DM 溶解的mlgE. FcJU不是mlgE. Fe s的特異性。
[0017] 為了研宄抗C ε mx mAb對C ε mx的特異性,然后檢測多種C ε mx特異性克隆與3種 合成肽的反應(yīng)性,這3種合成肽代表C ε mX由位于殘基#18處的C殘基和位于殘基#39-41 處的CHC片段而分開的3個連續(xù)片段。具體而言,Pl肽含有me的CH4的最后4個氨基 酸殘基和 C ε mX 的前 17 個氨基酸殘基(#1-17),即 GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID N0:2); P2 肽含有 CemX 的 20 個氨基酸殘基 #19-38,即 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID N0:3); P3肽含有C ε mX的末端11個氨基酸殘基(#42-52),g卩GAGRADWPGPP(SEQ ID N0:4)和連 續(xù)migis區(qū)域的前4個氨基酸殘基,即me鏈的膜錨定肽的N末端細(xì)胞外區(qū)域。所有的 肽均在中央研宄院基因組研宄中心(臺灣臺北)(Genomics Research Cneter, Academia Sinica(Taipei, Taiwan))合成。用濃度為10mg/ml的PBS使肽復(fù)水。用所有肽在0· IM NaCO3 (pH 9. 6)中以500ng/孔在4°C下過夜包被96孔MaxiSorp板。將包被的孔用PBS中 1% BSA以200 μ 1/孔室溫封閉1小時。用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板 洗滌三次,隨后將100 μ I 1 μ g/ml的抗C ε mX mAb添加至孔中。于室溫孵育2小時。抽吸 所有的孔,并用含0. 05 % Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次。將板與HRP偶聯(lián) 的山羊抗鼠 IgG抗體(Chemicon)的1:10, 000稀釋液一起孵育1小時(100 μ 1/孔)。用 含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次之后,將50 μ 1/孔的TMB底物溶液 添加入孔中。通過以50 μ 1/孔添加 IN HCl來終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測(?45。處的吸光 度。在我們的實驗中所制備的許多C ε mX特異性單克隆抗體中,只有4B12和26H2不與含 RADWPGPP的P3肽結(jié)合。4B12與Pl肽反應(yīng),26H2與P2肽反應(yīng)。所有其他的C ε mX特異性 單克隆抗體均與P3反應(yīng)(圖1)。因此,毫無疑問,RADWPGPP(SEQ ID N0:1)是優(yōu)勢免疫原 性表位。但是它不是唯一的免疫原性表位。
[0018] 實施例2 :4B12和26H2與表達(dá)mlgE的B細(xì)胞上的mlgE結(jié)合
[0019] 我們進(jìn)一步檢測多種emX特異性單克隆抗體與用編碼me L(CH2-CM)S^ m £ S(CH2-CM) 的重組DNA所轉(zhuǎn)染的CHO和Ramos細(xì)胞系的結(jié)合能力。兩個轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系分別產(chǎn)生 mlgE. FcL·或mIgE. Fcs,mIgE. FcL·或mIgE. Fcs兩者都不能與諸如Iga和Ig0的輔助受體 (coreceptor)形成完整的B細(xì)胞受體,因為所述CHO細(xì)胞不表達(dá)那些蛋白。轉(zhuǎn)染的兩個 Ramos細(xì)胞系分別產(chǎn)生mlgE. FcIJ或mIgE. Fe s,mIgE. FcIJ或mIgE. Fc 5兩者都能與其天然輔助 受體形成復(fù)合物。為了研宄抗CemX mAb與天然CemX的結(jié)合,將表達(dá)mlgE. Fc^gmIgE. CHO或Ramos細(xì)胞以10 7個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于FACS緩沖液[PBS、1 % FBS、 0. 1%疊氮化鈉和2mM EDTA(pH 8. 0)]中。然后將IO6個細(xì)胞與100 μ 1雜交瘤上清液在冰 上孵育30分鐘,隨后用FACS緩沖液洗滌。通過與對鼠 IgG具有特異性的FITC標(biāo)記的兔 F (ab')2片段在(AbD Secrotec)冰上孵育30分鐘來檢測結(jié)合抗體,隨后在分析之前用FACS 緩沖液洗滌兩次。用FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實驗,并 用FCSExpress軟件(De Novo Software)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)所有C ε mX特異性單克隆抗體均 不與表達(dá)mlgE. CHO和Ramos細(xì)胞結(jié)合。發(fā)現(xiàn)所有C ε mX特異性單克隆抗體均與表達(dá) mlgEd^ CHO細(xì)胞結(jié)合。然而,只有4B12和26H2能與表達(dá)mlgE. Fc ^的Ramos細(xì)胞結(jié)合,而 所有其他C ε mX特異性單克隆抗體都不能與表達(dá)mlgE. Fq的Ramos細(xì)胞結(jié)合(圖2)。
[0020] 實施例3 :4B12和26H2針對表達(dá)mlgE的B細(xì)胞誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性
[0021] 為了研宄嵌合抗C ε mX mAb的ADCC活性,我們使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為靶 向表達(dá)mlgE· Fcdtl Ramos 細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。通過在 Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)密 度梯度上離心從健康供體(Taiwan Blood Service Foundation)的淡黃色層(buffy coat) 純化PBMC,并冷凍保存在 90% FBS/10% DMSO(Hybri-Max?;Sigma-Aldrich)中。使用之前, 使PBMC解凍,并以2X IO6個細(xì)胞/ml在補充有10%熱滅活的FBS和1 %青霉素-鏈霉素 混合物的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen)中過夜培養(yǎng)。為了識別與PBMC共培養(yǎng)的靶細(xì)胞,用含 2. 5 μΜ 5-(和-6)-羧基熒光素二乙酸酯,琥珀酰亞胺酯(CFDA,SE; Invitrogen)在0.1% BSA/PBS中于37°C下將表達(dá)mlgE. Ramos細(xì)胞標(biāo)記10分鐘。在用含10% FBS的冷 RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)洗滌三次之后,將細(xì)胞調(diào)至IO5個細(xì)胞/ml。對于效應(yīng)物-靶標(biāo) (E/T)比滴定,將于200 μ 1完全RPMI培養(yǎng)基中的20, 000個標(biāo)記的細(xì)胞用1 μ g/ml的抗體 在37°C下包被30分鐘,然后以50-3. 125的多個E/T比與等體積的PBMC混合。對于抗體滴 定,將于200 μ 1完全RPMI培養(yǎng)基中的20, 000個標(biāo)記的細(xì)胞用多種濃度(1000~0.0 lng/ ml)的抗體在37°C下調(diào)理30分鐘,然后以25:1的Ε/Τ比與PBMC混合。為了測定抗體非依 賴性殺傷,還將標(biāo)記的靶細(xì)胞在不存在抗體的條件下以給定的E/T比與PBMC -起孵育。在 24小時的孵育結(jié)束時,用2. 5 μ g/ml的7-氨基放線菌素(7-AAD ; Invitrogen)在冰上對死 細(xì)胞染色15分鐘。在Becton Dickinson FACSCanto II流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞。將活的靶 細(xì)胞定義為斑點印跡分析上CFSE-陽性/7-AAD-陰性細(xì)胞的百分比。按照以下公式計算給 定E/T比時的殺傷細(xì)胞的百分比:100X [(抗體非依賴性對照中活靶細(xì)胞的% -樣品中活 靶細(xì)胞的% )/抗體非依賴性對照中活靶細(xì)胞的% ]。在多個E/T比時觀察到c4B12、c26H2 和奧馬珠單抗的ADCC活性。在E/T比為50時,c4B12、c26H2和奧馬珠單抗給出高達(dá)60% 的特異性裂解;相反,ca20的活性較低,僅給出10~20%的特異性裂解(圖3A)。而且,當(dāng) c4B12和c26H2的濃度高于0. 01 μ g/ml時,觀察到顯著的ADCC。在10 μ g/ml的最大劑量 時,c4B12和c26H2對靶細(xì)胞的特異性裂解范圍為80% -90%,而ca20給出高達(dá)50%的特 異性裂解(圖3B)。針對CD20的陽性對照利妥昔單抗和奧馬珠單抗在多個E/T比時,以劑 量響應(yīng)的方式有效誘導(dǎo)ADCC。因此,我們推定,在介導(dǎo)ADCC中,c4B12和c26H2相對于ca20 是更有效的抗C ε mX mAb,并且c4B12和c26H2能有效地招募效應(yīng)細(xì)胞,以在體內(nèi)靶向表達(dá) mlgE的B細(xì)胞。
[0022] 實施例4 :嵌合抗C ε mX mAb誘導(dǎo)表達(dá)膜結(jié)合IgE. Fc1^ Ramos細(xì)胞的凋亡
[0023] 為了檢測磷脂酰絲氨酸(PS)暴露,在完全培養(yǎng)基中,將表達(dá)mlgE. Fq的Ramos細(xì) 胞(5X IO5個細(xì)胞/ml)與指定濃度的嵌合抗CemX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在37°C 下一起孵育1小時。然后用對人IgG Fe片段具有特異性的山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)以 10 μ g/ml 的濃度處理細(xì)胞,并于 37°C 下再孵育 24小時。通過在室溫下黑暗中于200 μ 1膜聯(lián)蛋白緩沖液(Annexin buffer) [IOmM HEPES/ Na0H(pH7. 4)、140mM NaCl、5mM CaCl2]中對細(xì)胞染色15分鐘,評價磷脂酰絲氨酸(PS)暴露 的檢測,所述膜聯(lián)蛋白緩沖液含有以1/200稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白 V(BioVision)和 2. 5 μ g/ml 的碘化丙啶(PI, Sigma-Aldrich)。在 FACSCanto II 流式細(xì)胞 儀上分析細(xì)胞。將凋亡的細(xì)胞定義為斑點印跡分析上膜聯(lián)蛋白V-陽性/PI-陰性細(xì)胞的百 分比。隨著c4B12、c26H2或奧馬珠單抗?jié)舛鹊脑黾樱蠹s80%表達(dá)mlgE. Ramos細(xì)胞 通過凋亡而死亡,同時在1 μ g/ml時具有最大誘導(dǎo),但ca20不是這樣(圖4A)。
[0024] 為了檢測凋亡的細(xì)胞核,將表達(dá)mlgE· Fc^ Ramos細(xì)胞(5X10 5個細(xì)胞/ml)與 1 μ g/ml濃度的嵌合抗C ε mX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在完全培養(yǎng)基中在37°C下一起 孵育1小時。然后用對人IgG Fc片段具有特異性的山羊F(ab')2片段以10 μ g/ml的終濃 度處理細(xì)胞,并于37°C下再孵育48小時。將5X IO5個細(xì)胞在冰上黑暗中于0. 5ml的碘化 丙啶(PI)/Triton 溶液(含 0· 1 %檸檬酸鈉、0· 1% Triton X-100、15 μ g/ml PI 和 IOOyg/ ml RNase A的PBS;所有的都來自Sigma-Aldrich)中孵育1小時。在FACSCanto II流式 細(xì)胞儀上測定PI熒光。將完整細(xì)胞核中的DNA含量記錄在線性標(biāo)尺上。將在通道中發(fā)出 的熒光低于G0/G1峰的含有亞二倍體DNA的凋亡細(xì)胞核計算成總?cè)后w的百分比。在c4B12、 c26H2或奧馬珠單抗所處理的表達(dá)mlgE. Ramos細(xì)胞中,觀察到具有亞二倍體DNA的 細(xì)胞群顯著增加(圖4B)。
[0025] 為了檢測半胱天冬酶3 (caspase 3)和聚(ADP-核糖)聚