā)與B細(xì)胞上的IgE結(jié)合并且可用于靶向這 些B細(xì)胞的抗體。
[0011] 在以下的實(shí)施例中，我們成功地表明，盡管RADWPGPP(SEQ ID N0:1)是優(yōu)勢(shì)表位， 但是其不是C ε mX上唯一的免疫原性和抗原表位。此外，我們發(fā)現(xiàn)了單克隆抗體、4B12和 26H2,其與不在RADWPGPP(SEQ ID N0:1)區(qū)域內(nèi)的抗原表位上的CemX結(jié)合。那些單克隆 抗體在結(jié)合C ε mX中不與a20抗體競(jìng)爭(zhēng)。它們與B細(xì)胞上mlgE的結(jié)合比a20更牢固，并且 在導(dǎo)致表達(dá)mlgE的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞溶解和凋亡中比a20更有效。
[0012] 實(shí)施例表明，諸如4B12和26H2的單克隆抗體能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE結(jié)合， 并且適合用于靶向表達(dá)mlgE的B淋巴母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞，用于下調(diào)IgE合成。嵌合或人 源化形式的抗體適于用在受IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病所影響的患者中，所述過(guò)敏性疾病例如 過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎。由于已證實(shí)抗IgE對(duì)IgE的中和可有效治療寒冷 誘發(fā)的蕁麻瘆、慢性蕁麻瘆、膽堿能性蕁麻瘆、慢性鼻竇炎、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥、皮膚肥 大細(xì)胞增生癥、過(guò)敏性支氣管肺曲霉病、復(fù)發(fā)性先天血管性水腫和間質(zhì)性膀胱炎或嗜酸性 粒細(xì)胞相關(guān)的胃腸病癥，因此也可以利用諸如4B12和26H2的抗體治療這些各種疾病。
[0013] 實(shí)施例還提出4B12和26H2所識(shí)別的肽在誘導(dǎo)針對(duì)C ε mX和因而針對(duì)表達(dá)mlgE 的B細(xì)胞的免疫應(yīng)答中的潛在應(yīng)用。具有相似的抗原特性即具有與抗C ε mX抗體的結(jié)合活 性的肽及其類似物，例如4B12和26H2,可以單獨(dú)使用或與分子構(gòu)建體聯(lián)合使用，所述分子 構(gòu)建體還含有能誘導(dǎo)T細(xì)胞輔助的部分。這類構(gòu)建體能誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)mlgE的B細(xì)胞的活 性免疫，并因此實(shí)現(xiàn)下調(diào)總IgE合成的作用。 實(shí)施例
[0014] 實(shí)施例1 :與RADWPGPP(SEQ ID NO: 1)之外的抗原位點(diǎn)結(jié)合的新的抗C ε mX單克 隆抗體。
[0015] 為了誘導(dǎo)抗C ε mX免疫應(yīng)答，用50 μ g溶解的n- ^烷基-β -d_麥芽吡喃糖苷 (UDM ;Anatrace)mlgE. Fclj重組蛋白按照廠商的意見(jiàn)以兩周的間隔皮下免疫BALB/c小鼠兩 次，所述mlgE. Fclj重組蛋白在TiterMax Gold佐劑（Sigma-Aldrich)中乳化。我們避免超 免疫方案，以便小鼠不會(huì)僅產(chǎn)生針對(duì)優(yōu)勢(shì)RADWPGPP表位的抗體。用0.1 mgUDM溶解的mlgE. FcL重組蛋白在沒(méi)有佐劑的情況下腹膜內(nèi)進(jìn)行最后一次加強(qiáng)。融合前一天，將NSO細(xì)胞以 5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重新接種于新鮮的DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen)中，所述DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)充有1〇%熱滅活的胎牛血清$83;11^丨壯呢611)和1%青霉素-鏈霉素混合物 (IOOXPen-Strep溶液；Invitrogen)。最后一次加強(qiáng)3天后，收集來(lái)自2只免疫小鼠的脾細(xì) 胞，并用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次。收集5 X IO7個(gè)NSO細(xì)胞，并用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗 滌兩次。洗滌后，在用移液管吸頭輕輕地不斷攪動(dòng)細(xì)胞的同時(shí)，通過(guò)在1分鐘內(nèi)添加 Iml預(yù) 熱的50%聚乙烯丙三醇1500(PEG 1500, Roche Applied Science)使脾細(xì)胞與NSO細(xì)胞融 合，再次攪動(dòng)細(xì)胞持續(xù)1分鐘，在2分鐘內(nèi)添加2ml預(yù)熱的無(wú)血清DMEM，并最后在2分鐘內(nèi) 添加8ml無(wú)血清DMEM。以200 X g離心10分鐘之后，用600ml HAT培養(yǎng)基[DMEM培養(yǎng)基補(bǔ) 充有2 %次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷混合物（50 X HAT溶液；Invitrogen)、10 % BM-Condimed Hl (Roche Applied Science)、10 %熱滅活FBS和1 %青霉素-鏈霉素混合物]重懸浮融合 的細(xì)胞，并以200 μ 1/孔分布在30個(gè)96孔培養(yǎng)板中。第3天時(shí)，向每孔添加100 μ I HAT培 養(yǎng)基。在第7天和第10天時(shí)，通過(guò)吸去每孔一半體積的培養(yǎng)基，并用HAT培養(yǎng)基替換來(lái)更 新培養(yǎng)基。在第14天時(shí)，利用雜交瘤上清液通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)來(lái)篩查與UDM 溶解的mlgE. ?(^或mlgE. Fe s蛋白結(jié)合的抗C ε mX mAb。
[0016] 為了利用ELISA篩查分泌抗C ε mX mAb的雜交瘤，用純化UDM溶解的mlgE. Fq 或mlgE. Fcs蛋白在0· IM NaCO 3(pH 9.6)中以50ng/孔于4°C下過(guò)夜包被96孔MaxiSorp 板（Nunc)。將包被的孔用PB S中1 % BSA以200 μ 1/孔室溫封閉1小時(shí)。用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌三次，隨后將100 μ 1雜交瘤上清液添加至孔中。于 室溫孵育2小時(shí)。抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌 六次。將板與HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠 IgG抗體（Chemicon)的1:10, 000稀釋液一起孵育1小 時(shí)（100 μ 1/孔）。然后抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板 洗滌六次。最后，通過(guò)50μ1/孔的四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底物溶液（SureBlueTM，KPL)使孔 顯影，并通過(guò)以50 μ 1/孔添加 IN HCl來(lái)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD45tl處的吸光度。如 通過(guò)ELISA所測(cè)定的，從兩次融合所篩查的MOOO個(gè)雜交瘤克隆中，17個(gè)克隆表現(xiàn)出對(duì)U